I denne artikel beskriver vi i detaljer en protokol for generation af neurosfærekulturer fra postnatale museneurale stamceller fra de primære neurogene nicher. Neurosfærer bruges til at identificere neurale stamceller fra hjernevæv tillader estimering af prækursorcelletal. Desuden kan disse 3D-strukturer være belagt under forskellige forhold, hvilket giver anledning til neuroner, oligodendrocytter og astrocytter, så studiet af celleskæbne.
Neurosfæren assay er en yderst nyttig in vitro teknik til at studere de iboende egenskaber af neurale stamceller / progenitor celler (NSPCs), herunder spredning, selvfornyelse og multipotency. I den postnatale og voksne hjerne er NSP’er hovedsageligt til stede i to neurogene nicher: den subventrikulære zone (SVZ), der forede de laterale ventrikler og den subgranulære zone i hippocampal dentate gyrus (GD). Isoleringen af de neurogene nicher fra postnatal hjerne gør det muligt at opnå en højere mængde nSPCs i kultur med en deraf følgende fordel af højere udbytter. Den tætte kontakt mellem celler inden for hver neurosfære skaber et mikromiljø, der kan ligne neurogene nicher. Her beskriver vi i detaljer, hvordan man genererer SVZ- og DG-afledte neurosfærekulturer fra 1-3-dages gamle (P1-3) mus, samt passaging, til neurosfæreekspansion. Dette er en fordelagtig tilgang, da neurosfæren assay giver mulighed for en hurtig generation af NSPC kloner (6−12 dage) og bidrager til en betydelig reduktion i antallet af brug af dyr. Ved plating neurosfærer i differentierende betingelser, kan vi få en pseudomonolayer af celler, der består af NSPCs og differentierede celler af forskellige neurale slægter (neuroner, astrocytter og oligodendrocytes) giver mulighed for undersøgelse af handlinger iboende eller ydre faktorer på NSPC spredning, differentiering, celle overlevelse og neuritogenese.
Neurosfæren assay (NSA) blev først beskrevet i 19921,2 og stadig et unikt og kraftfuldt værktøj i neurale stamceller (NSC) forskning. Isoleringen af nscs fra de vigtigste neurogene regioner har udfordrende problemer, fordi kravene til at opretholde disse celler under fysiologiske forhold fortsat er dårligt forstået. I NSA dyrkes cellerne i et kemisk defineret serumfrit medium med tilstedeværelse af vækstfaktorer, herunder den epidermale vækstfaktor (EGF) og den grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF)1,2,3. Neurale prækursorceller (stamceller og stamafske) vælges ved hjælp af disse mitogener, da disse celler er EGF og FGF-responsive ind i en periode med aktiv spredning, mens andre celler, nemlig differentierede celler, dør4. Neurale prækursorceller vokser som neurosfærer, som derefter kan passages for yderligere at udvide puljen af disse celler5. Vigtigere, da disse neurale stamceller progenitor celler (NSPCs) er multipotente de er i stand til at differentiere ind i de tre store celletyper af centralnervesystemet (CNS): neuroner, oligodendrocytes og astrocytter5.
NSA giver en vedvarende kilde til udifferentierede CNS prækursorer, som kan bruges til at studere flere processer, herunder NSC spredning og selvfornyelse, og neuronal og glial differentiering, i både fysiologisk og sygdom sammenhæng. Desuden kan in vitro-undersøgelser bruges til at vurdere graden af iboende specifikation til stede i neurale prækursorer under udviklingen, samt at studere det fulde potentiale af cellerne, ved at fjerne ydre signaler forbundet med deres normale miljø6. Neurosfæremodellen er værdifuld til at evaluere formodede regulatorer, da ved at opretholde cellerne i et medium uden serum, de miljømæssige signaler er kun leveret af de omkringliggende celler6. Desuden er i NSA, NSPCs let udvides i kultur, tætheden af celler pr område er høj, og den heterogene sammensætning af neurosfærer har en vis lighed med in vivo nicher6. Disse veletablerede fordele er grunden til, at denne metode er blevet udbredt af mange forskere.
Følgende protokol beskriver i detaljer alle processer fra isolering af postnatal NSPC-population fra de to vigtigste neurogene regioner, subventrikulær zone (SVZ) og hippocampal dentate gyrus (DG), til udvidelse af disse celler som neurosfærer, samt til differentiering i neuroner, astrocytter og oligodendrocytes. Endelig beskrives der også forskellige analyser for at få adgang til stængelogens egenskaber for SVZ- og DG-afledte NSP’er.
In vitro-systemer af NSPCs giver en bedre forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, som kan valideres yderligere in vivo. NSA er en meget kraftfuld metode til at efterligne fysiologiske forhold på grund af deres tre-dimensionelle struktur. Desuden er dette kultursystem også teknisk lettere at kultur10, sammenlignet med andre in vitro-systemer såsom monolayer kultur system. Faktisk, med NSA, er det let at styre de eksponerede ydre signaler under celleudvikling, enten under ekspansion eller differentiering fase, ved at tilføje præcise og variable mængder af faktorer af interesse for medierne samt ved dyrkning neurosfærer med andre celletyper6. Sammenlignet med monolagskulturer er det desuden muligt at opnå en højere celletæthed fra en lille mængde væv eller med et lille antal celler, hvilket gør det muligt at udføre parallelle undersøgelser, hvilket reducerer antallet af dyr1.
NSA er den mest almindelige metode til at isolere og udvide NSCs11,,12,13, kan bruges til at vurdere antallet af prækursorceller til stede i en given vævsprøve5 og prækursorcellefrekvensen mellem forskellige betingelser. Men både neurosfærer og monolayer kulturer ikke tegner sig for quiescence NSCs14. Desuden NSA har nogle begrænsninger11,12,13 og den deraf følgende neurosfære frekvens afhænger af mange faktorer, herunder de mellemstore komponenter, dissektion procedure, dissociation proces11,12,13, og neurosfæren sammenlægning5. Faktisk, i en high-density kultur, neurosfærer tendens til at samle. Der skal derfor udvises forsigtighed ved vurdering af antallet af prækursorceller i en prøve. For at overvinde ovennævnte begrænsninger kan isolerede NSPC’er også udvides og omringes i et monolag5,15. Det er vigtigt at bruge NSA til at sammenligne prækursorcellefrekvens mellem forskellige betingelser er meget nyttigt og præcist, fordi alle disse begrænsninger er implicitte og ens blandt alle forhold, der udføres i det samme eksperiment.
Der er kritiske trin i neurosfæren kultur, der kræver opmærksomhed. I hjernen høst trin, fuldstændig fjernelse af meninges og god isolering af neurogene nicher er afgørende for at maksimere renheden og udbyttet af NSPCs. Under vævdissociation, på grund af proteolytisk aktivitet af trypsin, overdreven brug af trypsin eller længere inkubationstider kan føre til celle lysis. Desuden er dagen for passagen afgørende for at opnå en sund population af neurosfærer. Passaging neurosfærer med en diameter højere end 200 μm i høj grad påvirker levedygtighed, spredning og differentierende kapacitet NSPCs. Vigtigere, længere cyklusser af passager, mere end 10 kan øge genetisk ustabilitet6. Desuden er belægning med PDL og PLD/laminin til henholdsvis SVZ og DG-celler afgørende for at sikre god cellemigration ud af neurosfærerne uden at gå på kompromis med differentieringsprocessen. Med hensyn til immunocytokemianalyse kan længere inkubationstider med PFA kompromittere farvning ved at maskere antigenerne og øge baggrunden.
NSA er et kraftfuldt værktøj til at give en konsekvent og en ubegrænset kilde til NSPCs for in vitro undersøgelser af neurale udvikling og differentiering samt til terapeutiske formål16,17. Faktisk kan denne analyse anvendes på genetiske og adfærdsmæssige modeller for yderligere at forstå de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i NSPC spredning og differentiering18,19. Denne analyse er også nyttigt at teste forskellige lægemidler og forbindelser20,21,22 samt at udføre genetiske manipulationer19,23 at modulere NSC egenskaber. Ud over immuncytokemi kan der udføres omvendt transskriptionspolymerasekædereaktion og vestlig blotanalyse for at få adgang til RNA og proteinekspression, mens elektrofysiologiske undersøgelser og calciumbilleddannelse kan bruges til at evaluere funktionen af de nyfødte neuroner21.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af IF/01227/2015 og UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) og R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) modtog et stipendium fra FCT. Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af bioimaging facilitet på Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes for mikroskopi bistand.
0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine Scissors – Sharp | FST | 14060-09 | |
Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
Micro Spatula – 12 cm | FST | 10091-12 | |
Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
Phosphate standard solutions, PO43 – in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |