Summary
In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich ein Protokoll zur Erzeugung von Neurosphärenkulturen aus postnatalen mausneuronischen Stammzellen, die aus den wichtigsten neurogenen Nischen der Maus abgeleitet sind. Neurosphären werden verwendet, um neuronale Stammzellen aus Hirngewebe zu identifizieren, was die Schätzung von Vorläuferzellzahlen ermöglicht. Darüber hinaus können diese 3D-Strukturen unter differenziativen Bedingungen plattiert werden, was zu Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten führt, was die Untersuchung des Zellschicksals ermöglicht.
Abstract
Der Neurosphären-Assay ist eine äußerst nützliche In-vitro-Technik zur Untersuchung der inhärenten Eigenschaften von neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), einschließlich Proliferation, Selbsterneuerung und Multipotenz. Im postnatalen und erwachsenen Gehirn sind NSPC hauptsächlich in zwei neurogenen Nischen vorhanden: der subventrikulären Zone (SVZ), die die lateralen Ventrikel auskundet, und der subgranularen Zone des Hippocampus dentate gyrus (DG). Die Isolierung der neurogenen Nischen aus dem postnatalen Gehirn ermöglicht es, eine höhere Menge an NSPCs in der Kultur mit einem daraus resultierenden Vorteil höherer Erträge zu erhalten. Der enge Kontakt zwischen den Zellen innerhalb jeder Neurosphäre schafft eine Mikroumgebung, die neurogenen Nischen ähneln kann. Hier beschreiben wir detailliert, wie man SVZ- und DG-abgeleitete Neurosphärenkulturen aus 1-3-Tage-Mäusen (P1-3) sowie Passaging für die Neurosphärenerweiterung erzeugt. Dies ist ein vorteilhafter Ansatz, da der Neurosphärentest eine schnelle Generierung von NSPC-Klonen (6 bis 12 Tage) ermöglicht und zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl der Tiernutzung beiträgt. Durch die Beschichtung von Neurosphären unter differenziativen Bedingungen können wir eine Pseudomonoschicht von Zellen erhalten, die aus NSPCs und differenzierten Zellen verschiedener neuronaler Linien (Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) besteht, die die Untersuchung der Wirkung intrinössischer oder extrinsischer Faktoren auf NSPC-Proliferation, Differenzierung, Zellüberleben und Neuritogenese ermöglichen.
Introduction
Der Neurosphären-Assay (NSA) wurde erstmals11992 1,2 beschrieben und ist bis heute ein einzigartiges und leistungsfähiges Werkzeug in der neuronalen Stammzellforschung (NSC). Die Isolierung von NSCs aus den wichtigsten neurogenen Regionen hat schwierige Probleme, da die Anforderungen an die Aufrechterhaltung dieser Zellen unter physiologischen Bedingungen nach wie vor wenig verstanden werden. In der NSA werden Zellen in einem chemisch definierten serumfreien Medium mit Wachstumsfaktoren wie dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF)1,2,3kultiviert. Neurale Vorläuferzellen (Stamm und Vorläufer) werden mit diesen Mitogenen ausgewählt, da diese Zellen EGF und FGF-responsive in eine Periode der aktiven Proliferation sind, während andere Zellen, nämlich differenzierte Zellen, sterben4. Neurale Vorläuferzellen wachsen als Neurosphären, die dann durchgehen können, um den Pool dieser Zellen weiter zu erweitern5. Wichtig ist, da diese neuronalen Stammvorläuferzellen (NSPCs) multipotent sind, sind sie in der Lage, sich in die drei Hauptzelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) zu differenzieren: Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten5.
Die NSA bietet eine erneuerbare Quelle für undifferenzierte ZNS-Vorläufer, die verwendet werden können, um mehrere Prozesse zu untersuchen, einschließlich NSC-Proliferation und Selbsterneuerung, und neuronale und gliaale Differenzierung, sowohl im physiologischen als auch im Krankheitskontext. Darüber hinaus können In-vitro-Studien verwendet werden, um den Grad der intrinsischen Spezifikation in neuronalen Vorläufern während der Entwicklung zu bewerten, sowie um das volle Potenzial der Zellen zu untersuchen, indem extrinsische Hinweise entfernt werden, die mit ihrer normalen Umgebung verbunden sind6. Das Neurosphärenmodell ist wertvoll, um vermeintliche Regulatoren zu bewerten, da durch die Aufrechterhaltung der Zellen in einem Medium ohne Serum die Umwelthinweise nur von den umgebenden Zellen6bereitgestellt werden. Darüber hinaus werden NSPC in der NSA leicht in der Kultur erweitert, die Dichte der Zellen pro Fläche ist hoch und die heterogene Zusammensetzung der Neurosphären hat eine gewisse Ähnlichkeit mit in vivo Nischen6. Diese etablierten Vorteile sind der Grund, warum diese Methode von vielen Forschern weit verbreitet ist.
Das folgende Protokoll beschreibt detailliert alle Prozesse von der Isolierung der postnatalen NSPC-Population aus den beiden wichtigsten neurogenen Regionen, der subventrikulären Zone (SVZ) und dem Hippocampus dentate gyrus (DG), über die Ausdehnung dieser Zellen als Neurosphären bis hin zur Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Schließlich werden auch verschiedene Assays beschrieben, um auf Diesatologie- und Multipotenzeigenschaften von SVZ- und DG-abgeleiteten NSSPCs zuzugreifen.
Protocol
Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Rechtsvorschriften der Europäischen Gemeinschaft (86/609/EWG; 2010/63/EU; 2012/707/EU) und den portugiesischen Rechtsvorschriften (DL 113/2013) zum Schutz von Tieren durchgeführt, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden. Das Protokoll wurde von der institutionellen Tierschutzorganisation des iMM - ORBEA-iMM und der zuständigen nationalen Behörde - DGAV ( Direcéo Geral de Alimentaéo e Veterinii) genehmigt."
1. Grundeinrichtung und Vorbereitung des Kulturmediums
- Am Tag der Zerlegung die entsprechende Menge an Wachstumsmedium entsprechend dem serumfreien Medium (SFM) zubereiten, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Adlermedium [(DMEM)/F12 mit L-Glutamin] (Materialtabelle) ergänzt mit 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (Pen/Strep), 1% B27, mit ebenfalls 10 ng/mL EGF und 5 ng/mL bFGF. Erwärmen Sie das Kulturmedium auf 37 °C im Wasserbad.
ANMERKUNG: Das Volumen des Wachstumsmediums hängt von der Anzahl der Welpen ab, für 5 Welpen bereiten 100 ml (50 ml für SVZ und 50 ml für DG); Nach Zählung der Anzahl der Zellen (Schritt 5.1) muss jedoch das genaue Volumen angepasst werden. - Für die Mikrodissektion von SVZ und DG, bereiten Sie die Calcium und Magnesium-freie Hanks Ausgewogene Saline-Lösung (HBSS) Dissektion Medium mit 100 U/ml Stift/Strep ergänzt.
HINWEIS: Bereiten Sie 50 bis 100 ml Seziermedium vor. - Richten Sie ein Seziermikroskop ein und bereiten Sie die Werkzeuge vor, die zum Entfernen des Gehirns (Schere und kleiner Spachtel) und für SVZ- und DG-Mikrodissektionen (Dumont-Kleinschere, #7 Zangen, #5 Zangen, #5S Zangen) benötigt werden, indem Sie 70 % Ethanol einweichen.
2. Ernte von postnatalen (P1-3) Maushirnen und SVZ/DG-Mikrodissektionen
- Bereiten Sie 60 mm Petrischalen (Wachstumsfläche 21 cm2) mit HBSS ergänzt mit Stift/Strep und 2 Probenröhrchen (eines für SVZ und eines für DG) mit je 500 l ergänzten HBSS zu.
- Euthanisieren Sie Mäusewelpen (P1-3) gemäß dem von der Institutional Animal Care Facility/Guidelines genehmigten Protokoll. Führen Sie die Enthauptung mit einem einzigen Schnitt mit einer scharfen Schere an der Basis des Hirnstamms durch.
- Halten Sie den ventralen Teil des Körpers an der Basis des Kopfes und mit kleinen spitzen Scheren, machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Haut über die gesamte Länge des Kopfes, so dass die Oberfläche des Schädels offenbaren.
- Machen Sie einen Längsschnitt an der Schädelbasis und schneiden Sie die sagittale Naht mit einer kleinen Schere mit einem möglichst flachen Winkel entlang, um eine Beschädigung der Gehirnstrukturen zu vermeiden.
- Schälen Sie den Schädel mit gekrümmten Zangen an den Seiten und belichten Sie das Gehirn.
VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass die Sezierenden Instrumente frei von Ethanol sind, bevor Sie das Gehirn berühren. - Isolieren Sie das Gehirn aus dem Schädel mit einem kleinen Spachtel, indem Sie unter der Basis des Gehirns gleiten, um die Hirnnerven und Blutgefäße zu schneiden, die mit der Basis des Gehirns verbunden sind, und übertragen Sie das Gehirn in eine Petrischale mit kalt ergänzter HBSS-Lösung.
- Platzieren Sie die Petrischale mit dem Gehirn unter einem Sezierendes Mikroskop bei geringer Vergrößerung und positionieren Sie das Gehirn auf seiner dorsalen Oberfläche.
- Mit feinen Zangen, entfernen Sie die Hirnhäuschen von der ventralen Seite des Gehirns und die olfaktorischen Glühbirnen, während Sie das Gehirn in Position durch das Kleinhirn halten. Drehen Sie das Gehirn auf den ventralen Aspekt und schälen Sie den Rest der Hirnhaut ab.
HINWEIS: Das Entfernen der dorsalen Meningen ist ein entscheidender Schritt, um eine korrekte Gehirnschnitte zu gewährleisten. - Entsorgen Sie das Kleinhirn, das einen Schnitt mit Zangen macht. Legen Sie ein Filterpapier mit einer Porengröße von 11 m auf einen Gewebehäcksler (Materialtabelle) und legen Sie das Gehirn mit gekrümmten Zangen auf das Filterpapier. Schneiden Sie das Gehirn in 450 'm koronalen Abschnitte und verwenden Sie eine nasse Lamina, um das geschnittene Gehirn in eine neue Petrischale mit kalt ergänzten HBSS gefüllt zu sammeln.
- Um die SVZ zu sezieren, verwenden Sie Zangen, um koronale Scheiben in einer vorderen bis posterioren Art und Weise zu trennen, bis Scheiben mit den seitlichen Ventrikeln unter einem Sezierenmikroskop erreicht werden.
- Schneiden Sie die dünne Gewebeschicht, die die Seitenwand der Ventrikel umgibt (was dem SVZ entspricht), mit feiner Zange, ausgenommen das striatale Parenchym und das Corpus callosum. Isolieren Sie die SVZ, indem Sie die Spitze der Zange in den seitlichen Ecken des seitlichen Ventrikels platzieren: eine unmittelbar unter dem Corpus callosum und die andere in das Gewebe unmittelbar neben dem ventralen Bereich des lateralen Ventrikels. Schneiden Sie dann eine kleine Gewebelinie um den seitlichen Ventrikel.
- Sammeln Sie das sezierte Gewebe in ein Probenröhrchen mit ergänzter HBSS-Lösung, die zuvor als SVZ identifiziert wurde.
HINWEIS: Schließen Sie die SVZ in Scheiben aus, in denen sowohl die seitlichen Ventrikel als auch die Hippocampusbildung zu erscheinen beginnen. - Gehen Sie alle Scheiben nach SVZ-Mikrodissektion in einer anterior-zu-posterior Art und Weise und erreichen Sie die Hippocampus-Formation. Mit Zangen verwerfen Sie die erste Scheibe mit Hippocampus, wo DG noch nicht wiederzuerkennen ist.
- Um die DG zu entfernen, isolieren Sie zuerst den Hippocampus aus den Scheiben. Richten Sie das Mikroskop neu aus, um die Grenzen um DG herum zu visualisieren.
- Sezieren Sie den DG-Anteil, indem Sie einen Schnitt zwischen der DG- und der CA1-Region durchführen, gefolgt von einem vertikalen Schnitt zwischen der DG- und der CA3-Region mit Zangen. Entfernen Sie Fimbria und jedes angrenzende Gewebe.
HINWEIS: Bei Tieren aus P1-3 ist die DG fast nicht von Ammons Horn zu unterscheiden, zeigt aber eine kleine Spitze an. - Sammeln Sie das sezierte Gewebe in ein Probenröhrchen mit ergänzten HBSS-Lösungen, die zuvor als DG identifiziert wurden.
ANMERKUNG: Eine Gesamtverletzung des Hippocampus oder der Umgebung wird es schwieriger machen, die GD zu isolieren. Die Verwendung eines Atlas des postnatalen Maushirns ist unerlässlich, wenn der Anwender nicht mit der Isolierung des SVZ- und DG-Gewebes aus koronalen Abschnitten vertraut gemacht wird.
3. Gewebedissoziation
- Um das in ihren jeweiligen Röhrchen vorhandene SVZ- und DG-Gewebe zu dissoziieren, fügen Sie Trypsin-EDTA 0,05 % hinzu, um eine Endkonzentration von 5 bis 10 % Trypsin-EDTA 0,05 % in HBSS zu haben. Etwa 15 min bei 37 °C inkubieren, bis das Gewebe verklumpt ist.
- Waschen Sie das Gewebe aus dem Trypsin, indem Sie die Medien entfernen und 1 ml neue HBSS-Ergänzungslösung für 4 aufeinander folgende Male hinzufügen.
- Entfernen Sie die HBSS und setzen Sie das verdaute Gewebe in 1 ml SFM ergänzt mit 10 ng/mL EGF und 5 ng/mL bFGF. Zerlegen Sie das Pellet mechanisch, indem Sie mit einer P1000-Pipette das Pellet vorsichtig auf und ab leiten, bis es eine homogene Zelllösung erhält.
VORSICHT: Übermäßige mechanische Dissoziation kann zu einem erhöhten Zelltod führen und sich negativ auf das nachfolgende Zellwachstum auswirken.
4. Zell-Paar-Assay zur Untersuchung des Zellschicksals
- Bereiten Sie vor dem Experiment beschichtete 24-Well-Platten für anhaftende Monolayer-Kulturen nach den Abschnitten 8-10 vor.
- Um die Anzahl der zu versiebenenden SVZ- oder DG-Zellen (in Abschnitt 3) zu zählen, verwenden Sie eine Lösung mit 0,2 % Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einem Hämatozytometer.
- Verdünnen Sie die dissoziierte Zellsuspension in SFM, ergänzt mit 5 ng/mL EGF und 2,5 ng/mL bFGF (niedriges2 EGF/bFGF) bei einer Dichte von 11.300 Zellen/cm2 und verschichten Sie sie auf beschichteten Glasabdeckungen.
- Fixieren Sie nach 24 h die Zellen für die Immunzytochemie gegen NSC-Marker wie die geschlechtsbestimmende Region Y-Box 2 (Sox2) und Nestin sowie mit einem Marker der neuronalen Abstammung (nämlich Doublecortin [DCX], für unreife Neuronen) (siehe Abschnitt 14).
HINWEIS: Sox2 ist ein Marker von NSCs, die einer Mitose unterzogen werden. Sox2+/+ Zellpaare, die aus einer einzelnen Vorläuferzellteilung resultieren, spiegeln die Stammzellexpansion7wider.
5. Expansion postnataler neuronaler Stammzellen als Neurosphären
- Um die Dichte der dissoziierten SVZ- oder DG-Zellsuspension (in Abschnitt 3 erhalten) zu bestimmen, zählen Sie die Zellen mit einem Hämatozytometer.
- Verdünnung der Einzelzellsuspension SVZ und DG bei einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml in SFM, ergänzt durch 10 ng/ml EGF und 5 ng/ml bFGF. Samen SVZ- und DG-Zellen in unbeschichteten 60 mm Petrischalen mit einem Endvolumen von 5 ml/Petrischale.
- Inkubieren Sie SVZ- und DG-Zellen für 6 bis 8 Tage bzw. 10 bis 12 Tage, um primäre Neurosphären bei 37 °C mit 5%CO2zu bilden.
HINWEIS: Inkubationstage mehr als die genannten können die Aggregation von Neurosphären und höhere Ebenen des Zelltodes im Zentrum der Neurosphäre fördern. - Wenn die Mehrheit der Neurosphären einen Durchmesser von 150 bis 200 m haben, führen Sie die Neurosphärenpassage durch.
HINWEIS: Das Passieren von Neurosphären, wenn sie keinen geeigneten Durchmesser haben, beeinträchtigt alle nächsten Schritte.
6. Passierung von Neurosphären
HINWEIS: Das folgende Protokoll kann angewendet werden, um sowohl SVZ- als auch DG-Neurosphären zu erweitern.
- Um Neurosphären zu durchleben, sammeln Sie den SFM mit Wachstumsfaktoren, die Neurosphären aus der 60 mm Petrischale(en) und Zentrifuge für 5 min bei 300 x genthalten.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Neurosphärenpellet mit einem chemischen Dissoziationskit (Maus) gemäß den Anweisungen des Herstellers(Materialtabelle) wieder aus.
HINWEIS: Beobachten Sie die Inkubationszeiten genau, da sie für die Leistung entscheidend sind. - Zentrifuge für 5 min bei 300 x g, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml SFM ergänzt mit 10 ng/mL EGF und 5 ng/mL bFGF.
- Trituieren Sie etwa 10x mit einer P1000 Pipette auf und ab, um Neurosphären zu dissoziieren.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die eine Lösung mit 0,2% Trypan blau und einem Hämatozytometer enthalten.
- Reseed-Zellen mit einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml in unbeschichteten 60 mm Petrischalen.
- Inkubieren Sie SVZ- und DG-Zellen für 6 bis 8 Tage bzw. 10 bis 12 Tage, um sekundäre Neurosphären bei 37 °C mit 5%CO2zu erhalten.
HINWEIS: Auf die Selbsterneuerungskapazität von SVZ- und DG-abgeleiteten NSSpCs kann über die folgenden Protokollabschnitte 5 und 6 zugegriffen werden. Dazu saatieren SVZ- und DG-Zellen mit einer Dichte von 1,0 x 104 Zellen/ml (in unbeschichteten 24-Well-Platten) in Wachstums-SFM-Medium mit 5 ng/mL EGF und 2,5 ng/ml bFGF (niedriger EGF/bFGF). Zählen Sie die Anzahl der resultierenden primären und sekundären Neurosphären.
7. Lagerung von Neurosphären
- Sammeln Sie das Medium, das Neurosphären enthält (aus den Schritten 5.3 und 6.7) aus den 60 mm Petrischalen.
- Zentrifugieren Sie 5 min bei 300 x g und entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 ml HBSS (5 min bei 300 x g).
- Zentrifuge für 5 min bei 300 x g, entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet von Neurosphären bei -20 °C für die molekularbiologische Analyse.
8. PDL-Beschichtungsplattenverfahren
- Zur Herstellung der Lösung 1 (0,1 M Boratpuffer), 3,92 g Borsäure wiegen und in 400 ml hochreinem Wasser verdünnen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,2 ein und machen Sie bis zu 500 ml mit hochreinem Wasser.
- Zur Herstellung von Lösung 2 (0,167 M Boratpuffer), 10,3 g Borsäure wiegen und in 900 ml hochreinem Wasser verdünnen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,2 ein und machen Sie bis zu 1.000 ml mit hochreinem Wasser.
- Um Poli-D-Lysin (PDL) (1 mg/ml in 0,1 M Boratpuffer) zu rekonstruieren, 100 mg PDL in 100 ml lösung 1 zu verdünnen.
- Machen Sie Aliquots von 10 ml sofort zu verwenden oder einfrieren und lagern bei -20 °C.
- Fügen Sie unter dem laminaren Durchfluss 1 Deckschrutsch pro Brunnen hinzu und sterilisieren Sie unter UV-Licht für 15 min.
- Verwenden Sie die rekonstituierte PDL oder tauen Sie die rekonstituierte PDL.
- Bereiten Sie die von 100 g/ml PDL in 0,167 M Boratpuffer vor, indem Sie 10 ml rekonstituierte PDL zu 90 ml lösung 2 hinzufügen.
- Fügen Sie die endgültige Lösung in Brunnen für mindestens 2 h bis über Nacht bei 37 °C.
HINWEIS: Für 24-Well-Platten, fügen Sie ein Volumen von 500 l in jedem Brunnen. - Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie 3x mit hochreinem Wasser.
- Lassen Sie die Abdeckungen in der laminaren Fließhaube trocknen.
- Lassen Sie die Multi-Well-Kulturplatten bei 4 °C.
9. PDL/Laminin Beschichtungsplattenverfahren
- Beschichten Sie die Platten am ersten Tag mit PDL, wie in Abschnitt 8 beschrieben.
- Entfernen Sie am 2. Tag die PDL-Lösung und waschen Sie 3x mit hochreinem Wasser. Trocknen lassen.
- Bereiten Sie 5 g/ml Laminin in kaltem SFM ohne Wachstumsfaktoren vor.
- Gelöstes Laminin in die Abdeckungen geben und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Für 24-Well-Platten, fügen Sie ein Volumen von 500 l in jedem Brunnen. - Laminin mit einer Pipette entfernen.
HINWEIS: Waschen Sie die Deckel nicht von Laminin. - Sofort verwenden oder bei -20 °C lagern.
10. Poly-L-Ornithin (PLO) /Laminin-Beschichtungsverfahren
- Fügen Sie unter dem laminaren Durchfluss einen Deckelschlupf pro Brunnen hinzu und sterilisieren Sie unter UV-Licht 15 min.
- Fügen Sie 0,01% PLO-Lösung zu jedem Brunnen für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
HINWEIS: Für 24-Well-Platten, fügen Sie ein Volumen von 500 l in jedem Brunnen. - Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie 3x mit sterilisiertem 1x PBS. Trocknen lassen.
- Bereiten Sie 5 g/ml Laminin in sterilem 1x PBS vor.
- 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie Laminin.
HINWEIS: Waschen Sie die Deckel nicht von Laminin. - Sofort verwenden.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Coverslip vollständig von der PLO-Lösung abgedeckt ist, indem Sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze auf den Deckelschlupf tippen. Wenn sie geschüttelt werden, sollten die Multi-Well-Platten keinen Ton machen.
11. Bewertung der Neuritogenese durch Erzeugung einer differenzierten Monoschicht der
- Sammeln Sie Medien mit Neurosphären aus 60 mm Petrischalen (aus Abschnitt 5) und Zentrifuge für 5 min bei 300 x g bei RT.
- Entsorgen Sie das Überstand und dissoziieren Sie das Pellet der Neurosphären in 1 ml Dissoziation PBS (d. h. PBS ohne Mg2+/Ca2+ und mit EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 und 0,5 mM EDTA 4Na, bei pH = 7,40]) durch Inkubation für 15 min gefolgt von mechanischer Dissoziation. Alternativ können Sie Neurosphären mit einem chemischen Dissoziationskit (Maus) (Materialtabelle )dissoziieren.
- Zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 x g bei RT und entsorgen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml SFM ohne Wachstumsfaktoren aus.
- Bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hämatozytometer.
- Verdünnen Sie die dissoziierte Zellsuspension in SFM ohne Wachstumsfaktoren bei einer Dichte von 3.766 Zellen/cm2 und Plattenzellen auf beschichteten Glasabdeckungen in 24-Well-Platten.
- Fixieren Sie nach 1 bis 3 Tagen Zellen für die Immunzytochemie gegen ein Protein des Zytoskeletts (siehe Abschnitt 14).
12. Differenzierung von Neurosphärenkulturen
HINWEIS: Neurosphären, die aus der Zellexpansion gewonnen werden, entweder aus primären oder durchdrängenden Neurosphären (in Abschnitt 5 oder 6 erhalten) können in Zellen aus verschiedenen neuronalen Linien unterschieden werden.
- Wenn Neurosphären einen Durchmesser von 150 bis 200 m haben, sammeln Sie 25 L Neurosphärensuspensionsmedium und Platte auf beschichteten Glasabdeckungen, in 24-Well-Platten.
HINWEIS: Um mehr Neurosphären zu sammeln, drehen Sie vorsichtig die Petrischale, um die Neurosphären in der Mitte zu konzentrieren. Dann Pipette aus der Mitte. - Legen Sie die Platten 15 min in einen Inkubator bei 37 °C, damit Neurosphären am Substrat haften. Fügen Sie danach 500 L SFM ohne Wachstumsfaktoren hinzu (unterschiedliche Bedingungen).
- Nach 24 h, ersetzen Sie das Medium durch frische SFM ohne Wachstumsfaktoren.
- Unterscheiden Sie für verschiedene Zeitpunkte (z. B. 2 bzw. 7 Tage in vitro, DIV2 bzw. DIV7) mit 5%CO2 bzw. 95% atmosphärischer Luft bei 37 °C.
HINWEIS: Das Überleben, die Zellproliferation und die Differenzierung können mit verschiedenen Zellassays analysiert werden.
13. Zellbiologie-Assays
- Zellüberlebenstest
- Setzen Sie plattierte Neurosphären 30 min Propidiumiodid (PI) 30 min vor der Zellfixierung im Inkubator bei 37 °C aus.
HINWEIS: PI ist ein autofluoreszierendes Mittel, das nur in der Lage ist, in Zellen mit beeinträchtigter Membranintegritäteinzudringen 8. Andere Methoden zur Analyse des Zellüberlebens können verwendet werden, wie Caspase-3-Färbung oder der terminale Desoxynukleotidyltransferase dUTP-Nickel-End-Etikettierung (TUNEL) Assay.
- Setzen Sie plattierte Neurosphären 30 min Propidiumiodid (PI) 30 min vor der Zellfixierung im Inkubator bei 37 °C aus.
- Zellproliferationstest
- Plattierte Neurosphären vor der Fixierung im Inkubator bei 37 °C 4 h vor fixieren.
HINWEIS: BrdU ist ein synthetisches Thymidin-Analogon, das während der DNA-Synthese in vermehrende Zellen9eingearbeitet werden kann.
- Plattierte Neurosphären vor der Fixierung im Inkubator bei 37 °C 4 h vor fixieren.
- Zelldifferenzierungstest
- 7 Tage alte plattierte Neurosphären in den ersten 24 h im Inkubator bei 37 °C auf 10 M BrdU aussetzen.
- Erneuern Sie den SFM ohne Wachstumsfaktoren (unterschiedliche Bedingungen) und ermöglichen Sie es Zellen, sich in Abwesenheit von BrdU für die folgenden 6 Tage bis zur Fixierung zu entwickeln.
HINWEIS: Diese Puls-Chase-Experimente ermöglichen durch Ko-Kennzeichnung mit Markern reifer Nervenzellen die Auswertung von Vorläuferzellen, die sich während des Protokolls in reife Zellen differenzieren.
14. Immunostainierung von Neurosphärenkulturen
- Zellfixierung
- 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS vorbereiten und bei 4 °C oder -20 °C lagern.
- Entfernen Sie den SFM ohne Wachstumsfaktoren aus Denbrunnen und fügen Sie jedem Brunnen 500 l 4% PFA bei 4 °C für 20 min bei RT hinzu.
- Waschen Sie 3x mit 1x PBS, für 5 min jedes Mal, die Coverlips enthalten differenzierte Neurosphären.
- Coverlips bis zur Verwendung in 500 l 1x PBS bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Wenn das Experiment keine BrdU enthält, fahren Sie mit Schritt 14.3 fort.
- Denaturierungsmethode (nur für BrdU-Experimente)
- 1 M HCl bei 37 °C vorbereiten.
- Spülen Sie Abdeckungen 3x in 1x PBS.
- Permeabilisieren Sie Zellen für 30 min in PBS, die 1% nichtionisches Tensid enthalten (z. B. Triton X-100).
- Denatur dsDNA mit 1 M HCl vorgewärmt auf 37 °C für 30 x 40 min bei 37 °C (ca. 300 l/well).
- Waschbrunnen 4x mit 1x PBS waschen.
- Permeabilisierung und Blockierung
- Spülen Sie Deckellipsen in 1x PBS für 5 min.
- Inkubieren Sie für 1,5 h mit 0,5% nichtionischem Tensid und 3% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS (ca. 300 l/well).
HINWEIS: Verwenden Sie für NeuN 6% BSA in 1x PBS.
- Inkubation und Montage
- Am ersten Tag ohne Waschen, inkubieren Zellen mit primären Antikörpern (Materialtabelle) in 0,1% nichtionischem Tensid und 0,3% BSA in 1x PBS in der Inkubationskammer (für 24-Well-Platten verwenden 20 l/well). Lassen Sie Die lips über Nacht bei 4 °C lichtgeschützt, wenn Antikörper zu einem Fluorophor konjugiert werden.
- Am 2. Tag, Rückdeckungslips zu ihren jeweiligen Brunnen und spülen 3x in 1x PBS für 5 min.
- Gegenfärbung mit geeigneten fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörpern (Verdünnung 1:200) und mit 12 g/ml Hoechst 33342 in 1x PBS für 2 h bei RT und Licht geschützt in der Inkubationskammer (20 l/Coverslip).
- Waschen Sie Abdeckungen 3x in 1x PBS für 5 min.
- Montieren Sie Abdeckungen auf Mikroskopschlitten mit 5 l/Coverslip von Fluoreszenz-Montagemedium.
- Lassen Sie die Abdeckungen bei RT, vor Licht geschützt, 1 Tag lang trocknen.
- Mikroskopie
- Anzeigen und Erfassen von Bildern mit einem Fluoreszenzmikroskop.
- Verwenden Sie für jede Bedingung drei Replikationen. Führen Sie die Zellzahl in fünf unabhängigen mikroskopischen Feldern in jedem Deckslip mit einem 40-fachen Objektiv (ca. 100 Zellen pro Feld) aus.
15. Erstellung von EGF- und bFGF-Aktienlösungen
- EGF-Aktienlösung
- Um den lyophilisierten EGF zu rekonstituieren, verdünnen Sie das Produkt in hochreinem Wasser, um eine Endkonzentration von 20 g/ml zu erreichen.
- Aliquot und lagern in Mikroröhren bei -5 bis -20 °C.
- bFGF Aktienlösung
HINWEIS: bFGF muss mit einer Lösung von 10 mM Tris, pH 7,6, rekonstituiert werden.- Zentrifugieren Sie die Durchstechflasche kurz vor dem Öffnen, um den Inhalt auf den Boden zu bringen.
- Bereiten Sie 50 ml von 10 mM Tris, pH 7,6 vor. Wiegen Sie dafür 60,57 mg Tris ((HOCH2)3CNH2) und verdünnen Sie es in 40 ml hochreinem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein und machen Sie bis zu 50 ml mit hochreinem Wasser.
- Bereiten Sie 10 ml von 0,1% BSA in 10 mM Tris, pH 7,6 vor. Wiegen Sie dazu 10 mg BSA und verdünnen Sie es in 10 ml von 10 ml Tris.
- Filterlösungen in den Schritten 15.2.2 und 15.2.3 mit einem 0,22 m Filter unter einer laminaren Durchflusshaube.
- Rekonstituieren Sie 10 g bFGF in 1.000 l von 0,1% BSA in 10 mM Tris mit pH 7,6, um eine Endkonzentration von 10 g/ml zu erreichen. Aliquot in Mikroröhren bei -20 °C für maximal 6 Monate.
Representative Results
SVZ- und DG-Neurosphären, die durch die NSA gewonnen werden, bestehen aus undifferenzierten Zellen, positiv für Sox2, einem Transkriptionsfaktor, der an der Selbsterneuerungskapazität beteiligt ist und positiv für Nestin, ein zwischengeschaltetes Filamentprotein, das in NSPCs exprimiert wird (Abbildung 1A). Darüber hinaus haben SVZ-abgeleitete Neurosphären größere Abmessungen als ihre DG-Pendants (Abbildung 1A). Wichtig ist, dass Unter unterschiedlichen Bedingungen SVZ- und DG-abgeleitete NSSPCs aus Neurosphären migrieren und eine Pseudomonoschicht von Zellen bilden (Abbildung 1B).
Um auf die Selbsterneuerungskapazität zuzugreifen, wird der Zellpaartest basierend auf der Expression von Sox2 und Nestin durchgeführt, die dazu neigt, in teilenden Zellen zu verschwinden, die den Differenzierungsprozess mit einer Kombination eines Markers der neuronalen Abstammung, nämlich DCX, beginnen. In beiden neurogenen Regionen Es ist möglich, das Vorhandensein von Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetrische Teilungen (Selbsterneuerung) zu beobachten (Abbildung 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- asymmetrische Teilungen (Abbildung 2A1,B2) und Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ divisionen (Differentiation) (Abbildung 2A2,B1).
Die Passierung der Neurosphären erhöht die Ausbeute von NSPCs; Der Zelltod bei DIV2 ändert sich jedoch mit der Passierung. Tatsächlich wird der Anteil der PI-positiven Zellen mit dem Zelldurchgang in SVZ erhöht (P0: 15,6 % bei 1,2 % vs. P1: 19,2 % - 2,7 % vs. P2: 32,35 % - 0,14 % vs. P3: 39,6 % bei 4,0 %) und in der GD (P0: 16,31 % bei 0,95 % vs. P1: 32,1 % bis 1,7 % vs. P2: 27,42 % vs. P3: 32,2 % bis 3,1 %) (Abbildung 3).
Die Neuritogenese kann in Neuronen untersucht werden, die aus der Differenzierung von SVZ und DG NSPCs zu Beginn der Differenzierung gewonnen wurden: DIV1 (Abbildung 4A,D), DIV2 (Abbildung 4B,E) und DIV3 (Abbildung 4C,F). Tatsächlich nimmt, wie in Abbildung 4beobachtet, die Länge und Verzweigung der Neuriten mit der Differenzierung zu.
Die Zellproliferation kann in SVZ- und DG-abgeleiteten Neurosphären evaluiert werden. Vergleicht man die primären differenzierten Neurosphären bei DIV1 von SVZ (Abbildung 5A1) und DG (Abbildung 5A2), ist der Anteil der BrdU-positiven Zellen in SVZ höher als in der GD (SVZ: 6,15 % - 0,64 % gegenüber DER GD: 3,27 % - 0,13 %; p < 0,05; n = 4; Abbildung 5A3). Darüber hinaus kann auf die Zelldifferenzierung auch zugegriffen werden, indem BrdU-Färbung mit einem reifen Hersteller wie neuronalen Kernen (NeuN) kombiniert wird, der reife Neuronen identifiziert (Abbildung 5B1,B2). Abbildung 5B3 zeigt, dass der Anteil der sich ausbreitenden Vorläufer, die sich in reife Neuronen differenzieren, in SVZ und DG ähnlich ist (SVZ: 12,04 % bei 1,58 % gegenüber DER GD: 13,56 % bei 0,48 %; p > 0,05; n = 4).
Auf die Stammheit und die Multipotenz von SVZ- und DG-abgeleiteten NSSpCs kann über die NSA zugegriffen werden, indem die Expression verschiedener Marker an verschiedenen Differenzierungstagen (DIV2 und DIV7) ausgewertet wird. Tatsächlich sind NSCs (nestin- und glial fibrilläres saures Protein [GFAP]-doppel-positive Zellen) in beiden neurogenen Regionen vorhanden(Abbildung 6A,G). Diese Zellen sind in der Lage, sich in unreife Neuronen (DCX-positive Zellen) zu differenzieren (Abbildung 6B,H), reife Neuronen (NeuN-positive Zellen) (Abbildung 6F,L), Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (neurongliales Antigen 2 [NG2] und Thrombozyten-abgeleitet Wachstumsfaktorrezeptor - [PDGFR]- positive Zellen) (Abbildung 6C,I), reife Oligodendrozyten (Myelin-Basisprotein [MBP]-positive Zellen) (Abbildung 6E,K) und Astrozyten (GFAP-positive Zellen) (Abbildung 6D,J).
Verschiedene Substrate können verwendet werden, um Coverlips zu beschichten, um die Pseudomonoschicht von Zellen unter differenziativen Bedingungen zu bilden. Wie in Der Zusatzabbildung 1dargestellt, migrieren DG-Zellen mehr, wenn die Abdeckungen eine Extrabeschichtung mit Laminin in Kombination mit PLO oder PDL aufweisen, als mit PDL allein(Zusatzabbildung 1B-H). Wenn PDL und Laminin zusammen als Substrate verwendet werden (Zusatzabbildung 1C,G), bilden DG-Zellen eine konfluentere Pseudomonoschicht als SVZ-Zellen, für die PDL allein verwendet wird (Ergänzende Abbildung 1A,E).
Wichtig ist, dass diese Ergebnisse das Potenzial der NSA zeigen, die Stamm- und Multipotenzeigenschaften von NSCs zu bewerten, die aus den beiden wichtigsten neurogenen Nischen abgeleitet sind.
Abbildung 1: Subventrikuläre Zone und Dentate Gyrus abgeleitet NSPC als Neurosphären oder als Pseudomonolayer kultiviert. (A) Repräsentative Hellfeldbilder (A1,A3) und Fluoreszenz (A2,A4) Von SVZ- und DG-abgeleiteten Neurosphären, bei denen Kerne mit Hoechst 33342 (blau) und NSCs für Sox2 (grün) und Nestin (rot) befleckt wurden. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von Pseudomonolayern, die aus SVZ- und DG-abgeleiteten Neurosphären unter differenziativen Bedingungen erzeugt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der Zellpaartest. Repräsentative Fluoreszenzbilder von Zellpaaren, die aus einer Vorläuferzellteilung abgeleitet wurden. SVZ- und DG-Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau), stammähnlichen Zellen für Sox2 (rot) und Nestin (weiß) sowie unreifen Neuronen mit DCX (grün) befleckt. Pfeilspitzen in den Paneelen A1 und B1 zeigen Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetrische selbsterneuernde Teilungen an, Pfeile in den Paneelen A1 und B2 zeigen Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+ asymmetrische Teilungen an, gestrichelte Linienpfeile in den Panels A2 und B1 zeigen Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetrische Teilungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zellüberlebensanalyse mit Zellpassaging. Quantitative Analyse von PI-positiven Zellen am DIV2 in der sVZ- und DG-abgeleiteten differenzierten Neurosphärenkultur nach 0, 1, 2 und 3 Passagen (P0-P3). Die Daten werden als Mittelwert -SEM, n = 1-8 ausgedrückt. PI = Propidium Iodid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Neuritogenese-Analyse bei DIV 1, 2 und 3. Repräsentative konfokale Fluoreszenzbilder von Neuriten, identifiziert durch das Signal von III-Tubulin, in SVZ- und DG-Neuronen bei (A,D) DIV1, (B,E) DIV2 und (C,F) DIV3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Zellproliferationstest. Repräsentative konfokale Bilder von BrdU-positiven Zellen bei DIV1 in (A1) SVZ und (A2) DG. (A3) Quantitative Analyse von BrdU-positiven Zellen am DIV1 in der DG- und SVZ-abgeleiteten differenzierten Neurosphärenkultur. Die Daten werden als Mittelwert -SEM, n = 4 ausgedrückt. *p < 0,05 durch t-Test. Repräsentative Fluoreszenzbilder von BrdU- und NeuN-positiven Zellen bei DIV7 in (B1) SVZ und (B2) DG. Pfeilspitzen zeigen BrdU-/NeuN-positive Zellen an. (B3) Quantitative Analyse von BrdU-/NeuN-positiven Zellen bei DIV7 in beiden Nischen. Die Daten werden als Mittelwert -SEM, n = 4 ausgedrückt. BrdU: 5-Brom-2'-Deoxyuridin, synthetisches Thymidin-Analogon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Neuralzelltypen in der von SVZ und DG abgeleiteten differenzierten Neurosphärenkultur. Repräsentative Fluoreszenzbilder von SVZ- und DG-abgeleiteten Zelltypen nach 2 und 7 Tagen Neurosphärendifferenzierung (DIV2 und DIV7), bei denen Zellkerne mit Hoechst 33342 (blau) und: (A,G) NSCs für GFAP (grün) und Nestin (rot), (B,H) unreife Neuronen gefärbt wurden für DCX (grün), (C,I) Oligodendrozyten-Vorläuferzellen für PDGFR (grün) und NG2 (rot), (D,J) Astrozyten für GFAP (grün), (E,K) reife Oligodendrozyten für MBP (grün) und (F,L) reife Neuronen für NeuN (rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Testen verschiedener Substrate auf Neurosphärenhaftung und Migration zu einer Pseudomonoschicht. Repräsentative Fluoreszenzbilder von (A,E) SVZ-abgeleiteter Pseudomonoschicht unter Verwendung von Poly-D-Lysin als Substrat, (B,F) DG-abgeleitete Pseudomonoschicht mit Poly-D-Lysin als Substrat, (C,G) DG-abgeleitete Pseudomonoschicht mit Poly-D-Lysin mit Laminin als Substrat und (D,H) DG-abgeleitete Pseudomonoschicht mit Poly-D-Lysin mit Poly-L-Ornithin als Substrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
In-vitro-Systeme von NSPCs ermöglichen ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die in vivo weiter validiert werden können. Die NSA ist eine sehr leistungsfähige Methode, um physiologische Bedingungen aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur zu imitieren. Darüber hinaus ist dieses Kultursystem auch technisch einfacher zukulturisieren 10, im Vergleich zu anderen In-vitro-Systemen wie dem Monolayer-Kultursystem. Tatsächlich ist es mit der NSA einfach, die exponierten extrinsischen Hinweise während der Zellentwicklung zu kontrollieren, entweder während der Expansion spart oder in der Differenzierungsphase, indem präzise und variable Mengen von Faktoren hinzugefügt werden, die den Medien interessieren, sowie durch die Kultivierung von Neurosphären mit anderen Zelltypen6. Darüber hinaus ist es im Vergleich zu Monolayer-Kulturen in der NSA möglich, eine höhere Zelldichte aus einer kleinen Menge Gewebe oder mit einer kleinen Anzahl von Zellen zu erhalten, so dass parallele Studien durchgeführt werden können, wodurch die Anzahl der Tiere1reduziert wird.
Die NSA ist die häufigste Methode zum Isolieren und Erweitern von NSCs11,12,13, kann verwendet werden, um die Anzahl der Vorläuferzellen in einer gegebenen Gewebeprobe5 und die Vorläuferzellhäufigkeit zwischen verschiedenen Bedingungen zu schätzen. Allerdings sind sowohl Neurosphären als auch Monolayer-Kulturen nicht für Ruhe NSCs14verantwortlich. Darüber hinaus hat die NSA einige Einschränkungen11,12,13 und die resultierende Neurosphärenfrequenz hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der mittleren Komponenten, des Sezierverfahrens, des Dissoziationsprozesses11,12,13und der Neurosphärenaggregation5. Tatsächlich neigen Neurosphären in einer Kultur mit hoher Dichte dazu, sich zu aggregieren. Daher ist bei der Schätzung der Anzahl der Vorläuferzellen in einer Probe Vorsicht geboten. Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, können isolierte NSPC auch erweitert und in einer Monolayer5,15durchdrungen werden. Wichtig ist, dass die Verwendung der NSA zum Vergleichen der Vorläuferzellhäufigkeit zwischen verschiedenen Bedingungen sehr nützlich und genau ist, da alle diese Einschränkungen implizit und ähnlich unter allen Bedingungen sind, die im selben Experiment durchgeführt werden.
Es gibt kritische Schritte in der Neurosphärenkultur, die Aufmerksamkeit erfordern. Im Gehirn Ernteschritt, vollständige Entfernung der Meningen und gute Isolierung der neurogenen Nischen sind wichtig, um die Reinheit und Ausbeute der NSPCs zu maximieren. Während der Gewebedissoziation, aufgrund der proteolytischen Aktivität von Trypsin, übermäßige Verwendung von Trypsin oder längere Inkubationszeiten kann zu Zelllyse führen. Darüber hinaus ist der Tag der Passage entscheidend, um eine gesunde Population von Neurosphären zu erhalten. Die Passierung von Neurosphären mit einem Durchmesser von mehr als 200 m beeinflusst stark die Lebensfähigkeit, proliferative und differenziative Fähigkeit von NSPCs. Wichtig ist, dass längere Zyklen von Passagen, mehr als 10, die genetische Instabilität erhöhen können6. Darüber hinaus ist eine Beschichtung mit PDL und PLD/Laminin für SVZ- bzw. DG-Zellen unerlässlich, um eine gute Zellmigration aus den Neurosphären zu gewährleisten, ohne den Differenzierungsprozess zu beeinträchtigen. In Bezug auf die Immunzytochemie-Analyse können längere Inkubationszeiten mit PFA die Färbung beeinträchtigen, indem sie die Antigene maskieren und den Hintergrund erhöhen.
Die NSA ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bereitstellung einer konsistenten und unbegrenzten Quelle von NSPCs für In-vitro-Studien der neuronalen Entwicklung und Differenzierung sowie für therapeutische Zwecke16,17. Tatsächlich kann dieser Assay auf genetische und Verhaltensmodelle angewendet werden, um die molekularen und zellulären Mechanismen, die an der NSPC-Proliferation und -Differenzierung beteiligt sind, weiter zu verstehen18,19. Dieser Assay ist auch nützlich, um verschiedene Medikamente und Verbindungen20,21,22 sowie genetische Manipulationen durchzuführen19,23 nSC Eigenschaften zu modulieren. Neben der Immunzytochemie können Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktionen und Western-Blot-Analysen durchgeführt werden, um auf RNA- und Proteinexpression zuzugreifen, während elektrophysiologische Studien und Kalzium-Bildgebung verwendet werden können, um die Funktion der neugeborenen Neuronen21zu bewerten.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von IF/01227/2015 und UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Oréamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) und R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) erhielten ein Stipendium von FCT. Die Autoren danken den Mitgliedern der Bioimaging-Anlage am Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes für die Mikroskopiehilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| 12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
| Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | Life Technologies | A11039 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
| Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
| Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
| Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
| Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
| Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
| Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
| Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
| Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
| Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
| Micro Spatula - 12 cm | FST | 10091-12 | |
| Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
| Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
| NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
| Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
| Phosphate standard solutions, PO43 - in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
| Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |
References
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