本稿では、主マウス神経原性ニッチ由来の出生後マウス神経幹細胞から神経球培養を生成するためのプロトコルについて詳細に述べる。神経球は、脳組織から神経幹細胞を同定するために使用され、前駆細胞数の推定を可能にする。さらに、これらの3D構造は分化条件でメッキすることができ、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを生じさせ、細胞運命の研究を可能にする。
神経球アッセイは、増殖、自己再生、多能性を含む神経幹細胞/前駆細胞(NCC)の固有の特性を研究するための非常に有用なインビトロ技術です。出生後および成人の脳では、NCCは主に2つの神経新生ニッチに存在する:側心室を裏打ちする脳室帯(SVZ)と海馬デンテート回(DG)のサブ顆粒帯。出生後の脳からの神経原性ニッチの分離は、より高い収率の結果的な利点を有する培養中のNCCのより高い量を得ることを可能にする。各神経圏内の細胞間の密接な接触は、神経起源のニッチに似ている可能性のある微小環境を作成します。ここでは、1-3日齢(P1-3)マウスからSVZおよびDG由来の神経球培養を生成する方法と、経大体による神経球の拡張について詳しく説明します。これは、神経圏アッセイにより、NSPCクローンの高速生成(6-12日)が可能であり、動物の使用数の大幅な減少に寄与するため、有利なアプローチです。分化条件で神経球をめっきすることにより、NSPCと異なる神経系統(ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト)の分化細胞で構成される細胞の擬似単層を得ることができ、NSPC増殖、分化、細胞生存および腎生異に対する固有または外因性因子の作用の研究を可能にする。
神経球アッセイ(NSA)は、1992年1年、22年に最初に説明され、神経幹細胞(NSC)研究におけるユニークで強力なツールのままです。主な神経原性領域からのNSCの分離は、生理学的状態でこれらの細胞を維持するための要件が十分に理解されていないので、困難な問題を抱えています。NSAにおいて、細胞は、表皮成長因子(EGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)1、2、3を含む増殖因子の存在を有する化学的に定義1,2,3された無血清培地で培養される。神経前駆細胞(幹細胞および前駆細胞)は、これらの細胞がEGFおよびFGF応答性の期間に入り活性増殖の期間であるので、これらのマイトゲンを用いて選択され、他の細胞、すなわち分化した細胞は、死ぬ4である。神経前駆細胞は神経球として増殖し、その後、これらの細胞のプールをさらに拡大するために通過することができる5.重要なことに、これらの神経幹細胞前駆細胞(NCC)は多能であるため、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイト5の3つの主要な細胞型(CNS)に分化することができる。
NSAは、生理学的および疾患の文脈の両方で、NSC増殖および自己再生、および神経およびグリア分化を含むいくつかのプロセスを研究するために使用することができる未分化CNS前駆体の再生可能な供給源を提供する。さらに、インビトロ研究は、開発中の神経前駆体に存在する固有の仕様の程度を評価し、細胞の全能力を研究し、それらの正常な環境6に関連する外因性の手がかりを除去することによって使用することができる。神経球モデルは、血清を欠いた培地中に細胞を維持することによって、環境キューが周囲の細胞6によってのみ提供されるので、推定調節因子を評価するのに価値がある。さらに、NSAでは、NSPCは培養中に容易に拡大され、領域あたりの細胞の密度が高く、神経圏の不均一な組成はインビボニッチ6といくつかの類似性を有する。これらの確立された利点は、この方法論が多くの研究者によって広く使用されている理由です。
以下のプロトコルは、2つの主要な神経原性領域(脳室領域(SVZ)および海馬樹状回(DG)からの出生後NSPC集団の単離から、神経球としての細胞の拡大、ならびにニューロン、星細胞およびオリゴデンドロサイトへの分化に関する全てのプロセスを詳細に記述する。最後に、SVZおよびDG由来のNCCsのステムおよび多能性特性にアクセスするために、異なるアッセイも記載されている。
Nccsのインビトロシステムは、細胞および分子機構のより良い理解を可能にし、生体内でさらに検証することができる。NSAは、その三次元構造による生理学的状態を模倣する非常に強力な方法です。また、この培養系は、単層培養系などの他のインビトロ系と比較して、技術的に培養10に対しても容易である。実際、NSAを用いると、細胞の発達中に露出した外因性の手がかりを制御することは容易であり、拡張または分化段階の間に、メディアに関心のある因子の正確かつ可変量を加えるだけでなく、他の細胞タイプ6で神経球を培養することによって。さらに、単層培養と比較して、NSAでは、少量の組織から、または少数の細胞からより高い細胞密度を得ることができ、並行研究を行うことを可能にし、したがって動物の数を減少させる1。
NSAは、NSC11、12、1311を単離および拡張する最も一般的な方法であり、12,13異なる条件間の所定の組織サンプル5および前駆体細胞頻度に存在する前駆細胞の数を推定するために使用することができる。しかし、神経圏と単層培養はどちらも静止NSC14を考慮していない。また、NSAはいくつかの制限を有する11、12、1312,13および結果として生じる神経圏周波数は、培地成分を含む多くの要因に依存し、解剖手順、解11離プロセス1111、12、13、及び神経圏凝集,12,135。確かに、高密度培養では、神経球は凝集する傾向がある。したがって、サンプル内の前駆細胞の数を推定する際には注意が必要です。上記の制限を克服するために、単一層,5、15に分離されたNCCsを拡張し5、継代することもできる。重要なのは、NSAを使用して異なる条件間で前駆細胞周波数を比較することは非常に有用であり、正確であり、これらの制限はすべて同じ実験で行われるすべての条件の間で暗黙的かつ類似しているためです。
神経圏文化には注意が必要な重要なステップがあります。脳の収穫ステップでは、髄液の完全な除去と神経原性ニッチの良好な分離は、NCCsの純度と収率を最大化するために不可欠です。組織解離の間、トリプシンのタンパク質分解活性のために、トリプシンまたはより長いインキュベーション時間の過剰な使用は、細胞のライシスを引き起こす可能性がある。さらに、通過の日は、神経球の健全な集団を得るために重要です。直径が200μmを超える通過性神経球は、NCCsの生存率、増殖および分化能力に大きく影響する。6さらに、SVZ細胞およびDG細胞用PDLおよびPLD/ラミニンをコーティングすることは、分化プロセスを損なうことなく神経球から良好な細胞移動を確実にするために不可欠です。免疫細胞化学分析の観点から、PFAによるインキュベーション時間が長いと、抗原をマスキングし、背景を増加させることで染色を損なう可能性があります。
NSAは、神経発達と分化のインビトロ研究のためだけでなく、治療目的のために、一貫した無制限のNSPCsを提供するための強力なツールです16,,17.実際、このアッセイは、NSPC増殖および分化18,19,19に関与する分子および細胞機構をさらに理解するために、遺伝的および行動モデルに適用することができる。このアッセイはまた、異なる薬物および化合物20、21、2221,22を試験するとともに、NSC特性を調節するために遺伝子操作19、23,23を行う場合にも有用である。20免疫細胞化学に加えて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応およびウェスタンブロット分析はRNAおよびタンパク質発現にアクセスするために行うことができるが、一方、電気生理学的研究およびカルシウムイメージングは、新生ニューロン21の機能を評価するために使用することができる。
The authors have nothing to disclose.
この作業は、IF/01227/2015 および UID/BIM/50005/2019 によってサポートされました。 プロジェト・フィナンシアド・ペラ・フンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア(FCT)/ミニステリオ・ダ・シエンシア、テクノロジア・エ・エンシーノ・スーペリア(MCTES)アトラベス・デ・ファンドス・ド・オルサメント・デ・エスタド。R.S.(SFRH/BD/128280/2017、F.F.R.(IMM/CT/35-2018)、D.M.L.(PD/BD/141784/2018)、R.S.R.(SFRH/BD/129710/2017)から受け取りました。著者らは、医学研究所のバイオイメージング施設のメンバーに、顕微鏡の支援を求めて感謝したいと考えています。
0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine Scissors – Sharp | FST | 14060-09 | |
Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
Micro Spatula – 12 cm | FST | 10091-12 | |
Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
Phosphate standard solutions, PO43 – in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |