Summary
I denne artikel beskriver vi i detaljer en protokol for generation af neurosfærekulturer fra postnatale museneurale stamceller fra de primære neurogene nicher. Neurosfærer bruges til at identificere neurale stamceller fra hjernevæv tillader estimering af prækursorcelletal. Desuden kan disse 3D-strukturer være belagt under forskellige forhold, hvilket giver anledning til neuroner, oligodendrocytter og astrocytter, så studiet af celleskæbne.
Abstract
Neurosfæren assay er en yderst nyttig in vitro teknik til at studere de iboende egenskaber af neurale stamceller / progenitor celler (NSPCs), herunder spredning, selvfornyelse og multipotency. I den postnatale og voksne hjerne er NSP'er hovedsageligt til stede i to neurogene nicher: den subventrikulære zone (SVZ), der forede de laterale ventrikler og den subgranulære zone i hippocampal dentate gyrus (GD). Isoleringen af de neurogene nicher fra postnatal hjerne gør det muligt at opnå en højere mængde nSPCs i kultur med en deraf følgende fordel af højere udbytter. Den tætte kontakt mellem celler inden for hver neurosfære skaber et mikromiljø, der kan ligne neurogene nicher. Her beskriver vi i detaljer, hvordan man genererer SVZ- og DG-afledte neurosfærekulturer fra 1-3-dages gamle (P1-3) mus, samt passaging, til neurosfæreekspansion. Dette er en fordelagtig tilgang, da neurosfæren assay giver mulighed for en hurtig generation af NSPC kloner (6−12 dage) og bidrager til en betydelig reduktion i antallet af brug af dyr. Ved plating neurosfærer i differentierende betingelser, kan vi få en pseudomonolayer af celler, der består af NSPCs og differentierede celler af forskellige neurale slægter (neuroner, astrocytter og oligodendrocytes) giver mulighed for undersøgelse af handlinger iboende eller ydre faktorer på NSPC spredning, differentiering, celle overlevelse og neuritogenese.
Introduction
Neurosfæren assay (NSA) blev først beskrevet i 19921,2 og stadig et unikt og kraftfuldt værktøj i neurale stamceller (NSC) forskning. Isoleringen af nscs fra de vigtigste neurogene regioner har udfordrende problemer, fordi kravene til at opretholde disse celler under fysiologiske forhold fortsat er dårligt forstået. I NSA dyrkes cellerne i et kemisk defineret serumfrit medium med tilstedeværelse af vækstfaktorer, herunder den epidermale vækstfaktor (EGF) og den grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF)1,2,3. Neurale prækursorceller (stamceller og stamafske) vælges ved hjælp af disse mitogener, da disse celler er EGF og FGF-responsive ind i en periode med aktiv spredning, mens andre celler, nemlig differentierede celler, dør4. Neurale prækursorceller vokser som neurosfærer, som derefter kan passages for yderligere at udvide puljen af disse celler5. Vigtigere, da disse neurale stamceller progenitor celler (NSPCs) er multipotente de er i stand til at differentiere ind i de tre store celletyper af centralnervesystemet (CNS): neuroner, oligodendrocytes og astrocytter5.
NSA giver en vedvarende kilde til udifferentierede CNS prækursorer, som kan bruges til at studere flere processer, herunder NSC spredning og selvfornyelse, og neuronal og glial differentiering, i både fysiologisk og sygdom sammenhæng. Desuden kan in vitro-undersøgelser bruges til at vurdere graden af iboende specifikation til stede i neurale prækursorer under udviklingen, samt at studere det fulde potentiale af cellerne, ved at fjerne ydre signaler forbundet med deres normale miljø6. Neurosfæremodellen er værdifuld til at evaluere formodede regulatorer, da ved at opretholde cellerne i et medium uden serum, de miljømæssige signaler er kun leveret af de omkringliggende celler6. Desuden er i NSA, NSPCs let udvides i kultur, tætheden af celler pr område er høj, og den heterogene sammensætning af neurosfærer har en vis lighed med in vivo nicher6. Disse veletablerede fordele er grunden til, at denne metode er blevet udbredt af mange forskere.
Følgende protokol beskriver i detaljer alle processer fra isolering af postnatal NSPC-population fra de to vigtigste neurogene regioner, subventrikulær zone (SVZ) og hippocampal dentate gyrus (DG), til udvidelse af disse celler som neurosfærer, samt til differentiering i neuroner, astrocytter og oligodendrocytes. Endelig beskrives der også forskellige analyser for at få adgang til stængelogens egenskaber for SVZ- og DG-afledte NSP'er.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs (86/609/EØF; 2010/63/EU; 2012/707/EU) og den portugisiske (DL 113/2013) lovgivning om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Protokollen blev godkendt af "iMM's institutionelle dyrevelfærdsorgan - ORBEA-iMM og den nationale kompetente myndighed - DGAV (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária)."
1. Grundlæggende opsætning og forberedelse af kulturmedium
- På dissektionsdagen fremstilles den passende mængde vækstmedium svarende til serumfrit medium (SFM), der består af Dulbeccos modificerede ørnemedium [(DMEM)/F12 med L-glutamin] (Materialetabel)suppleret med 100 U/ml penicillin og 100 μg/mL streptomycin (pen/strep), 1% B27 med også 10 NG/mL EGF og 5 ng/mL bFGF. Varm kulturmediet til 37 °C i et vandbad.
BEMÆRK: Vækstmediets volumen afhænger af antallet af unger, for 5 unger tilbereder ~100 ml (50 ml for SVZ og 50 ml for GD); Efter at have talt antallet af celler (trin 5.1) skal den nøjagtige volumen dog justeres. - Til mikrodissektion af SVZ og DG fremstilles det calcium- og magnesiumfrie Hanks' afbalancerede saltvandsopløsning (HBSS) dissektionsmedium suppleret med 100 U/ml pen/strep.
BEMÆRK: Klargør 50−100 ml dissektionsmedium. - Opret et dissektionsmikroskop, og forbered de nødvendige værktøjer til at fjerne hjernen (saks og lille spatel) og til SVZ og DG mikrodissektioner (Dumont små saks, #7 pincet, #5 pincet, #5S pincet) ved at dyppe i 70% ethanol.
2. Høst af postnatale (P1-3) musehjerner og SVZ/Dg mikrodissektioner
- Der tilberedes 60 mm petriskåle (vækstareal 21 cm2)med HBSS suppleret med pen/strep og 2 prøverør (en til SVZ og en til DG) med 500 μL suppleret HBSS hver.
- Euthanize mus hvalpe (P1-3) i henhold til protokollen godkendt af Institutional Animal Care facilitet / retningslinjer. Udfør halshugning med et enkelt snit med en skarp saks i bunden af hjernestammen.
- Hold ventrale del af kroppen i bunden af hovedet og ved hjælp af små spidse saks, lave en midterlinje snit i huden over hele længden af hovedet, og dermed afslører overfladen af kraniet.
- Lav et langsgående snit i bunden af kraniet og fortsæt med at skære langs sagittal sutur ved hjælp af små saks med en vinkel lavvandet som muligt for at undgå at beskadige hjernenstrukturer.
- Skræl kraniet til siderne ved hjælp af buede pincet og udsætte hjernen.
FORSIGTIG: Sørg for, at dissekeringsinstrumenterne er fri for ethanol, før du rører hjernen. - Isolere hjernen fra kraniet ved hjælp af en lille spatel, ved at glide under bunden af hjernen til at skære kranienerver og blodkar, der er forbundet til bunden af hjernen, og overføre hjernen til en petriskål indeholdende kold suppleret HBSS løsning.
- Placer petriskålen, der indeholder hjernen under et dissekeret mikroskop ved lav forstørrelse, og placer hjernen på dens rygoverflade.
- Brug fine pincet, fjerne meninges fra ventrale side af hjernen og olfaktoriske pærer, mens du holder hjernen på plads af lillehjernen. Rotere hjernen på ventrale aspekt og skalle resten af meninges.
BEMÆRK: Fjernelse af dorsale meninges er et afgørende skridt for at sikre korrekt hjerneudskæring. - Kassér lillehjernen gør et snit ved hjælp af pincet. Placer et filterpapir med en porestørrelse på 11 μm på envævshakker( Materialebord ) og sæt hjernen på filterpapiret ved hjælp af buede spidse pincet. Hak hjernen i 450 μm koronale sektioner og bruge en våd lamina til at indsamle den opdelte hjerne i en ny petriskål fyldt med kold suppleret HBSS.
- For at dissekere SVZ, bruge pincet til at adskille koronale skiver i en foran-til-posterior måde, indtil de når skiver med de laterale ventrikler, under en dissekere mikroskop.
- Skær det tynde lag af væv omkring ventriklernes laterale væg (hvilket svarer til SVZ) med fine pincet, bortset fra striatal parenkym og corpus callosum. Isoler SVZ ved at placere spidsen af pincet i de laterale hjørner af den laterale ventrikel: den ene umiddelbart under corpus callosum og den anden ind i vævet umiddelbart støder op til ventrale område af den laterale ventrikel. Derefter skæres en lille linje af væv omkring den laterale ventrikel.
- Det dissekerede væv samles i et prøverør med suppleret HBSS-opløsning, der tidligere er identificeret som SVZ.
BEMÆRK: Udeluk SVZ i skiver, hvor både de laterale ventrikler og hippocampal formation begynder at dukke op. - Gå gennem alle skiver efter SVZ microdissection i en foran-til-posterior mode og nå hippocampal dannelse. Brug pincet kassere den første skive med hippocampus, hvor DG er stadig uigenkendelig.
- For at fjerne DG skal du først isolere hippocampus fra skiverne. Fokuser mikroskopet igen for at visualisere grænserne omkring GD.
- Dissekerer GD-delen ved at foretage en nedskæring mellem Generaldirektoratet og CA1-regionen efterfulgt af en vertikal nedskæring mellem GD og CA3-regionen ved hjælp af pincet. Fjern fimbria og tilstødende væv.
BEMÆRK: Hos P1-3 dyr kan GD næsten ikke skelnes fra Ammons horn, men viser et lille tip. - Det dissekerede væv indsamles i et prøverør indeholdende supplerede HBSS-opløsninger, der tidligere er identificeret som GD.
BEMÆRK: Samlet skade på hippocampus eller det omkringliggende område vil gøre det vanskeligere at isolere GENERALDIREKTORATET. Ved hjælp af et atlas over den postnatale mus hjernen er afgørende, når brugeren ikke er fortrolig med isolering af SVZ og DG væv fra koronale sektioner.
3. Vævsdissociation
- For at adskille SVZ- og DG-vævet i deres respektive rør tilsættes trypsin-EDTA 0,05% for at have en endelig koncentration på 5−10% af Trypsin-EDTA 0,05% i HBSS. Der inkuberes i ca. 15 minutter ved 37 °C, indtil vævet er klumpet sammen.
- Vask vævet fra trypsin ved at fjerne mediet og tilføje 1 ml ny HBSS suppleret opløsning i 4 på hinanden følgende gange.
- HbSS fjernes, og det fordøjede væv suspenderes igen i 1 ml SFM suppleret med 10 NG/ml EGF og 5 ng/mL bFGF. Mekanisk adskille pellet ved forsigtigt pipettere op og ned ca 7−10x ved hjælp af en P1000 pipette, indtil du får en homogen celleopløsning.
FORSIGTIG: Overdreven mekanisk dissociation kan føre til øget celledød og vil have en negativ indvirkning på efterfølgende cellevækst.
4. Cell-pair assay at studere celle skæbne
- Før forsøget forberedes belagte 24-brøndsplader til klæbende monolayerkulturer i henhold til afsnit 8-10.
- For at tælle antallet af SVZ- eller DG-celler (anskaffet i afsnit 3), der skal indpladeeres, skal der anvendes en opløsning, der indeholder 0,2 % Trypanblå, og cellerne tælles med et hæmatocytometer.
- Fortynd den dissocieret cellesuspension i SFM suppleret med 5 NG/ml EGF og 2.5 ng/mL bFGF (lav EGF/bFGF) ved en massefylde på 11.300 celler/cm2 og plade dem på belagtglas dæksel.
- Efter 24 timer, fastsætte cellerne for immuncytokemi mod NSC markører såsom køn bestemmelse region Y-box 2 (Sox2) og nestin samt med en markør for neuronal afstamning (nemlig doublecortin [DCX], for umodne neuroner) (se afsnit 14).
BEMÆRK: Sox2 er en markør for NSCs, der gennemgår mitose. Sox2+/+ cellepar som følge af en enkelt progenitorcelledeling afspejler stamcelleudvidelse7.
5. Udvidelse af postnatale neurale stamceller som neurosfærer
- For at bestemme tætheden af den dissocieret SVZ- eller DG-cellesuspension (opnået i afsnit 3) tælles cellerne ved hjælp af et hæmatocytometer.
- Fortynd SVZ og DG enkeltcellesuspension ved en massefylde på 2 x 104 celler/ml i SFM suppleret med 10 NG/ml EGF og 5 ng/mL bFGF. Frø SVZ og DG celler i ubestrøget 60 mm Petriskåle med et endeligt volumen på 5 ml/petriskål.
- Inkuber SVZ og DG-celler i henholdsvis 6-8 dage og 10-12 dage for at danne primære neurosfærer ved 37 °C med 5% CO2.
BEMÆRK: Inkubation dage mere end de nævnte kan fremme sammenlægning af neurosfærer og højere niveauer af celledød i midten af neurosfæren. - Når størstedelen af neurosfærerne har en diameter på 150−200 μm, udføres neurosfærepassagen.
BEMÆRK: Passaging neurosfærer, når de ikke har en passende diameter kompromitterer alle de næste skridt.
6. Passaging af neurosfærer
BEMÆRK: Følgende protokol kan anvendes til at udvide både SVZ og DG neurosfærer.
- Til passage neurosfærer, indsamle SFM med vækstfaktorer, der indeholder neurosfærer fra 60 mm Petri skål (r) og centrifugei 5 min ved 300 x g.
- Supernatanten kasseres, og neurosfæren slæmes igen ved hjælp af et kemisk dissociationssæt (mus) i henhold til producentens anvisninger (Materialetabel).
BEMÆRK: Overhold inkubationstiderne præcist, da de er afgørende for ydeevnen. - Der centrifugeres i 5 min ved 300 x g, supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml SFM suppleret med 10 NG/mL EGF og 5 ng/mL bFGF.
- Triturate op og ned ca 10x med en P1000 pipette til at adskille neurosfærer.
- Tæl antallet af celler ved hjælp af en opløsning, der indeholder 0,2% Trypan blå og et hæmatocytometer.
- Genfrø celler med en massefylde på 2 x 104 celler/ml i ubestrøget 60 mm petriskåle.
- Inkuber SVZ og DG-celler i henholdsvis 6-8 dage og 10-12 dage for at opnå sekundære neurosfærer ved 37 °C med 5% CO2.
BEMÆRK: Der er adgang til svZ- og GD-afledte NSP'ers selvfornyelseskapacitet ved hjælp af protokolafsnit 5 og 6. Til dette formål, frø SVZ og DG celler med en massefylde på 1,0 x 104 celler / ml (i ubestrøget 24-brønd plader) i vækst SFM medium, der indeholder 5 NG/mL EGF og 2,5 ng/mL bFGF (lav EGF / bFGF). Tæl antallet af resulterende primære og sekundære neurosfærer.
7. Opbevaring af neurosfærer
- Mediet med neurosfærer (fra trin 5.3 og 6.7) opsamles fra 60 mm Petriskåle.
- Der centrifugeres i 5 min ved 300 x g, og supernatanten kasseres.
- Cellerne vaskes 2x med 1 ml HBSS (5 min ved 300 x g).
- Der centrifugeres i 5 min ved 300 x g, supernatanten kasseres, og neurosfærens pellet opbevares ved -20 °C til molekylærbiologisk analyse.
8. PDL belægning plade procedure
- For at klargøre opløsning 1 (0,1 M boratbuffer) vejes 3,92 g borsyre og fortyndes i 400 ml vand med høj renhed. PH-værdien justeres til 8,2 og fyldes op til 500 ml med vand med høj renhed.
- For at klargøre opløsning 2 (0,167 M boratbuffer) vejes 10,3 g borsyre og fortyndes i 900 ml vand med høj renhed. PH-værdien justeres til 8,2 og fyldes op til 1.000 ml med vand med høj renhed.
- For at rekonstituere poli-D-lysin (PDL) (1 mg/ml i 0,1 M boratbuffer) fortyndes 100 mg PDL i 100 ml opløsning 1.
- Der skal laves prøver på 10 ml, som skal bruges med det samme, eller fryses og opbevares ved -20 °C.
- Under laminar flow, tilsæt 1 coverslip per godt og sterilisere under UV-lys i 15 min.
- Brug den rekonstituerede PDL eller optø frosne rekonstituerede PDL.
- Den endelige opløsning på 100 μg/ml PDL fremstilles i 0,167 M boratbuffer ved tilsætning af 10 ml rekonstitueret PDL til 90 ml opløsning 2.
- Den endelige opløsning tilsættes i brønde i mindst 2 timer natten over ved 37 °C.
BEMÆRK: For 24-brøndsplader tilsættes et volumen på 500 μL i hver brønd. - Fjern opløsningen og vask 3x med vand med høj renhed.
- Lad dæktrækket tørre i laminar flow hætte.
- Lad multibrøndskulturpladerne være ved 4 °C.
9. PDL/Laminin belægning plade procedure
- På dag 1, pels pladerne med PDL som beskrevet i afsnit 8.
- Fjern PDL-opløsningen på dag 2, og 3x vaskes med vand med høj renhed. Lad tørre.
- Der fremstilles 5 μg/ml laminin i kold SFM uden vækstfaktorer.
- Der tilsættes opløst laminin til dækslips og inkuberes ved 37 °C natten over.
BEMÆRK: For 24-brøndsplader tilsættes et volumen på 500 μL i hver brønd. - Fjern laminin ved hjælp af en pipette.
BEMÆRK: Dækslips må ikke vaskes af laminin. - Anvendes straks eller opbevares ved -20 °C.
10. Poly-L-ornithin (PLO) /lamininbelægningsprocedure
- Under laminar flow, tilsæt en coverslip per godt og sterilisere under UV-lys i 15 min.
- Der tilsættes 0,01% PLO-opløsning til hver brønd i 20 min ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: For 24-brøndsplader tilsættes et volumen på 500 μL i hver brønd. - Opløsningen fjernes, og 3x vaskes med steriliseret 1x PBS. Lad tørre.
- Der fremstilles 5 μg/ml laminin i steril 1x PBS.
- Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
- Fjern laminin.
BEMÆRK: Dækslips må ikke vaskes af laminin. - Brug med det samme.
BEMÆRK: Sørg for, at dæksellen er fuldt dækket af PLO-opløsningen ved forsigtigt at trykke på dækselstrækket med en pipettespids. Når de rystes, bør multi-well plader gøre nogen lyd.
11. Evaluering af neuritogenese ved at skabe et differentieret monolag af celler
- Mediet, der indeholder neurosfærer, indsamles fra 60 mm petriskåle (fremstillet af sektion 5) og centrifugeres i 5 min ved 300 x g ved RT.
- Supernatanten afsmides, og pelletsen af neurosfærer adskilles i 1 ml dissociation PBS (dvs. PBS uden Mg2+/Ca2+ og med EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4,137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 og 0,5 mM EDTA 4Na, ved pH = 7,40]) ved inkubering i 15 min efterfulgt af mekanisk dissociation. Alternativt kan adskille neurosfærer ved hjælp af en kemisk dissociation kit (mus) (Tabel af materialer).
- Der centrifugeres i 5 min ved 300 x g ved RT, og supernatanten kasseres.
- Resuspender cellepellet i 1 ml SFM uden vækstfaktorer.
- Bestem celletætheden ved hjælp af et hæmatocytometer.
- Den dissocierede cellesuspension fortyndes i SFM uden vækstfaktorer med en massefylde på 3.766 celler/cm2 og pladeceller på belagte glasdækselier i 24-brøndsplader.
- Efter 1-3 dage skal cellerne rettes mod et protein i cytoskelettet (se afsnit 14).
12. Differentiering af neurosfærekulturer
BEMÆRK: Neurosfærer fremstillet af celleudvidelse, enten fra primære eller passagede neurosfærer (opnået i afsnit 5 eller 6) kan differentieres i celler fra forskellige neurale slægter.
- Når neurosfærer har en diameter på 150−200 μm, indsamles 25 μL neurosfæresuspensionsmedium og plade på belagte glasdækslips i 24-brøndsplader.
BEMÆRK: For at indsamle flere neurosfærer skal du forsigtigt rotere petriskålen for at koncentrere neurosfærerne i midten. Derefter pipette fra midten. - Pladerne anbringes i en kuvøse ved 37 °C i 15 minutter, så neurosfærerne klæber til underlaget. Derefter tilsættes 500 μL SFM uden vækstfaktorer (differentierede betingelser).
- Efter 24 timer udskiftes mediet med frisk SFM uden vækstfaktorer.
- Differentiere for forskellige tidspunkter (f.eks. 2 og 7 dage in vitro, DIV2 og DIV7) med 5% CO2 og 95% atmosfærisk luft ved 37 °C.
BEMÆRK: Celleoverlevelse, spredning og differentiering kan analyseres ved hjælp af forskellige celleanalyser.
13. Cellebiologi assays
- Celle overlevelse assay
- De belagte neurosfærer eksponeres for 3 μg/ml propidiumiodid (PI) i 30 min. før cellefiksering i rugemaskinen ved 37 °C.
BEMÆRK: PI er et autofluorescerende middel, der kun er i stand til at trænge ind i celler med kompromitteret membranintegritet8. Andre metoder til analyse af celle overlevelse kan anvendes såsom caspase 3 farvning eller terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end mærkning (TUNEL) assay.
- De belagte neurosfærer eksponeres for 3 μg/ml propidiumiodid (PI) i 30 min. før cellefiksering i rugemaskinen ved 37 °C.
- Cellespredning assay
- Debelagte neurosfærer eksponeres for 10 μM 5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) i 4 timer før fiksering i rugemaskinen ved 37 °C.
BEMÆRK: BrdU er en syntetisk thymidinanalog, der kan inkorporeres under DNA-syntese i proliferating cells9.
- Debelagte neurosfærer eksponeres for 10 μM 5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) i 4 timer før fiksering i rugemaskinen ved 37 °C.
- Celledifferentieringsanalyse
- De 7 dage gamle belagte neurosfærer udsættes for 10 μM BrdU i de første 24 timer i rugemaskinen ved 37 °C.
- Forny SFM blottet for vækstfaktorer (differentierende betingelser) og tillade celler at udvikle i mangel af BrdU for de følgende 6 dage indtil fiksering.
BEMÆRK: Disse puls-chase eksperimenter, ved co-mærkning med markører for modne neurale celler, giver mulighed for evaluering af progenitor celler, der differentierer sig til modne celler under protokollen.
14. Immunfarvning af neurosfærekulturer
- Cellefiksering
- Der fremstilles 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS og opbevares ved 4 °C eller -20 °C.
- SFM uden vækstfaktorer fjernes fra brøndene, og der til hver brønd tilsættes 500 μL 4% PFA ved 4 °C i 20 min. ved RT.
- Der vaskes 3x med 1x PBS i 5 min. hver gang, og de dækslips, der indeholder differentierede neurosfærer.
- Dækslips opbevares indtil brug i 500 μL 1x PBS ved 4 °C.
BEMÆRK: Hvis eksperimentet ikke har BrdU, skal du gå videre til trin 14.3.
- Denatureringsmetode (kun for BrdU-forsøg)
- Der fremstilles 1 M HCl ved 37 °C.
- Skyl dæksel 3x i 1x PBS.
- Permeabilisere celler i 30 min i PBS indeholdende 1% nonionisk overfladeaktivt stof (f.eks. Triton X-100).
- DenaturedsDNA med 1 M HCl forvarmet til 37 °C i 30-40 min ved 37 °C (~300 μL/brønd).
- Vask brønde 4x med 1x PBS.
- Permeabilisering og blokering
- Skyl dækslips i 1x PBS i 5 min.
- Inkuber i 1,5 timer med 0,5% nonionisk overfladeaktivt stof og 3% kvægserumalbumin (BSA) i 1x PBS (~300 μL/well).
BEMÆRK: For NeuN skal du bruge 6% BSA i 1x PBS.
- Inkubation og montering
- På dag 1, uden vask, inkubere celler med primære antistoffer (Materialetabel) i 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof og 0,3% BSA i 1x PBS i inkubationskammeret (for 24-brøndplader bruge 20 μL/well). Dækslips, der inkuberer natten over ved 4 °C lys, beskyttes, hvis antistoffer konjugeres til en fluorophore.
- På dag 2, retur dækslips til deres respektive brønde og skyl 3x i 1x PBS i 5 min.
- Counterstain med passende fluorescenskonjugerede sekundære antistoffer (fortynding 1:200) og med 12 μg/ml Hoechst 33342 i 1x PBS i 2 timer ved RT og lys beskyttet i inkubationskammeret (20 μL/coverslip).
- Dæksel glider 3x i 1x PBS i 5 min.
- Monter dæksel på mikroskopobjektglas ved hjælp af 5 μL/coverslip af fluorescensmonteringsmedium.
- Lad dæksel glideluft tørre på RT, beskyttet mod lys, i 1 dag.
- Mikroskopi
- Se og anskaffe billeder ved hjælp af en fluorescens mikroskop.
- For hver betingelse skal du bruge tre replikater. Udfør celletal i fem uafhængige mikroskopiske felter i hver coverslip med en 40x-målsætning (~100 celler pr. felt).
15. Udarbejdelse af EGF- og bFGF-stamopløsninger
- EGF-aktieløsning
- For at rekonstituere fryseret EGF fortyndes produktet i vand med høj renhed for at nå en endelig koncentration på 20 μg/ml.
- Aliquot og opbevares i mikrorør ved -5 til -20 °C.
- bFGF lagerløsning
BEMÆRK: bFGF skal rekonstitueres med en opløsning på 10 mM Tris, pH 7.6.- Hætteglasset centrifugeres kortvarigt, før det åbnes, for at indholdet føres til bunds.
- Klargør 50 ml 10 mM Tris, pH 7.6. Til dette vejes 60,57 mg Tris ((HOCH2)3CNH2) og fortyndes i 40 ml vand med høj renhed. PH'en justeres til 7,6 og fyldes op til 50 ml med vand med høj renhed.
- Forbered 10 ml 0,1% BSA i 10 mM Tris, pH 7.6. Til dette, vejes 10 mg BSA og fortyndes i 10 ml 10 mM Tris.
- Filteropløsninger fremstillet i trin 15.2.2 og 15.2.3 med et filter på 0,22 μm under en laminarstrømhætte.
- Rekonstitueres 10 μg bFGF i 1.000 μL på 0,1% BSA i 10 mM Tris med pH 7,6 for at nå en endelig koncentration på 10 μg/ml. Aliquot i mikrorør ved -20 °C i højst 6 måneder.
Representative Results
SVZ og DG neurosfærer, fremstillet ved hjælp af NSA, er sammensat af udifferentierede celler, positive for Sox2, en transskriptionsfaktor involveret i selvfornyelseskapaciteten og positiv for nestin, et mellemfilamentprotein udtrykt i NSPCs (Figur 1A). Desuden har SVZ-afledte neurosfærer større dimensioner end deres modparter i GD (figur 1A). Det er vigtigt, at SVZ- og DG-afledte NSPC'er under forskellige forhold udvandrer ud af neurosfærer, der danner et pseudomonolag af celler (figur 1B).
For at få adgang til selvfornyelseskapaciteten udføres celleparanalysen baseret på udtrykket af Sox2 og nestin, som har tendens til at forsvinde i opdelingen af celler, der starter differentieringsprocessen med en kombination af en markør for den neuronale afstamning nemlig DCX. I begge neurogene områder er det muligt at observere tilstedeværelsen af Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriske divisioner (selvfornyelse) (Figur 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- asymmetriske divisioner (Figur 2A1,B2) og Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetriske divisioner (differentiering) (Figur 2A2,B1).
Passaging neurosfærerne øger udbyttet af NSPCs; celledød ved DIV2 ændres dog med passaging. Faktisk øges procentdelen af PI-positive celler med cellepassage i SVZ (P0: 15,6% ± 1,2% vs P1: 19,2% ± 2,7% vs P2: 32,35% ± 0,14% vs P3: 39,6% ± 4,0%) og i GD (P0: 16,31% ± 0,95% vs P1: 32,1% ± 1,7% vs P2: 27,42% vs P3: 32,2% ± 3,1%) (Figur 3).
Neuritogenese kan vurderes i neuroner, der opnås ved differentiering af SVZ og GD NSPCs i begyndelsen af differentieringen: DIV1 (Figur 4A,D), DIV2 (Figur 4B,E) og DIV3 (Figur 4C,F). Som det er observeret i figur 4, øges længden og forgreningen af neuriterne med differentiering.
Celleproliferation kan evalueres i SVZ- og DG-afledte neurosfærer. Hvis man sammenligner primære differentierede neurosfærer ved DIV1 fra SVZ (Figur 5A1) og GD (Figur 5A2), er procentdelen af BrdU-positive celler højere i SVZ end i GD (SVZ: 6,15 % ± 0,64 % vs. GD: 3,27 % ± 0,13 %; p < 0,05; n = 4; Figur 5A3). Desuden kan celledifferentiering også tilgås ved at kombinere BrdU farvning med en moden maker såsom neuronal kerner (NeuN), der identificerer modne neuroner (Figur 5B1, B2). Figur 5B3 viser, at procentdelen af prolifererende sogenitorer, der skelner til modne neuroner, er den samme i SVZ og GD (SVZ: 12,04% ± 1,58% vs. GD: 13,56% ± 0,48%; p > 0,05; n = 4).
Der er adgang til stilken og multistyrken af SVZ- og DG-afledte NSP'er ved hjælp af NSA ved at evaluere udtrykket af forskellige markører på forskellige differentieringsdage (DIV2 og DIV7). Nscs (nestin- og glial fibrillary acidic protein [GFAP]-dobbeltpositive celler) findes faktisk i begge neurogene regioner (figur 6A,G). Disse celler er i stand til at skelne til umodne neuroner (DCX-positive celler) (Figur 6B,H), modne neuroner (NeuN-positive celler) (Figur 6F,L), oligodendrocyte prækursorceller (neuron-glial antigen 2 [NG2] og blodplade-afledt vækstfaktor receptor α [PDGFRα]- positive celler) (Figur 6C,I), modne oligodendrocytter (myelin basisprotein [MBP]-positive celler) (Figur 6E,K) og astrocytter (GFAP-positive celler) (Figur 6D,J).
Forskellige substrater kan bruges til at belægge dæksel til at danne pseudomonolayer af celler under differentierede forhold. Som vist i supplerende figur 1migrerer DG-celler mere , når dækslips har ekstrabelægning med lamin in kombineret med PLO eller PDL end med PDL alene (supplerende figur 1B-H). Når PDL og laminin anvendes sammen som substrater (supplerende figur 1C,G),danner GD-celler faktisk et mere sammenflydende pseudomonolag end SVZ-celler, for hvilke PDL anvendes alene (supplerende figur 1A,E).
Det er vigtigt, at disse resultater viser NSA's potentiale til at vurdere stamcellerog multipotency egenskaber nscs stammer fra de to vigtigste neurogene nicher.
Figur 1: Subventrikulær zone og dentitet gyrus afledt NSPC dyrket som neurosfærer eller som pseudomonolayers. (A) Repræsentant brightfield (A1,A3) og fluorescens (A2,A4) billeder af SVZ- og DG-afledte neurosfærer, hvor kerner blev farves med Hoechst 33342 (blå) og NSCs for Sox2 (grøn) og nestin (rød). (B) Repræsentative brightfield billeder af pseudomonolayers genereret fra SVZ- og DG-afledte neurosfærer under differentierede forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Celleparassayet. Repræsentative fluorescensbilleder af cellepar, der er afledt af en stamcelledeling. SVZ og DG kerner blev plettet med Hoechst 33342 (blå), stamceller-lignende celler til Sox2 (rød) og nestin (hvid) samt umodne neuroner med DCX (grøn). Pilespidser i paneler A1 og B1 angiver Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriske selvfornyende divisioner, pile i paneler A1 og B2 angiver Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+ asymmetriske divisioner, stiplede linjepile i panelerne A2 og B1 viser Sox2-/-/nestin-/- /-/DCX+/++ symmetriske differentierende divisioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Celleoverlevelsesanalyse med cellepassage. Kvantitativ analyse af PI-positive celler ved DIV2 i SVZ- og DG-afledt differentieret neurosfærekultur efter 0, 1, 2 og 3 passager (P0−P3). Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM, n = 1-8. PI = propidiumiodid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Neuritogenese analyse på DIV 1, 2 og 3. Repræsentative konfokale fluorescensbilleder af neuriter, identificeret ved βIII-tubulinsignalet, i SVZ og DG neuroner ved (A,D) DIV1, (B, E) DIV2 og (C,F) DIV3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Celleproliferationsanalyse. Repræsentative konfokale billeder af BrdU-positive celler ved DIV1 i (A1) SVZ og(A2)DG. (A3) Kvantitativ analyse af BrdU-positive celler ved DIV1 i gd- og SVZ-afledt differentieret neurosfærekultur. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM, n = 4. *p < 0,05 ved t-test. Repræsentative fluorescensbilleder af BrdU- og NeuN-positive celler ved DIV7 i (B1) SVZ og(B2)DG. Pilespidser angiver BrdU-/NeuN-positive celler. (B3) Kvantitativ analyse af BrdU-/NeuN-positive celler ved DIV7 i begge nicher. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridin, syntetisk thymidin analog. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Neurale celletyper til stede i SVZ- og DG-afledt differentieret neurosfærekultur. Repræsentative fluorescensbilleder af SVZ- og DG-afledte celletyper efter 2 og 7 dages neurosfæredifferentiering (DIV2 og DIV7), hvor cellekerner blev farves med Hoechst 33342 (blå) og: (A,G) NSCs for GFAP (grøn) og nestin (rød),(B,H) umoden neuron for DCX (grøn),(C,I) oligodendrocyte prækursorceller til PDGFRα (grøn) og NG2 (rød),(D,J) astrocytter til GFAP (grøn), (E,K) modne oligodendrocytes for MBP (grøn), og (F, L) modne neuroner for NeuN (rød). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Test af forskellige substrater for neurosfærens vedhæftning og migration for at danne et pseudomonolayer. Repræsentative fluorescensbilleder af (A,E) SVZ-afledte pseudomonolayer, der anvender poly-D-lysin som substrat (B,F) DG-afledte pseudomonolayer, der anvender poly-D-lysin som substrat, (C,G) GD-afledt pseudomonolayer ved hjælp af poly-D-lysin med laminin som substrat, og (D,H) pseudomonolag, der anvender poly-D-lysin med poly-L-ornithin som substrat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
In vitro-systemer af NSPCs giver en bedre forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, som kan valideres yderligere in vivo. NSA er en meget kraftfuld metode til at efterligne fysiologiske forhold på grund af deres tre-dimensionelle struktur. Desuden er dette kultursystem også teknisk lettere at kultur10, sammenlignet med andre in vitro-systemer såsom monolayer kultur system. Faktisk, med NSA, er det let at styre de eksponerede ydre signaler under celleudvikling, enten under ekspansion eller differentiering fase, ved at tilføje præcise og variable mængder af faktorer af interesse for medierne samt ved dyrkning neurosfærer med andre celletyper6. Sammenlignet med monolagskulturer er det desuden muligt at opnå en højere celletæthed fra en lille mængde væv eller med et lille antal celler, hvilket gør det muligt at udføre parallelle undersøgelser, hvilket reducerer antallet af dyr1.
NSA er den mest almindelige metode til at isolere og udvide NSCs11,,12,13, kan bruges til at vurdere antallet af prækursorceller til stede i en given vævsprøve5 og prækursorcellefrekvensen mellem forskellige betingelser. Men både neurosfærer og monolayer kulturer ikke tegner sig for quiescence NSCs14. Desuden NSA har nogle begrænsninger11,12,13 og den deraf følgende neurosfære frekvens afhænger af mange faktorer, herunder de mellemstore komponenter, dissektion procedure, dissociation proces11,12,13, og neurosfæren sammenlægning5. Faktisk, i en high-density kultur, neurosfærer tendens til at samle. Der skal derfor udvises forsigtighed ved vurdering af antallet af prækursorceller i en prøve. For at overvinde ovennævnte begrænsninger kan isolerede NSPC'er også udvides og omringes i et monolag5,15. Det er vigtigt at bruge NSA til at sammenligne prækursorcellefrekvens mellem forskellige betingelser er meget nyttigt og præcist, fordi alle disse begrænsninger er implicitte og ens blandt alle forhold, der udføres i det samme eksperiment.
Der er kritiske trin i neurosfæren kultur, der kræver opmærksomhed. I hjernen høst trin, fuldstændig fjernelse af meninges og god isolering af neurogene nicher er afgørende for at maksimere renheden og udbyttet af NSPCs. Under vævdissociation, på grund af proteolytisk aktivitet af trypsin, overdreven brug af trypsin eller længere inkubationstider kan føre til celle lysis. Desuden er dagen for passagen afgørende for at opnå en sund population af neurosfærer. Passaging neurosfærer med en diameter højere end 200 μm i høj grad påvirker levedygtighed, spredning og differentierende kapacitet NSPCs. Vigtigere, længere cyklusser af passager, mere end 10 kan øge genetisk ustabilitet6. Desuden er belægning med PDL og PLD/laminin til henholdsvis SVZ og DG-celler afgørende for at sikre god cellemigration ud af neurosfærerne uden at gå på kompromis med differentieringsprocessen. Med hensyn til immunocytokemianalyse kan længere inkubationstider med PFA kompromittere farvning ved at maskere antigenerne og øge baggrunden.
NSA er et kraftfuldt værktøj til at give en konsekvent og en ubegrænset kilde til NSPCs for in vitro undersøgelser af neurale udvikling og differentiering samt til terapeutiske formål16,17. Faktisk kan denne analyse anvendes på genetiske og adfærdsmæssige modeller for yderligere at forstå de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i NSPC spredning og differentiering18,19. Denne analyse er også nyttigt at teste forskellige lægemidler og forbindelser20,21,22 samt at udføre genetiske manipulationer19,23 at modulere NSC egenskaber. Ud over immuncytokemi kan der udføres omvendt transskriptionspolymerasekædereaktion og vestlig blotanalyse for at få adgang til RNA og proteinekspression, mens elektrofysiologiske undersøgelser og calciumbilleddannelse kan bruges til at evaluere funktionen af de nyfødte neuroner21.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af IF/01227/2015 og UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) og R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) modtog et stipendium fra FCT. Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af bioimaging facilitet på Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes for mikroskopi bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| 12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
| Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | Life Technologies | A11039 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
| Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
| Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
| Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
| Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
| Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
| Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
| Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
| Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
| Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
| Micro Spatula - 12 cm | FST | 10091-12 | |
| Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
| Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
| NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
| Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
| Phosphate standard solutions, PO43 - in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
| Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |
References
- Reynolds, B., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural Stem Cell Isolation and Characterization. Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).
- Xapelli, S., et al. Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures. PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).
- Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
- Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population. Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).
- Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures. RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain. SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage. PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).
- Khacho, M., et al. Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program. Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).
- Soares, R., et al. Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats. Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).
- Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis. Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin? Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Kim, H. J., et al. Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells. Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).
