इस लेख में, हम मुख्य माउस न्यूरोजेनिक निकस से प्राप्त प्रसवोत्तर माउस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं। न्यूरोस्फीयर का उपयोग मस्तिष्क के ऊतकों से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है जो अग्रदूत कोशिका संख्याओं के अनुमान की अनुमति देता है। इसके अलावा, इन 3 डी संरचनाओं को विभेदक परिस्थितियों में चढ़ाया जा सकता है, न्यूरॉन्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स को जन्म देते हुए, सेल भाग्य के अध्ययन की अनुमति देता है।
न्यूरोस्फीयर परख प्रसार, आत्म-नवीकरण और बहुशक्ति सहित तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाओं (एनएसपीसी) के अंतर्निहित गुणों का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी इन विट्रो तकनीक है । प्रसवोत्तर और वयस्क मस्तिष्क में, एनएसपीसी मुख्य रूप से दो न्यूरोजेनिक निकस में मौजूद हैं: सबवेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) पार्श्व वेंट्रिकल्स और हिप्पोकैम्पल डेनटेट जाइरस (डीजी) के उपकणीय क्षेत्र को अस्तर। प्रसवोत्तर मस्तिष्क से न्यूरोजेनिक निकस का अलगाव उच्च पैदावार के परिणामस्वरूप लाभ के साथ संस्कृति में एनएसपीसी की उच्च मात्रा प्राप्त करने की अनुमति देता है। प्रत्येक न्यूरोस्फीयर के भीतर कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ संपर्क एक सूक्ष्म वातावरण बनाता है जो न्यूरोजेनिक निकस जैसा हो सकता है। यहां, हम विस्तार से वर्णन करते हैं कि न्यूरोस्फीयर विस्तार के लिए 1−3 दिन पुराने (पी1−3) चूहों से एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को कैसे उत्पन्न किया जाए, साथ ही पासिंग िंग करें। यह एक लाभप्रद दृष्टिकोण है क्योंकि न्यूरोस्फीयर परख एनएसपीसी क्लोन (6−12 दिनों) की तेज पीढ़ी की अनुमति देता है और पशु उपयोग की संख्या में महत्वपूर्ण कमी करने में योगदान देता है। अंतर परिस्थितियों में न्यूरोस्फीयर चढ़ाना करके, हम एनएसपीसी से बनी कोशिकाओं और विभिन्न तंत्रिका वंशों (न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स) की विभेदित कोशिकाओं की एक छद्म मोनोलेयर प्राप्त कर सकते हैं, जो एनएसपीसी प्रसार, अंतर, कोशिका अस्तित्व और न्यूरिस्टोजेनेसिस पर आंतरिक या एक्सट्रंसिक कारकों के कार्यों के अध्ययन की अनुमति देते हैं।
न्यूरोस्फीयर परख (एनएसए) सबसे पहले 19921,,2 में वर्णित किया गया था और अभी भी तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) अनुसंधान में एक अद्वितीय और शक्तिशाली उपकरण बना हुआ है। मुख्य न्यूरोजेनिक क्षेत्रों से एनएससी के अलगाव में चुनौतीपूर्ण मुद्दे हैं क्योंकि शारीरिक परिस्थितियों में इन कोशिकाओं को बनाए रखने की आवश्यकताएं खराब समझमें आती हैं । एनएसए में, कोशिकाओं को एक रासायनिक रूप से परिभाषित सीरम-मुक्त माध्यम में एपिडर्मल विकास कारक (ईजीएफ) और मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ)1,,2,,3सहित विकास कारकों की उपस्थिति के साथ सुसंस्कृत किया जाता है। इन माइटोजन का उपयोग करके तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (स्टेम और जनक) का चयन किया जाता है क्योंकि ये कोशिकाएं ईजीएफ और एफजीएफ-उत्तरदायी सक्रिय प्रसार की अवधि में प्रवेश करती हैं जबकि अन्य कोशिकाएं, अर्थात् विभेदित कोशिकाएं,4मर जाती हैं। तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाएं न्यूरोस्फीयर के रूप में बढ़ती हैं, जिन्हें इन कोशिकाओं5के पूल को और विस्तारित करने के लिए पारित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, चूंकि ये तंत्रिका स्टेम जनक कोशिकाएं (एनएसपीसी) बहुशक्तिशाली हैं, इसलिए वे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के तीन प्रमुख कोशिका प्रकारों में अंतर करने में सक्षम हैं: न्यूरॉन्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स5।
एनएसए अविभेदित सीएनएस अग्रदूतका एक नवीकरणीय स्रोत प्रदान करता है, जिसका उपयोग शारीरिक और रोग दोनों संदर्भ में एनएससी प्रसार और आत्म-नवीकरण, और न्यूरोनल और ग्लियल भेदभाव सहित कई प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । इसके अलावा, इन विट्रो अध्ययनों का उपयोग विकास के दौरान तंत्रिका अग्रदूतों में मौजूद आंतरिक विशिष्टता की डिग्री का मूल्यांकन करने के साथ-साथ कोशिकाओं की पूरी क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही उनके सामान्य वातावरण से जुड़े बाह्य संकेतों को हटाकर6। न्यूरोस्फीयर मॉडल ख्यात नियामकों का मूल्यांकन करने के लिए मूल्यवान है क्योंकि सीरम से रहित माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखकर, पर्यावरणीय संकेत केवल आसपास की कोशिकाओं द्वारा प्रदान किए जाते हैं6। इसके अलावा, एनएसए में, एनएसपीसी को आसानी से संस्कृति में विस्तारित किया जाता है, प्रति क्षेत्र कोशिकाओं का घनत्व अधिक होता है और न्यूरोस्फीयर की विषम संरचना में वीवो निकस6में कुछ समानता होती है। ये अच्छी तरह से स्थापित लाभ कारण है कि इस पद्धति व्यापक रूप से कई शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है ।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल दो मुख्य न्यूरोजेनिक क्षेत्रों, उपवेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) और हिप्पोकैम्पल डेनटेट जायरस (डीजी) से प्रसवोत्तर एनएसपीसी आबादी के अलगाव से सभी प्रक्रियाओं का विस्तार करता है, न्यूरोस्फीयर के रूप में उन कोशिकाओं के विस्तार के साथ-साथ न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स में अंतर के लिए। अंत में, एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न एनएसपीसी के स्टेमनेस और मल्टीपोटेंसी गुणों तक पहुंचने के लिए विभिन्न परखों का भी वर्णन किया गया है ।
एनएसपीसी की इन विट्रो प्रणालियां सेलुलर और आणविक तंत्र ों की बेहतर समझ की अनुमति देती हैं, जिसे वीवो में और मान्य किया जा सकता है। एनएसए अपने त्रिआयामी ढांचे के कारण शारीरिक परिस्थितियों की नकल करने का एक बहुत शक्तिशाली तरीका है । इसके अलावा, इस संस्कृति प्रणाली को तकनीकी रूप से10संस्कृति के लिए भी आसान है, मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली जैसे अन्य इन विट्रो प्रणालियों की तुलना में। दरअसल, एनएसए के साथ, सेल विकास के दौरान उजागर बाह्य संकेतों को नियंत्रित करना आसान है, या तो विस्तार या भेदभाव चरण के दौरान, मीडिया के लिए ब्याज के कारकों की सटीक और चर मात्रा को जोड़कर और साथ ही अन्य सेल प्रकार6के साथ न्यूरोस्फीयर को संजोकर। इसके अलावा, एनएसए में मोनोलेयर संस्कृतियों की तुलना में, थोड़ी मात्रा में ऊतक या छोटी संख्या में कोशिकाओं के साथ उच्च कोशिका घनत्व प्राप्त करना संभव है, जिससे समानांतर अध्ययन किए जा सकते हैं, इस प्रकार जानवरों की संख्या कम हो जाती है1।
एनएसए एनएससी11,,12,,13को अलग-थलग और विस्तारित करने का सबसे आम तरीका है, जिसका उपयोग किसी दिए गए ऊतक नमूने5 में मौजूद अग्रदूत कोशिकाओं की संख्या और विभिन्न स्थितियों के बीच अग्रदूत कोशिका आवृत्ति का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है । हालांकि, न्यूरोस्फीयर और मोनोलेयर दोनों संस्कृतियां14से मतभेद नहीं करती हैं। इसके अलावा, एनएसए की कुछ सीमाएं11,12,,13 हैं और परिणामस्वरूप न्यूरोस्फीयर फ्रीक्वेंसी मध्यम घटकों, विच्छेदन प्रक्रिया, विच्छेदन प्रक्रिया11,5,12,,13और न्यूरोस्फीयर एग्रीग्रेशन 5 सहित कई कारकों पर निर्भर करती है । दरअसल, एक उच्च घनत्व संस्कृति में, न्यूरोस्फीयर कुल करते हैं। नतीजतन, एक नमूने में अग्रदूत कोशिकाओं की संख्या का आकलन करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए। उपरोक्त सीमाओं को दूर करने के लिए, अलग-थलग पड़े एनएसपीसी का विस्तार किया जा सकता है और मोनोलेयर5,15में पारित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, एनएसए का उपयोग करने के लिए विभिन्न स्थितियों के बीच अग्रदूत सेल आवृत्ति की तुलना बहुत उपयोगी और सटीक है क्योंकि इन सभी सीमाओं अंतर्निहित और सभी एक ही प्रयोग में प्रदर्शन शर्तों के बीच समान हैं.
न्यूरोस्फीयर संस्कृति में महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर ध्यान देने की आवश्यकता है। मस्तिष्क संचयन चरण में, एनएसपीसी की शुद्धता और उपज को अधिकतम करने के लिए मेनिंग्स को पूरी तरह से हटाना और न्यूरोजेनिक निकस का अच्छा अलगाव आवश्यक है। ऊतक विच्छेदन के दौरान, ट्राइप्सिन की प्रोटेलिटिक गतिविधि के कारण, ट्राइप्सिन या इनक्यूबेशन समय का अत्यधिक उपयोग कोशिका लिसिस का कारण बन सकता है। इसके अलावा, पारित होने का दिन न्यूरोस्फीयर की स्वस्थ आबादी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। 200 माइक्रोन से अधिक व्यास वाले न्यूरोस्फीयर को एनपीपीसी की व्यवहार्यता, प्रसारशील और विभेदक क्षमता को बहुत प्रभावित करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि मार्ग के लंबे चक्र, 10 से अधिक आनुवंशिक अस्थिरता6को बढ़ा सकते हैं। इसके अलावा, भेदभाव प्रक्रिया से समझौता किए बिना न्यूरोस्फीयर से बाहर अच्छे सेल माइग्रेशन को सुनिश्चित करने के लिए क्रमशः एसवीजेड और डीजी कोशिकाओं के लिए पीडीएल और पीएलडी/लेमिनिन के साथ कोटिंग आवश्यक है । इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री एनालिसिस के लिहाज से पीएफए के साथ अब इनक्यूबेशन बार एंटीजन को मास्किंग करके और बैकग्राउंड बढ़ाकर धुंधला करने से समझौता कर सकते हैं ।
एनएसए तंत्रिका विकास और भेदभाव के साथ – साथ चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए16,17के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एनएसपीसी का एक सुसंगत और असीमित स्रोत प्रदान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । दरअसल, एनएसपीसी प्रसार और भेदभाव18,,19में शामिल आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने के लिए इस परख को आनुवंशिक और व्यवहार मॉडलों पर लागू किया जा सकता है। यह परख एनएससी गुणों को मिलाने के लिए विभिन्न दवाओं और यौगिकों20,,21,,22 के साथ-साथ आनुवंशिक जोड़तोड़19,,23 को करने के लिए भी उपयोगी है। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के अलावा, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन और वेस्टर्न ब्लॉट एना और प्रोटीन एक्सप्रेशन तक पहुंचने के लिए वेस्टर्न ब्लॉट एना किया जा सकता है, जबकि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल स्टडीज और कैल्शियम इमेजिंग का इस्तेमाल नवजात न्यूरॉन्स21के फंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को आईएफ/01227/2015 और यूआईडी/बीआईएम/50005/2019 ने समर्थन दिया था, प्रोजेटो फिनांसिडो पेला फंडाकाओ पैरा ए सिएनसिया ई ए टेक्नोलोगिया (एफसीटी)/मिनीस्टेरियो दा सिएनसिया, टेक्नोलोजिया ई एनसिनो सुपीरियर (एमसीटीईएस) एट्रावेस डी फंडोस डो ओरकामेंटो डी एस्टाडो । आरएस (एसएफआरएच/बीडी/128280/2017, एफएफआर (आईएमएम/सीटी/35-2018), डी.एम.एल. (पीडी/बीडी/141784/2018), और आर.एस.आर. (एसएफआर/बीडी/129710/2017) को एफसीटी से फेलोशिप मिली। लेखक माइक्रोस्कोपी सहायता के लिए इंस्टीटो डी मेडिसिना मॉलिक्यूलर जोआओ लोबो एंट्यून्स में बायोइमेजिंग सुविधा के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं।
0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine Scissors – Sharp | FST | 14060-09 | |
Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
Micro Spatula – 12 cm | FST | 10091-12 | |
Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
Phosphate standard solutions, PO43 – in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |