이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.
신경구 분석법은 증식, 자기 갱신 및 다능성을 포함하는 신경 줄기/전구 세포 (NSPC)의 고유 특성을 연구하기 위한 매우 유용한 시험관 내 기술입니다. 산후 및 성인 두뇌에서, NSPC는 2개의 신경성 틈새에 주로 존재합니다: 심실 영역 (SVZ) 외측 심실 및 해마 치과 자이러스의 자궁 내부 영역 (DG). 출생 후 뇌에서 신경 성 틈새 의 격리 는 더 높은 수율의 결과적인 이점과 문화에서 NSPC의 높은 금액을 얻을 수 있습니다. 각 신경구 내의 세포 사이 가까운 접촉은 신경성 틈새 시장을 닮을 수 있는 미세 환경을 만듭니다. 여기서, 우리는 1-3 일 (P1−3) 마우스에서 SVZ- 및 DG 유래 신경구 배양권뿐만 아니라, 신경구 확장을 위한 통과를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이것은 신경구 분석실험이 NSPC 클론(6-12일)의 빠른 생성을 허용하고 동물 사용의 수를 현저하게 감소시키기 때문에 유리한 접근법이다. 분화 한 조건에서 신경 구를 도금함으로써, 우리는 NSPC 증식, 분화, 세포 생존 및 신생에 대한 본질적 또는 외인적 인자의 행동을 연구 할 수 있도록 NSPC와 다른 신경 계보 (뉴런, 성상 세포 및 올리고드로시스트)의 분화 된 세포로 구성된 세포의 의사 단독 층을 얻을 수 있습니다.
신경구 분석 (NSA)는 1992년1,,2에서 처음 기술되었으며 여전히 신경 줄기 세포 (NSC) 연구에서 독특하고 강력한 도구로 남아 있습니다. 주요 신경 발생 지역에서 신경 세포의 격리는 생리적 조건에서 이러한 세포를 유지하기 위한 요구 사항이 제대로 이해되지 않아 어려운 문제가 있습니다. NSA에서, 세포는 표피 성장 인자(EGF) 및 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함하는 성장 인자의 존재와 함께 화학적으로 정의된 무혈청 배지에서 배양된다1,,2,,3. 신경 전구체 세포(stem 및 전구체)는 이들 세포가 EGF 및 FGF-반응성 다른 세포, 즉 분화세포, 즉 분화세포, 다이4동안활성 증식의 기간에 진입하기 때문에 이들 미토겐을 이용하여 선택된다. 신경 전구체 세포는 신경구로서 성장하며, 이는 이들 세포의 풀을 더 확장하기 위해 통과될 수 있다5. 중요한 것은, 이들 신경줄기 전구세포(NSPC)가 다능하기 때문에 중추신경계(CNS)의 3대 세포 유형으로 분화할 수 있다:뉴런, 올리고헨드로시트 및 성상세포5.
NSA는 생리학적 및 질병 맥락에서 NSC 증식 및 자기 갱신, 신경 및 신경교 분화를 포함한 여러 프로세스를 연구하는 데 사용할 수 있는 미분화 CNS 전구체의 재생 가능한 공급원을 제공합니다. 더욱이, 시험관내 연구는 발달 동안 신경 전구체에 존재하는 본질적인 명세의 정도를 평가하고, 세포의 완전한 잠재력을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 그들의 정상 환경과 관련된 외적 단서를 제거함으로써6. 신경구 모델은 혈청이 없는 배지에서 세포를 유지함으로써, 환경 큐는 주변세포6에의해서만 제공되기 때문에 가제 조절제를 평가하는 데 유용하다. 더욱이, NSA에서 NSPC는 배양에서 용이하게 확장되고, 영역당 세포의 밀도가 높고, 신경구의 이질적인 조성은 생체 내 틈새와 약간의 유사성을 갖는다6. 이러한 잘 확립 된 장점은이 방법론이 많은 연구자들에 의해 널리 사용되는 이유입니다.
다음 프로토콜은 두 가지 주요 신경 발생 영역, 심실 영역 (SVZ) 및 해마 치과 자이러스 (DG)에서 산후 NSPC 집단의 격리에서부터 신경 구체로서의 세포의 확장뿐만 아니라 뉴런, 성상 세포 및 올리고덴드로질로의 분화에 이르기까지 모든 과정을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 상이한 세포는 또한 SVZ- 및 DG 유래 NSPC의 줄기 및 다기능 특성에 접근하기 위해 기술된다.
NSPC의 체외 시스템은 세포 및 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있으며, 이는 생체 내에서 더 검증될 수 있습니다. NSA는 그들의 3 차원 구조 때문에 생리적인 조건을 모방하는 아주 강력한 방법입니다. 더욱이, 이러한 배양 시스템은 또한 단층 배양 시스템과 같은 다른 시험관 내 시스템과 비교하여 기술적으로배양(10)이더 쉽다. 실제로, NSA를 사용하면, 세포 발달 동안 노출된 외인성 단서를 조절하기 쉬우며, 확장 또는 분화 단계 동안, 다른 세포 유형으로 신경구를 배양함으로써 뿐만 아니라 미디어에 관심 요인의 정확하고 가변적인 양을 추가함으로써6. 더욱이, 단층 배양에 비해, NSA에서, 소량의 조직 또는 소수의 세포로부터 더 높은 세포 밀도를 얻을 수 있으며, 병렬 연구가 수행될 수 있게 하여, 따라서 동물의 수를 감소시킨다1.
NSA는 NSCs11,,12,,13을분리하고 확장하는 가장 일반적인 방법이며, 주어진 조직 샘플5및 상이한 조건 사이의 전구체 세포 빈도에 존재하는 전구체 세포의 수를 추정하는데 사용될 수 있다. 그러나, 신경구와 단층 문화 둘 다 정지 NSCs14를고려하지 않습니다. 더욱이, NSA는11,,12,,13 및 생성된 신경구 주파수는 배지 성분, 해부 절차, 해리 과정11,12,,13,및 신경구 응집5를포함하는 많은 인자에 의존한다., 실제로, 고밀도 문화에서, 신경구는 집합하는 경향이 있습니다. 따라서 샘플에서 전구체 셀수를 추정할 때는 주의해야 합니다. 위의 한계를 극복하기 위해, 분리된 NSPC는 또한 단층5,,15로확장 및 통과될 수 있다. 중요한 것은, NSA를 사용하여 서로 다른 조건 들 사이에서 전구체 세포 주파수를 비교하는 것은 이 모든 한계가 암시적이고 동일한 실험에서 수행된 모든 조건 사이에서 유사하기 때문에 매우 유용하고 정확합니다.
주의가 필요한 신경구 문화에는 중요한 단계가 있습니다. 뇌 수확 단계에서, 수막의 완전한 제거와 신경 성 틈새의 좋은 격리는 NSPC의 순도와 수율을 극대화하는 데 필수적입니다. 조직 해리 동안, 트립신의 프로테올분해 활성으로 인해, 트립신의 과도한 사용 또는 더 긴 배양 시간은 세포 용해로 이어질 수 있습니다. 또한, 통로의 날은 신경 구의 건강한 인구를 얻기 위해 중요합니다. 직경이 200 μm 보다 높은 신경구를 통과하는 것은 NSPC의 생존성, 증식 및 분화 능력에 크게 영향을미칩니다. 또한 SVZ 및 DG 세포에 대한 PDL 및 PLD/라미닌코팅은 분화 과정을 손상시키지 않으면서 신경구에서 좋은 세포 이동을 보장하는 데 필수적입니다. 면역 세포 화학 분석의 관점에서, PFA를 가진 더 긴 배양 시간은 항원을 마스킹하고 배경을 증가시킴으로써 염색을 손상시킬 수 있습니다.
NSA는 신경 발달 및 분화뿐만 아니라 치료목적16,,17의시험관 내 연구를 위한 일관되고 무제한의 NSPC 소스를 제공하는 강력한 도구이다. 실제로, 이러한 분석은 NSPC 증식 및 분화에 관여하는 분자 및 세포 기전을 더욱 이해하기 위해 유전적 및 행동 모델에 적용될 수있다 18,,19. 이러한 분석실험은 NSC 특성을 조절하기 위해 다른 약물 및 화합물,23 20,,21,,22뿐만 아니라 유전자 조작을 수행하는데에도유용하다. 면역세포화학 이외에, 역전사 중합효소 연쇄 반응 및 웨스턴 블롯 분석은 RNA 및 단백질 발현에 접근하기 위해 수행될 수 있으며, 전기생리학 연구 및 칼슘 이미징은 신생뉴런21의기능을 평가하는데 사용될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 IF/01227/2015 및 UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018), 그리고 R.S.R.(SFRH/BD/129710/2017)에서 FC십을 받았습니다. 저자는 현미경 검사법 지원을 위한 Instituto de Medicina 분자 João Lobo Antunes에 있는 생물 화상 진찰 시설의 일원에게 감사하고 싶습니다.
0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine Scissors – Sharp | FST | 14060-09 | |
Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
Micro Spatula – 12 cm | FST | 10091-12 | |
Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
Phosphate standard solutions, PO43 – in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |