在本文中,我们详细描述了从主要小鼠神经原性利基中提取的产后小鼠神经干细胞生成神经球培养的一个协议。神经球用于识别脑组织的神经干细胞,从而估计前体细胞数。此外,这些3D结构可以在不同的条件下镀,产生神经元,寡核细胞和星形细胞,允许细胞命运的研究。
神经球测定是一种非常有用的体外技术,用于研究神经干细胞/祖细胞(NSC)的固有特性,包括增殖、自我更新和多能性。在产后和成人大脑中,NSPC主要存在于两个神经原性利基:侧心室的补助区(SVZ)和海马性腺性腺间角(DG)的亚粒区。将神经原性利基与产后大脑隔离,从而在培养中获得更高数量的NSPCs,从而获得更高的产量。每个神经圈内的细胞之间的密切接触创造了一个微环境,可能类似于神经学利基。在这里,我们详细描述如何从1⁄3天(P1+3)小鼠中生成SVZ和DG衍生的神经球培养物,以及通过神经球扩张。这是一个有利的方法,因为神经球测定允许快速生成NSPC克隆(6-12天),并有助于显著减少动物使用数量。通过在不同条件下电镀神经球,我们可以获得由NSC和不同神经谱系的分化细胞(神经元、星形细胞和寡核细胞)组成的伪单体细胞,从而能够研究内在或外在因素对NSPC增殖、分化、细胞生存和神经生成的作用。
神经球测定(NSA)最早描述于1992年1,2,2仍然是神经干细胞(NSC)研究中一个独特而强大的工具。将NSCs与主要神经原区隔离具有具有挑战性的问题,因为在生理条件下维持这些细胞的要求仍然知之甚少。在NSA中,细胞在化学定义的无血清培养基中培养,存在包括表皮生长因子(EGF)和基本纤维细胞生长因子(bFGF)1、2、3等生长因子。1,2,3神经前体细胞(干细胞和祖细胞)是使用这些线原选择的,因为这些细胞是EGF和FGF反应进入一个活性增殖期,而其他细胞,即分化细胞,死亡4。神经前体细胞生长作为神经球,然后可以通过进一步扩大这些细胞的池5。重要的是,由于这些神经干细胞祖细胞(NSPCs)是多能的,它们能够分化成中枢神经系统(CNS)的三种主要细胞类型:神经元、寡核细胞和星形细胞5。
国家安全局提供了一种无分化的中枢神经系统前体的可再生来源,可用于研究几种过程,包括NSC增殖和自我更新,以及生理和疾病背景下的神经元和胶质分化。此外,体外研究可用于评估发育过程中神经前体内在规范的程度,以及通过去除与其正常环境相关的外在线索来研究细胞的全部潜力。神经球模型对评估假定的调节器很有价值,因为通过将细胞维持在没有血清的介质中,环境线索仅由周围的细胞6提供。此外,在NSA中,NSPCs在培养中很容易扩大,每个区域细胞的密度很高,神经球的异质组成与体内的利基6有些相似。这些公认的优势是许多研究人员广泛使用这种方法的原因。
以下协议详细介绍了从两个主要神经原区(补助区(SVZ)和海马腺密度陀螺(DG)分离产后NSPC种群到这些细胞作为神经球的膨胀,以及分化成神经元、星形细胞和寡核酸物的所有过程。最后,还描述了不同的检测,以访问SVZ和DG衍生的NSPC的茎和多能特性。
NSC的体外系统可以更好地理解细胞和分子机制,可以在体内进一步验证。NSA是一种非常强大的方法来模仿生理条件,由于其三维结构。此外,与单层培养系统等体外系统相比,这种培养系统在技术上也更容易培养10。事实上,使用NSA,通过在扩张或分化阶段,通过在培养其他细胞类型6的神经球,在细胞发育过程中,通过在扩张或分化阶段添加精确和可变的感兴趣因子,很容易控制暴露的外在线索。此外,与单层培养物相比,在NSA中,可以从少量组织或少量细胞中获得更高的细胞密度,从而进行平行研究,从而减少动物数量1。
NSA是分离和扩展NSCs11、12、13的最常见方法,可用于估计给定组织样本11,12,135中存在的前体细胞数量和不同条件下的前体细胞频率。然而,神经球和单层培养物并不考虑静止NSCs14。此外,国家安全局有一些限制1111,12,13和由此产生的神经球频率取决于许多因素,包括中分量,解剖程序,分离过程,12,1311,12,13,和神经球聚集5。11,12,13事实上,在高密度文化中,神经球倾向于聚合。因此,在估计样本中前体细胞的数量时,必须谨慎。为了克服上述限制,孤立的NSPC也可以扩大和通过单层5,5,15。重要的是,使用NSA比较不同条件之间的前体细胞频率是非常有用和准确的,因为所有这些限制是隐式的,并且在同一实验中执行的所有条件中都是类似的。
神经球培养中有一些关键步骤需要注意。在大脑收获步骤中,完全去除脑质和良好隔离神经原性利基对于最大化NSC的纯度和产量至关重要。在组织分离期间,由于胰蛋白酶的蛋白酶活性,过量使用胰蛋白酶或延长孵育时间可能导致细胞溶酶。此外,通过的日子是至关重要的获得一个健康的神经球群。直径大于200μm的神经球的传递,极大地影响了NSPCs的生存能力、增殖性和差异化能力。 重要的是,周期较长的通道,超过10个可以增加遗传不稳定性。此外,分别为SVZ和DG细胞涂上PDL和PLD/拉米宁,对于确保在不影响分化过程的情况下,确保细胞从神经球中很好地迁移至关重要。在免疫细胞化学分析方面,PFA的潜伏时间较长,通过掩盖抗原和增加背景,会损害染色。
国家安全局是一个强大的工具,提供一致和无限的NSPCs来源,为神经发育和分化的体外研究,以及治疗目的16,17。16,事实上,这种测定可以应用于遗传和行为模型,以进一步了解NSPC增殖和分化的分子和细胞机制18,19。18,这种测定也可用于测试不同的药物和化合物20,21,2221,22以及20进行基因操纵19,23,以调节19,23NSC属性。除免疫细胞化学外,还可进行逆转录聚合酶链反应和西式斑点分析,以获取RNA和蛋白质表达,同时利用电生理研究和钙成像来评估新生神经元21的功能。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了IF/01227/2015和UID/BIM/50005/2019,Projeto Financiado pela Fundaéo a Tecnologia(FCT)/Ministério da Cióncia,Tecnologia e Ensino高级基金(MCTES)的支持。R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) 和 R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) 获得FCT研究金。作者感谢美用分子乔奥·洛博·安图内斯研究所生物成像设施的成员提供显微镜援助。
0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine Scissors – Sharp | FST | 14060-09 | |
Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
Micro Spatula – 12 cm | FST | 10091-12 | |
Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
Phosphate standard solutions, PO43 – in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |