I den här artikeln beskriver vi i detalj ett protokoll för generering av neurosfärkulturer från postnatala mus neurala stamceller som härrör från de viktigaste mus neurogena nischer. Neurosfärer används för att identifiera neurala stamceller från hjärnvävnad som gör det möjligt att uppskatta prekursorcellnummer. Dessutom kan dessa 3D-strukturer pläteras i differentiativa förhållanden, vilket ger upphov till nervceller, oligodendrocyter och astrocyter, vilket gör det möjligt att studera cellöde.
Neurosfären analysen är en mycket användbar in vitro-teknik för att studera de inneboende egenskaperna hos neurala stamceller / stamceller (NSPCs) inklusive spridning, självförnyelse och multipotens. I den postnatala och vuxna hjärnan, NSPCs är främst närvarande i två neurogena nischer: den subventricular zonen (SVZ) foder de laterala ventriklarna och den subgranular zonen i hippocampus dentate gyrus (DG). Isoleringen av de neurogena nischerna från postnatala hjärnan gör det möjligt att få en högre mängd NSPC i kultur med en därav följande fördel av högre avkastning. Den nära kontakten mellan cellerna inom varje neurosfär skapar en mikromiljö som kan likna neurogena nischer. Här beskriver vi i detalj hur man skapar SVZ- och DG-härledda neurosfärkulturer från 1−3-dagars-gamla (P1−3) möss, samt passaging, för neurosfärexpansion. Detta är ett fördelaktigt tillvägagångssätt eftersom neurosfären analysen möjliggör en snabb generation av NSPC kloner (6−12 dagar) och bidrar till en betydande minskning av antalet djuranvändning. Genom att pläta neurospheres i differentiativa förhållanden, kan vi få en pseudomonolayer av celler som består av NSPCs och differentierade celler av olika neurala härstamningar (nervceller, astrocyter och oligodendrocyter) gör det möjligt att studera åtgärder av inneboende eller intrinsikala faktorer på NSPC spridning, differentiering, cellöverlevnad och neuritogenesis.
Neurosfären analysen (NSA) beskrevs först i 19921,2 och är fortfarande ett unikt och kraftfullt verktyg i neurala stamceller (NSC) forskning. Isoleringen av NSC från de viktigaste neurogena regionerna har utmanande problem eftersom kraven för att upprätthålla dessa celler i fysiologiska förhållanden fortfarande dåligt förstås. I NSA odlas celler i ett kemiskt definierat serumfritt medium med förekomst av tillväxtfaktorer, inklusive epidermala tillväxtfaktorn (EGF) och den grundläggande fibroblasttillväxtfaktorn (bFGF)1,2,3. Neurala prekursorceller (stamceller och stamfader) väljs genom att använda dessa mitogener eftersom dessa celler är EGF och FGF-lyhörda in i en period av aktiv spridning medan andra celler, nämligen differentierade celler, dör4. Neurala prekursorceller växer som neurosfärer, som sedan kan passage för att ytterligare expandera poolen av dessa celler5. Viktigt, eftersom dessa neurala stamceller stamceller (NSPCs) är multipotenta de kan skilja in i de tre stora celltyperna i centrala nervsystemet (CNS): nervceller, oligodendrocyter och astrocyter5.
NSA ger en förnybar källa till odifferentierade CNS prekursorer, som kan användas för att studera flera processer inklusive NSC spridning och självförnyelse, och neuronal och glial differentiering, i både fysiologiska och sjukdom sammanhang. Dessutom, in vitro-studier kan användas för att utvärdera graden av inneboende specifikation som finns i neurala prekursorer under utveckling, samt att studera den fulla potentialen av cellerna, genom att ta bort yttre ledtrådar i samband med deras normala miljö6. Neurosfärmodellen är värdefull för att utvärdera förmodade regulatorer eftersom genom att upprätthålla cellerna i ett medium saknar serum, är de miljömässiga ledtrådar endast tillhandahålls av de omgivande cellerna6. Dessutom, i NSA, NSPCs är lätt expanderas i kultur, tätheten av celler per område är hög och den heterogena sammansättningen av neurosfärerna har vissa likheter med in vivo nischer6. Dessa väletablerade fördelar är anledningen till att denna metod har använts i stor utsträckning av många forskare.
Följande protokoll beskriver i detalj alla processer från isolering av postnatala NSPC befolkningen från de två viktigaste neurogena regionerna, den subventricular zonen (SVZ) och hippocampus dentate gyrus (GD), till expansion av dessa celler som neurospheres, samt till differentiering i nervceller, astrocyter och oligodendrocyter. Slutligen beskrivs också olika analyser för att få tillgång till stamhet och multipotensegenskaper hos SVZ- och DG-härledda NSPC.Lastly, different assays are also described to access stemness and multipotency properties of SVZ- and DG-derived NSPCs.
In vitro-system för NSPC möjliggör en bättre förståelse av de cellulära och molekylära mekanismerna, som kan valideras ytterligare in vivo. NSA är en mycket kraftfull metod för att efterlikna fysiologiska tillstånd på grund av deras tredimensionella struktur. Dessutom är detta kultursystem också tekniskt lättare att odla10, jämfört med andra in vitro-system som monolayer kultursystemet. Faktum är att med NSA, är det lätt att kontrollera de exponerade intrinsikalt signaler under cellutveckling, antingen under expansionen eller differentieringsfasen, genom att lägga till exakta och varierande mängder av faktorer av intresse för media samt genom att odling av neurosfärer med andra celltyper6. Jämfört med monolayerkulturer är det dessutom möjligt att få en högre celltäthet från en liten mängd vävnad eller med ett litet antal celler, vilket gör det möjligt att utföra parallella studier, vilket minskar antalet djur1.
NSA är den vanligaste metoden för att isolera och expandera NSCs11,12,13, kan användas för att uppskatta antalet prekursorceller som finns i ett visst vävnadsprov5 och prekursorcellfrekvensen mellan olika förhållanden. Men både neurospheres och monolayer kulturer tar inte hänsyn till quiescence NSCs14. Dessutom har NSA vissa begränsningar11,12,13 och den resulterande neurosfären frekvens beror på många faktorer, inklusive de medelstora komponenterna, dissekering förfarandet, dissociation processen11,12,13, och neurosfär aggregering5. I en hög densitet kultur, neurospheres tenderar att aggregera. Därför måste försiktighet iakttas vid uppskattning av antalet prekursorceller i ett prov. För att övervinna ovanstående begränsningar kan isolerade NSPC också utökas och passage i en monolayer5,15. Viktigt, att använda NSA för att jämföra prekursor cellfrekvens mellan olika villkor är mycket användbart och korrekt eftersom alla dessa begränsningar är implicita och liknande bland alla villkor som utförs i samma experiment.
Det finns kritiska steg i neurosfärkulturen som behöver uppmärksammas. I hjärnan skörd steg, fullständigt avlägsnande av hjärnhinnor och god isolering av neurogena nischer är viktiga för att maximera renhet och avkastning av NSPCs. Under vävnad dissociation, på grund av proteolytisk aktivitet av trypsin, överdriven användning av trypsin eller längre inkubationstider kan leda till celllys. Dessutom är dagen för passagen avgörande för att få en frisk population av neurosfärer. Passaging neurospheres med en diameter högre än 200 μm påverkar kraftigt livskraft, proliferative och differentiative kapacitet NSPCs. Viktigt, längre cykler av passager, mer än 10 kan öka genetisk instabilitet6. Dessutom är beläggning med PDL och PLD/laminin för SVZ respektive DG-celler avgörande för att säkerställa god cellmigration ut ur neurosfärerna utan att kompromissa med differentieringen. När det gäller immunocytokemi analys, längre inkubationstider med PFA kan äventyra färgning genom att maskera antigener och öka bakgrunden.
NSA är ett kraftfullt verktyg för att tillhandahålla en konsekvent och obegränsad källa till NSPCs för in vitro-studier av neural utveckling och differentiering samt för terapeutiska ändamål16,17. Faktum är att denna analys kan tillämpas på genetiska och beteendemässiga modeller för att ytterligare förstå de molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i NSPC spridning och differentiering18,19. Denna analys är också användbart för att testa olika läkemedel och föreningar20,21,22 samt att utföra genetiska manipulationer19,23 att modulera NSC egenskaper. Förutom immunocytokemi kan omvänd transkriptionspolylasked reaktion och western blot-analys utföras för att komma åt RNA och proteinuttryck, medan elektrofysiologiska studier och kalciumavbildning kan användas för att utvärdera funktionen hos de nyfödda nervcellerna21.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av IF/01227/2015 och UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) och R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) fick ett stipendium från FCT. Författarna vill tacka medlemmarna i bioimaging anläggningen vid Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes för mikroskopi hjälp.
0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine Scissors – Sharp | FST | 14060-09 | |
Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
Micro Spatula – 12 cm | FST | 10091-12 | |
Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
Phosphate standard solutions, PO43 – in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |