I denne artikkelen beskriver vi i detalj en protokoll for generering av nevrosfærekulturer fra postnatal mus nevrale stamceller avledet fra hovedmusen nevrogene nisjer. Nevrosfærer brukes til å identifisere nevrale stamceller fra hjernevev som tillater estimering av forløpercelletall. Videre kan disse 3D-strukturene være belagt i differensierende forhold, noe som gir opphav til nevroner, oligodendrocytes og astrocytter, slik at studiet av celleskjebne.
Nevrosfæreanalysen er en svært nyttig in vitro-teknikk for å studere de iboende egenskapene til nevrale stamceller /stamceller (NSPCer) inkludert spredning, selvfornyelse og multipotens. I den postnatale og voksne hjernen er NSPCer hovedsakelig tilstede i to nevrogene nisjer: subventrikulær sone (SVZ) som fôrer de laterale ventriklene og den subgranulære sonen til hippocampal dentate gyrus (DG). Isoleringen av de nevrogene nisjene fra postnatal hjerne gjør det mulig å oppnå en høyere mengde NSPCer i kultur med en påfølgende fordel av høyere avkastning. Den nære kontakten mellom celler i hver nevrosfære skaper et mikromiljø som kan ligne nevrogene nisjer. Her beskriver vi, i detalj, hvordan å generere SVZ- og DG-avledede nevrosfærekulturer fra 1-3-dagers gamle (P1-3) mus, samt passaging, for neurosphere ekspansjon. Dette er en fordelaktig tilnærming siden nevrosfæreanalysen tillater en rask generasjon NSPC-kloner (6-12 dager) og bidrar til en betydelig reduksjon i antall dyrebruk. Ved plating av nevrosfærer i differensierende tilstander, kan vi få et pseudomonolayer av celler som består av NSPCer og differensierte celler av forskjellige nevrale slekter (nevroner, astrocytter og oligodendrocytes) slik at studien av handlingene til iboende eller extrinsic faktorer på NSPC proliferasjon, differensiering, celleoverlevelse og neuritogenesis.
Neurosphere analysen (NSA) ble først beskrevet i 19921,2 og fortsatt er et unikt og kraftig verktøy i neural stamcelle (NSC) forskning. Isoleringen av NSCer fra de viktigste nevrogene regionene har utfordrende problemer fordi kravene til å opprettholde disse cellene i fysiologiske forhold forblir dårlig forstått. I NSA, celler er kultivert i et kjemisk definert serum-fritt medium med tilstedeværelse av vekstfaktorer inkludert epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF)1,2,3. Neural forløper celler (stamceller og stamfarer) er valgt ved hjelp av disse mitogener siden disse cellene er EGF og FGF-responsive inn en periode med aktiv spredning mens andre celler, nemlig differensierte celler, dø4. Nevrale forløperceller vokser som nevrosfærer, som deretter kan gå stilutfor for å utvide bassenget av disse cellene5. Viktigere, siden disse nevrale stamceller (NSPCer) er multipotente de er i stand til å skille seg inn i de tre store celletyper av sentralnervesystemet (CNS): nevroner, oligodendrocytes og astrocytter5.
NSA gir en fornybar kilde til udifferensierte CNS-forløpere, som kan brukes til å studere flere prosesser, inkludert NSC-spredning og selvfornyelse, og nevronal og glial differensiering, i både fysiologisk og sykdomssammenheng. Videre kan in vitro studier brukes til å evaluere graden av egenspesifikasjon som finnes i nevrale forløpere under utvikling, samt å studere det fulle potensialet til cellene, ved å fjerne extrinsic signaler forbundet med deres normale miljø6. Nevrosfæremodellen er verdifull for å evaluere antatte regulatorer siden ved å opprettholde cellene i et medium blottet for serum, er miljøsignaler bare gitt av de omkringliggende cellene6. Videre, i NSA, NSPCs er lett utvidet i kultur, tettheten av celler per område er høy og heterogene sammensetningen av nevrosfærene har noen likhet med in vivo nisjer6. Disse veletablerte fordelene er grunnen til at denne metodikken har blitt mye brukt av mange forskere.
Følgende protokoll beskriver i detalj alle prosessene fra isolasjon av postnatal NSPC-populasjon fra de to viktigste nevrogene regionene, subventrikulær sone (SVZ) og hippocampal dentate gyrus (DG), til utvidelse av disse cellene som nevrosfærer, samt differensiering i nevroner, astrocytter og oligodendrocytes. Til slutt er ulike analyser også beskrevet for å få tilgang til stilkog multipotensegenskaper av SVZ- og DG-avledede NSPCer.
In vitro systemer av NSPCs tillate en bedre forståelse av cellulære og molekylære mekanismer, som kan ytterligere valideres i vivo. NSA er en svært kraftig metode for å etterligne fysiologiske forhold på grunn av deres tredimensjonale struktur. Videre er dette kultursystemet også teknisk enklere å kultur10, sammenlignet med andre in vitro-systemer som monolayerkultursystemet. Faktisk, med NSA, er det lett å kontrollere de eksponerte extrinsic signaler under celleutvikling, enten under utvidelsen eller differensieringsfasen, ved å legge til nøyaktige og variable mengder faktorer av interesse for media, samt ved å kule nevrosfærer med andre celletyper6. Videre, sammenlignet med monolayer kulturer, i NSA, er det mulig å få en høyere celletetthet fra en liten mengde vev eller med et lite antall celler, slik at parallelle studier kan utføres, og dermed redusere antall dyr1.
NSA er den vanligste metoden for å isolere og utvide NSCer11,12,13, kan brukes til å estimere antall forløperceller som finnes i en gitt vevsprøve5 og forløpercellefrekvensen mellom ulike forhold. Imidlertid gjør både nevrosfærer og monolayer kulturer ikke redegjøre for quiescence NSCs14. Videre har NSA noen begrensninger11,12,13 og den resulterende nevrosfærefrekvensen avhenger av mange faktorer, inkludert mellomstore komponenter, disseksjonsprosedyren, dissosiasjonsprosessen11,12,13, og nevrosfæreaggregasjon5. Faktisk, i en høy tetthet kultur, nevrosfærer har en tendens til å aggregere. Forsiktighet må derfor utvises ved estimering av antall forløperceller i en prøve. For å overvinne de ovennevnte begrensningene, kan isolerte NSPCer også utvides og overføres i et monolag5,15. Viktigere, ved hjelp av NSA for å sammenligne forløpercellefrekvens mellom ulike forhold er svært nyttig og nøyaktig fordi alle disse begrensningene er implisitte og like blant alle forhold som utføres i samme eksperiment.
Det er kritiske skritt i nevrosfærekulturen som trenger oppmerksomhet. I hjernen høsting trinn, fullstendig fjerning av meninges og god isolering av nevrogene nisjer er avgjørende for å maksimere renheten og utbyttet av NSPCs. Under vevdissosiasjon, på grunn av proteolytisk aktivitet av trypsin, kan overdreven bruk av trypsin eller lengre inkubasjonstider føre til cellelysis. Videre er dagen for passasjen avgjørende for å oppnå en sunn populasjon av nevrosfærer. Passering av nevrosfærer med en diameter høyere enn 200 μm påvirker i stor grad levedyktigheten, proliferative og differensierende kapasiteten til NSPCer. Viktigst, lengre sykluser av passasjer, mer enn 10 kan øke genetisk ustabilitet6. Videre er belegg med PDL og PLD / laminin for SVZ og DG-celler, henholdsvis avgjørende for å sikre god cellemigrasjon ut av nevrosfærene uten å gå på akkord med differensieringsprosessen. Når det gjelder immuncytokjemianalysen, kan lengre inkubasjonstider med PFA kompromittere farging ved å maskere antigenene og øke bakgrunnen.
NSA er et kraftig verktøy for å gi en konsekvent og en ubegrenset kilde til NSPCer for in vitro studier av neural utvikling og differensiering samt for terapeutiske formål16,17. Faktisk kan denne analysen brukes på genetiske og atferdsmessige modeller for å ytterligere forstå molekylære og cellulære mekanismer involvert i NSPC-spredning og differensiering18,19. Denne analysen er også nyttig for å teste ulike stoffer og forbindelser20,21,22 samt å utføre genetiske manipulasjoner19,23 å modulere NSC egenskaper. I tillegg til immuncytokjemi kan omvendt transkripsjonpolymerasekjedereaksjon og vestlig blotanalyse utføres for å få tilgang til RNA og proteinuttrykk, mens elektrofysiologiske studier og kalsiumavbildning kan brukes til å evaluere funksjonen til de nyfødte nevronene21.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av IF/01227/2015 og UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) og R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) fikk et fellesskap fra FCT. Forfatterne vil gjerne takke medlemmene av bioimaging anlegget ved Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes for mikroskopi hjelp.
0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine Scissors – Sharp | FST | 14060-09 | |
Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
Micro Spatula – 12 cm | FST | 10091-12 | |
Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
Phosphate standard solutions, PO43 – in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |