Hyperspectrale beeldvorming als een instrument om optische anisotropie te bestuderen in op Lanthanide gebaseerde moleculaire enkele kristallen

Summary

Hier presenteren we een protocol om luminescente hyperspectrale beeldvormingsgegevens te verkrijgen en optische anisotropiekenmerken van op lantithaan gebaseerde enkelvoudige kristallen te analyseren met behulp van een Hyperspectral Imaging System.

Abstract

In dit werk beschrijven we een protocol voor een nieuwe toepassing van hyperspectrale beeldvorming (HSI) in de analyse van lichtgevende lanthanide (Ln³⁺)-gebaseerde moleculaire enkele kristallen. Als representatief voorbeeld kozen we voor één kristal van het heterodinucleaire Ln-gebaseerde complex [TbEu(bpm)(tfaa)₆] (bpm=2,2'-bipyrimidine, tfaa^– =1,1,1-trifluoracetylaceaceatte) met een heldere zichtbare emissie onder UV-excitatie. HSI is een opkomende techniek die 2-dimensionale ruimtelijke beeldvorming van een lichtgevende structuur combineert met spectrale informatie van elke pixel van het verkregen beeld. Specifiek, HSI op enkele kristallen van de [Tb-Eu] complex verstrekt lokale spectrale informatie onthullen variatie van de luminescentie intensiteit op verschillende punten langs de bestudeerde kristallen. Deze veranderingen werden toegeschreven aan de optische anisotropie aanwezig in het kristal, die het gevolg is van de verschillende moleculaire verpakking van Ln^{3 +} ionen in elk van de richtingen van de kristalstructuur. De beschreven HSI is een voorbeeld van de geschiktheid van een dergelijke techniek voor spectro-ruimtelijke onderzoeken van moleculaire materialen. Maar, belangrijk, dit protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid voor andere soorten lichtgevende materialen (zoals moleculaire kristallen ter grootte van micron-formaat, anorganische microdeeltjes, nanodeeltjes in biologische weefsels, of gelabelde cellen, onder andere), het openen van vele mogelijkheden voor dieper onderzoek van structuur-eigendom relaties. Uiteindelijk zullen dergelijke onderzoeken kennis verschaffen die moet worden ingezet bij de engineering van geavanceerde materialen voor een breed scala aan toepassingen, van bioimaging tot technologische toepassingen, zoals golfgidsen of opto-elektronische apparaten.

Introduction

Hyperspectrale beeldvorming (HSI) is een techniek die een ruimtelijke kaart genereert waarbij elke x-y coördinaat een spectrale informatie bevat die gebaseerd kan zijn op elke vorm van spectroscopie, namelijk fotoluminescentie, absorptie en verstrooiing van spectroscopies^1,2,3. Als gevolg hiervan wordt een 3-dimensionale set gegevens (ook wel "hyperspectrale kubus" genoemd) verkregen, waarbij de x-y coördinaten de ruimtelijke assen zijn en de z-coördinaat de spectrale informatie uit het geanalyseerde monster. z Daarom bevat de hyperspectrale kubus zowel ruimtelijke als spectrale informatie, die een gedetailleerder spectroscopisch onderzoek van het monster biedt dan traditionele spectroscopie. Hoewel HSI al jaren bekend staat op het gebied van teledetectie (bijvoorbeeld., geologie, voedingsindustrie^4),ontpopte het zich onlangs als een innovatieve techniek voor de karakterisering van nanomaterialen^2,5 of sondes voor biomedische toepassingen^3,6,7,8. Over het algemeen is het niet beperkt tot het UV/visible/near-infrared (NIR) domein, maar kan het ook worden uitgebreid met behulp van andere stralingsbronnen, zoals röntgenstralen – bijvoorbeeld om elementaire verdeling in verschillende materialen te karakteriseren⁹ – of Terahertz-straling, waarbij HSI werd gebruikt om thermische detectie uit te voeren in biologische weefsels⁸. Verder is fotoluminescentie mapping gecombineerd met Raman mapping om de optische eigenschappen van monolayer MoS₂¹⁰te onderzoeken. Onder de gerapporteerde toepassingen van optische HSI zijn er echter nog maar een paar voorbeelden op HSI van op lantide gebaseerde materialen^{11,12,13,14,15,16,17}. Zo kunnen we bijvoorbeeld aanhalen: detectie van kanker in weefsels^6,analyse van de lichtpenetratiediepte in biologische weefsels⁷, multiplexed biologische beeldvorming^3,analyse van multicomponent energieoverdracht in hybride systemen¹¹, en onderzoek naar aggregatie-geïnduceerde veranderingen in spectroscopische eigenschappen van upconverting nanodeeltjes¹². Het is duidelijk dat de aantrekkelijkheid van HSI voortkomt uit de geschiktheid voor het genereren van kennis over omgevingsspecifieke luminescentie, waardoor gelijktijdige ruimtelijke en spectrale informatie over de sonde wordt verstrekt.

Gebruikmakend van deze krachtige techniek beschrijven we hierin een protocol om de optische anisotropie van de heterodinucleaire Tb³⁺-Eu³⁺ single crystal [TbEu(bpm)(tfaa)₆] te onderzoeken (Figuur 1a)¹³. De optische anisotropie waargenomen vloeide uit de verschillende moleculaire verpakking van de Ln³⁺ ionen in de verschillende kristallografische richtingen voort (Figuur 1b),resulterend in sommige kristalgezichten die helderder tonen, anderen die dimmer photoluminescentie tonen. Er werd gesuggereerd dat de verhoogde luminescentieintensiteit bij specifieke gezichten van het kristal werd gecorreleerd met een efficiëntere energieoverdracht langs die kristallografische richtingen waar de Ln³⁺··· Ln^{3 +} ion afstanden waren de kortste¹³.

Gemotiveerd door deze resultaten stellen we voor om een gedetailleerde methodologie op te zetten om optische anisotropie te analyseren via HSI, waardoor het pad wordt geopend voor een beter begrip van ion-ionenenergieoverdrachtsprocessen en tunable luminescente eigenschappen die voortvloeien uit specifieke moleculaire regeling^18,19. Deze structuur-eigenschappen relaties zijn erkend als belangrijke aspecten voor innovatieve optische materialen ontwerp met inbegrip van, maar niet beperkt tot waveguide systemen en opto-magnetische opslag apparaten op nano-en microschaal - het aanpakken van de vraag naar efficiëntere en geminiaturiseerde optische systemen²⁰.

Protocol

LET OP: Het wordt aanbevolen om een veiligheidsbril te gebruiken die specifiek is voor de excitatiegolflengte die te allen tijde wordt gebruikt bij het bedienen van de imager.

1. Configuratie van de hyperspectrale microscoop

OPMERKING: Een overzicht van het hyperspectrale beeldvormingssysteem wordt gegeven in figuur 2a,waarbij de belangrijkste componenten van de imager worden beschreven. Het beeldbeeldsysteem kan worden gebruikt voor de detectie van de zichtbare of nabij-infrarode (NIR) emissie van een monster. Afhankelijk van welke detectie gewenst is (zichtbaar of NIR), gaat het licht door twee verschillende lichtpaden (Figuur 2e). Een combinatie van verschillende bundeldraaikubussen en dichroische filterkubussen (optische kubussen) moet op specifieke posities in het instrument worden geplaatst om het betreffende pad te selecteren.

1. Stroom op de computer die is aangesloten op het beeldvormingssysteem. Schakel de monitor van de computer in.
2. Stel de juiste optische kubusconfiguratie in (figuur 2b,c).
   OPMERKING: Hier wordt de imager configuratie(optische kubusconfiguratie)voor HSI mapping met behulp van UV-excitatie en zichtbare emissiedetectie beschreven. Het is echter ook mogelijk om het te veranderen voor NIR excitatie en zichtbare of NIR emissiedetectie, afhankelijk van het geanalyseerde monster. Zie bijvoorbeeld de sectie Representatieve resultaten.
   1. Vanaf de microscoopfase (1 in figuur 2a)en volgens de emissiebundelroute naar de detectoren (3 in figuur 2a),verlaat u de eerste positie voor een optische kubus (4 in figuur 2b)vacant en plaatst u de confocale microscoop optische kubus (DFM1-P01) in de positie aangegeven als 5 in figuur 2b, zodat de emissie van het monster door het zichtbare lichtpad wordt geleid.
   2. Als u langs het optische pad naar de detector kijkt, plaatst u de zichtbare optische kubus (CM1-P01), die de dichroïsche spiegel en de filters bevat om de zichtbare emissie naar de detectiepaden te leiden, in de positie die is aangegeven als 6 in figuur 2b.
   3. Als u het pad naar de detector voortzet, plaatst u de confocale pinhole optische kubus (DFM1-P01) in de positie die is aangegeven als 7 in figuur 2b om het licht door het zichtbare lichtdetectiepad te leiden. Plaats vervolgens, na het pad, de confocale spectrometer optische kubus (DFM1-P01) in positie 8 in figuur 2c, zodat het uitgezonden licht de detector bereikt.
   4. Voor de HSI mapping u de opening van de detectorspleet (9 in figuur 2c)handmatig bedienen om af te komen op de grootte van de gebruikte gaatjes (ongeveer 50 mm is optimaal).
   5. Kies in de PHySpec-software het diafragma van het gaatje (5 in figuur 3).
      LET OP: Hoe kleiner het gat diafragma, hoe beter is de HSI resolutie, ten koste van signaalintensiteit.
3. Schakel de breedbandlamp(figuur 2d, beginset) in door de schakelaar (10 in figuur 2d)in de ON-positie te plaatsen. Als u de intensiteit van het excitatielicht wilt regelen, draait u de knop die wordt aangegeven door 11 (figuur 2d) naar hoger (32 – laagste intensiteit) of lagere waarden (1 – hoogste intensiteit). Houd de sluiter van de breedbandlamp (12 in figuur 2d)gesloten tijdens de set-up.
   OPMERKING: De hogere waarden komen overeen met een hogere demping van de vermogensdichtheid die door de lamp wordt uitgestraald, terwijl lagere waarden overeenkomen met een lagere demping.
4. Schakel de volgende hardware in de onderstaande volgorde in door hun schakelaars in de AAN-positie in te stellen:
   1. Schakel de ThorLabs-bewegingscontroller in.
   2. Schakel de Nikon-krachtbron in.
   3. Schakel de ASI-controller in.
   4. Schakel de Galvo-controller in.
   5. Zet de ProEm detector aan.
   6. Zet de Bayspec detectoraan.
5. Open op de computer de PHySpec-software door op het pictogram te dubbelklikken.
   1. Druk op de F8-toets op het toetsenbord om het IMA Upconversion-systeem te initialiseren en klik op de ok-knop in het venster Verbinding maken met het systeem.
      LET OP: Stap 1.5.1. kan ook worden uitgevoerd door op het tabblad Systeem te klikken en vervolgens op Verbinding maken te klikken om bij het venster Verbinding maken met het systeem te komen. Vervolgens kan op de OK-knop worden geklikt om het beeldvormingssysteem op de software aan te sluiten.
   2. Zorg ervoor dat alle menu's op de interface(Kleurencamera, ProEm en Bayspec)en het bedieningspaneel van het instrument aan de linkerkant van het scherm verschijnen, zoals weergegeven in figuur 3.

2. Hyperspectrale beeldvorming van een [TbEu(bpm)(tfaa)₆] enkel kristal

1. Om het monster voor te bereiden, plaatst u het kristal op een microscopieglasplaat. In het geval dat het nodig is om een hogere vergroting te gebruiken, bedek het kristal met een dun dekselglas en zet het vast met tape, zodat het monster kan worden geplaatst met het dunne dekselglas naar de objectieve lens gericht.
2. Plaats de glazen schuif waarop het monster is bereid op het microscooppodium en zet het vast met behulp van de metalen armen(figuur 4a,b).
3. Verplaats het monster met behulp van de joystick (figuur 4c) van de ASI-controller om het monster te positioneren over de gebruikte doelstellingen.
4. Plaats handmatig de juiste filterkubus in het wiel onder de doelstellingen (3 in figuur 5) om de UV-excitatie van de lamp te selecteren en de zichtbare emissie naar de detector door te laten gaan.
   OPMERKING: Extra filterkubussen zijn beschikbaar voor het gebruik van groene of blauwe lichtexcitatie, dus met de juiste filterkubus op zijn plaats is belangrijk voor de juiste excitatie golflengte.
5. Plaats de 20X-doelstelling (aangegeven door 5 in figuur 5)handmatig onder het monster en druk op de witte knop (6 in figuur 5)aan de linkerkant van de microscoop om het witte licht aan te zetten.
   1. Pas de helderheid aan door de knop onder de witte lichtaan/uit-knop te draaien (7 in figuur 5).
6. In de PHySpec-software drukt u op de knop Afspelen (video) op het venster van de kleurencamera, wat de aanschaf van een live scan zal veroorzaken.
   1. Als in het venster van de kleurencamera een zwart beeld wordt weergegeven, verhoogt u de belichtingstijd (2 in figuur 3)en/of de winstwaarde (3 in figuur 3)in het bedieningspaneel van het instrument onder het tabblad Kleurencamera. Als de bekeken afbeelding te helder is, verlaagt u de belichtingstijd en/of wint u waarde.
   2. Zorg ervoor dat de voorwaartse knop aan de rechterkant van de microscoop (2 in figuur 5)op R is ingesteld om 20% van het signaal naar de camera/verrekijker en 80% van het signaal naar de detector te sturen.
7. Focus op het monster door de afstand tussen de doelstelling en het werkgebied aan te passen(figuur 4b). Dit wordt gedaan door het draaien van de knoppen in figuur 4d aan de rechterkant van de microscoop.
   OPMERKING: De grotere knop wordt gebruikt voor grove aanpassingen, terwijl de kleinere knop is voor meer delicate en kleine focus veranderingen.
8. Zorg ervoor dat de handmatig gekozen doelstelling ook bij de software wordt geselecteerd. Klik eerst op de knop Weergave in de bovenste menubalk en klik vervolgens op een schaalbalk weergeven/verbergen om de schaalbalk op de afbeelding weer te geven (1 in figuur 3). Ga vervolgens naar het tabblad Galvanometer in het instructiebedieningspaneel en selecteer de gebruikte doelstelling (4 in figuur 3). Zorg ervoor dat de weergegeven schaalbalk correct is door de juiste doelstelling in de software te selecteren.
9. Selecteer in de software de juiste detector door naar het tabblad Diverter (ProEM – 6 in figuur 3) en roosters te gaan door naar het tabblad Filter (1200 gr/mm in geval van ProEM – 7 in figuur 3) onder het tabblad SpectraPro SP-2300 te gaan.
10. Open de sluiter van de breedbandlamp (12 in figuur 2)om de UV-excitatie van het monster te laten plaatsvinden. Draai de intensiteitsknop (11 in figuur 2d)naar de gewenste positie (bijvoorbeeld 8 – tussenliggende intensiteit) om de intensiteit van de excitatie van de breedbandlamp (UV) te regelen.
    1. Als u wilt kiezen tussen brede veldverlichting (open diafragma) of een kleinere spotverlichting (meer gesloten diafragma), bepaalt u de grootte van het UV-lampvelddiafragma met behulp van de stick en knoppen in figuur 5.
11. Selecteer onder het tabblad SpectraPro SP-2300 een golflengte om de monsteremissie te observeren.
12. Als de emissiegolflengten van het monster onbekend zijn, krijgt u een emissiespectrum.
    1. Klik in de sequencer op het + teken om een nieuwe reeks ("knooppunt") toe te voegen voor de aanschaf van een emissiespectrum.
       1. Klik op Spectrometer en vervolgens Spectrum Acquisition (met spectrale scan).
       2. Voer een minimale golflengte (d.w.z. 400 nm) en een maximale golflengte (d.w.z. 700 nm) en klik op OK om het spectrale bereik in te stellen waarin het spectrum wordt geregistreerd.
       3. Kies de voldoende belichtingstijd in het linkermenu van de software. Kies kortere tijden (bijvoorbeeld 0,1 s) voor zeer heldere monsters en langere tijden (bijvoorbeeld 2 s) voor dim zenders.
       4. Pas de excitatiekracht in het geval van de excitatie van de breedbandlamp (UV) aan (zie stap 1.3 hierboven).
          OPMERKING: In het geval van NIR diode excitatie, kan het worden aangepast vanuit het Neutral Density drop-down menu aan de linkerkant van de PHySpec software.
    2. Klik op de sequencer op de knop dubbelafspelen om de hele reeks uit te voeren. Let op de gebieden die van belang zijn voor de detectie van de monsteremissie(bijvoorbeeld 580 tot 640 nm in geval van Tb³⁺- en op^{eu 3+}gebaseerde monsters).
    3. Optimaliseer waar nodig de signaaldetectie door de focus van het monster te wijzigen of door de belichtingstijd in de PHySpec-software aan te passen. Bereik verdere optimalisatie van de signaaldetectie door de toename van de emissie-intensiteit van het monster door de kracht van de excitatiebron (breedbandlamp) te veranderen, zoals hierboven beschreven.
13. Pas de belichtingstijd (bijvoorbeeld 0,5 s – 2 in figuur 3)en Gain (3 in figuur 3)van de kleurencamera dienovereenkomstig aan om een beeld van goede kwaliteit te verkrijgen. Voeg indien nodig de schaalbalk toe aan de afbeelding door op de knop Schaalbalk tonen/verbergen aan de tweede rij van het menu boven in het PHySpec-softwarevenster te klikken.
14. Aanbeveling: Voorafgaand aan het verwerven van de hyperspectrale kubus, neem een helder veld optische microscopie beeld van het kristal onder wit licht (Figuur 6a) en / of UV-volledige (Figuur 6b) of beperkt (Figuur 6c) verlichting (UV-verlichting gecontroleerd door de sluitertijd diafragma, weergegeven als 4 in figuur 5). Klik hiervoor met het voorbeeld in focus op de afspeelknop van de kleurencamera.
15. Klik op Bestand en exporteer vervolgens vensterweergave,kies de gewenste indeling om de verkregen afbeelding te exporteren en sla het bestand op met de gewenste extensie (.h5, . JPEG).
16. Voordat u het hyperspectrale beeld krijgt, schakelt u zowel de verlichting van het witte licht als het kamerlicht uit.
17. Om de hyperspectrale kubus te verkrijgen, schrijf een nieuwe volgorde. Klik daarom in de sequencer op het + teken om een nieuw knooppunt toe te voegen.
    1. Klik op Confocal Imager.
       1. Klik op Multi-Spectrum Acquisitie. Hier wordt het gewenste gezichtsveld bepaald door het aantal punten dat u moet verwerven in de x- en y-richtingen en de stapgrootte. Gebruik bijvoorbeeld 100 punten in x en 100 punten in y met een stapgrootte van 5 μm om een beeld van 500 bij 500 μm te verkrijgen.
          Opmerking: Het totale aantal acquisitiepunten en de integratietijd op elk punt hebben rechtstreeks invloed op de totale aankooptijd van de hyperspectrale kubus.
          1. Voer de gewenste X-positie (bijvoorbeeld 100) en Y-positie (bijvoorbeeld 100) telt en de gewenste stapgrootte (bijvoorbeeld 5 μm). Selecteer de optie Hardware voor de camerasynchronisatie voor zichtbare emissietoewijzing (en softwareoptie in geval van NIR-detectie). Klik op OK.
18. Klik in de sequencer op de nieuw toegevoegde multispectrumacquisitieregel om het knooppunt te markeren.
19. Klik op de knop Afspelen om het geselecteerde knooppunt uit te voeren.
    OPMERKING: De resterende tijd die de overname in beslag neemt, verschijnt naast het knooppunt (in enkele minuten, bijvoorbeeld 28 minuten).
20. Zodra de overname is voltooid, slaat u de hyperspectrale kubus op in de juiste bestandsindeling (.h5).

3. Hyperspectrale data-analyse

1. Direct na de overname, als de opgeslagen hyperspectrale kubus niet automatisch wordt geopend in de software, herstelt u de hyperspectrale kubus, die is opgeslagen als .h5-bestand, door op Bestand in de bovenste menubalk te klikken en vervolgens de cursor te zweven en op Bestand openen te klikken.... Wanneer het venster met de titel Gegevens(en) selecteren om te openen wordt geopend, kiest u de map waar het .h5-bestand wordt opgeslagen en dubbelklikt u op het bestand om het te openen.
2. Zodra het hyperspectrale kubusbestand is geïmporteerd, wijzigt u de weergegeven hyperspectrale kubusafbeelding om de intensiteit van een specifieke spectrale golflengte weer te geven door de balk boven aan de bovenkant van de kubusafbeelding naar links te verplaatsen (lagere golflengte, bijvoorbeeld 580 nm) of rechts (hogere golflengte, bijvoorbeeld 638 nm).
   OPMERKING: De geselecteerde golflengte wordt weergegeven aan de linkerkant van deze bovenste balk (1 in figuur 7).
3. Na het kiezen van de golflengte van belang voor de analyse (bijvoorbeeld, de maximale intensiteit, die in het geval van [TbEu(bpm)(tfaa)₆] is 613.26 nm), maak een (of alle) van de drie mogelijke soorten spectrale analyse: (A) de spectrale verdeling in de vorm van een beeld (2 in figuur 7); b) een emissie-intensiteitsprofiel in een regio van belang (3 in figuur 7); C) winning van een spectrum op een specifiek punt of gebied van belang (figuur 4 in figuur 7).
   1. Gebruik in het geval van de spectrale verdeling van een afbeelding de functie Gewas en bak om de signaal-ruisverhouding in de afbeelding te verhogen. Klik daarvoor in het bovenste menu Verwerking en kies vervolgens Gegevens en vervolgens de optie Bijsnijden en opslaglocatie.
   2. Voor een emissie-intensiteitsprofiel klikt u op de kubusafbeelding met de rechtermuisknop en selecteert u het profiel Doel maken of X maken of Y-profiel maken, afhankelijk van het feit of slechts één punt (Doel - 5 en 6 in figuur 7) of een regel (Profiel - 7 en 8 in figuur 7) moet worden geanalyseerd. Selecteer het analysegebied door het doel, het horizontale of verticale lijnprofiel met de cursor te slepen en door de kubus te verplaatsen.
      1. Zodra het profiel goed is geselecteerd, klikt u met de rechtermuisknop op de regio en selecteert u het doel toevoegen aan grafiek. Kies de optie om een nieuwe grafiek te maken om de emissie-intensiteit(y-as) weer te geven als functie van de fysieke positie van het doel(x-as). Het spectrum zal worden weergegeven op de nieuwe grafiek die is ingevoegd (6 en 7 in figuur 7).
         OPMERKING: Er kunnen meerdere doelen worden gemaakt en deze worden weergegeven als verschillende gekleurde emissieprofielen (5 en 6 in figuur 7).
   3. U ook een emissiespectrum verkrijgen van een specifiek gebied van het monster (figuur 9 in figuur 7). Om te beginnen de muisaanwijzer op de cursor boven de kubusafbeelding en met de rechtermuisknop. Klik op de opties Rechthoekselectie of Ellipsselectie op het tabblad dat wordt weergegeven.
      1. Teken de selectievorm (bijvoorbeeld een rechthoek) over het gewenste gebied door op de cursor over de kubus te klikken en te slepen. Zodra het gebied goed is geselecteerd, klikt u met de rechtermuisknop op het gebied en selecteert u de selectie toevoegen aan grafiek.
      2. Selecteer in het weergegeven venster Toevoegen aan grafiekde optie Een nieuwe grafiek maken om de emissiespectra van het doel weer te geven en klik op OK.
         OPMERKING: Er verschijnt een nieuwe gekleurde lijn (8 in figuur 7)op de grafiek waarin de doelemissie wordt weergegeven, met de emissie-intensiteit als de y-as en de golflengte bij de x-as. Dit spectrum komt overeen met de gemiddelde intensiteit van het geselecteerde gebied voor elke golflengte.
4. Zodra het spectrum is verkregen, slaat u het op voordat u een nieuwe regio selecteert, omdat slechts één regio tegelijk kan worden geselecteerd. Selecteer hiervoor het venster waarin de grafiek zit. Selecteer in het menu Bestand opslaan als en kies ervoor om de grafiek op te slaan in de map naar keuze, met de naam van keuze, hetzij in .h5-indeling, die kan worden geopend in de PHySpec-software, of in csv-indeling, die kan worden geïmporteerd in Excel.

Representative Results

Ter illustratie van de configuratie van de hyperspectrale microscoop voor de gegevensverwerving op een Ln-gebaseerd, moleculair enkel kristal (d.w.z., [TbEu(bpm)(tfaa)₆], Figuur 1a),toont figuur 2 een overzicht van het systeem en de juiste plaatsing van de optische kubussen in de opstelling. Figuur 3 toont een screenshot van de PHySpec-software met de menu's die tijdens de HSI-overname worden gebruikt. Figuur 4 en figuur 5 tonen de microscoopfase in meer detail, inclusief de plaatsing van de glazen plaat met het te analyseren monster. De geselecteerde UV-verlichting werd ingeschakeld om de zichtbare rode luminescentie van het kristal weer te geven(figuur 4a en 1 in figuur 5). Figuur 6a toont een helder veldbeeld van het kristal dat is opgenomen na het aanpassen van het monster in de juiste focus. De naald-achtige morfologie van het kristal kan duidelijk worden gezien. Figuur 6b, c toont het beeld van hetzelfde kristal onder UV-excitatie met volledige weergave ( figuur6b) of lokaal beperkt (Figuur 6c) verlichting. Onder de brede UV-verlichting zijn de verschillen in emissiehelderheid van de verschillende vlakken van het kristal onmiddellijk zichtbaar. De beperkte verlichting kan worden gebruikt als een optie, vooral om eventuele effecten van energie of lichtoverdracht in het kristal te onderzoeken, die waveguide-achtig gedrag kunnen veroorzaken. In dit geval wordt een sterke emissie gedetecteerd op een punt dat niet direct onder excitatie valt. Dit suggereert dat efficiënte energiemigratie plaatsvindt via het kristal¹³ (5 en 6 in figuur 7).

Van de verworven hyperspectrale kubus is het verder mogelijk om de spectrale verdeling te verkrijgen in de vorm van een beeld dat een specifieke golflengte vertegenwoordigt, het intensiteitsprofiel van een specifieke emissiegolflengte, evenals de emissiespectra op elke pixel of gebied van de verworven hyperspectrale kubus. Zo tonen de emissiespectra in figuur 7 (paneel 4) de meest karakteristieke emissiebanden van de Europese³⁺ ion: de bij 590 nm waargenomen band wordt toegewezen aan de magnetische dipool (MD) ⁵D₀→⁷F_1-overgang van de Europese^{Unie 3+,}terwijl de emissiepieken in de regio van 610 tot 630 nm voortvloeien uit de overgevoelige geforceerde elektrische dipool (ED) ⁵D_{0 0}⁷F₂ Europese³⁺ overgang. De verhouding tussen de geïntegreerde intensiteit van deze twee overgangen is bekend als een uitstekende sonde van de chemische omgeving rond de Ln^{3 +} ion in de structuur van de enkele kristal²¹: hoe lager de symmetrie rond de Ln^{3 +} ion, hoe groter is de ED / MD verhouding. Dit maakt het mogelijk om conclusies te trekken over de symmetrie karakter van de chemische omgeving van de Ln^{3 +} ion. Bovendien kan de Stark splitsing van de ⁵D₀→⁷F₂ overgang ook worden gecorreleerd met de symmetrie rond de Ln^{3 +} in zijn kristallografische omgeving - hoe lager de symmetrie, hoe hoger is het aantal Stark sub-niveaus. In het geval van de naaldachtige polymorf gekristalliseerd in het lage symmetrische triclinickristalsysteem, splitst de ^{overgang 5}D₀→⁷F₂ zich op in vier subpieken (spectra weergegeven in figuur 7, paneel 4). Een dergelijke analyse is bijzonder aantrekkelijk bij het vergelijken van de optische eigenschappen van verschillende polymorfen van een luminescent kristal. We hebben eerder aangetoond dat de informatie over de chemische omgeving afgeleid uit de optische analyse gecorreleerd goed met de moleculaire kristal structuur verkregen door enkele kristal X-ray analyse¹³. Bovendien kan het spectrale profiel langs de verschillende kristalvlakken in figuur 7 (paneel 3), die een helderdere emissie aan de punt en zijvlakken aangeven, ook worden gecorreleerd met de Ln³⁺··· Ln^{3 +} ion afstanden in de drie ruimtelijke richtingen ( Figuur1b): de dichtere Ln^{3 +} verpakking langs de assen loodrecht op de punt en zijvlakken, respectievelijk, gunst ion-ion en energie-overdracht. Vandaar dat emissieverbetering wordt waargenomen op de respectieve gezichten, dus, optische anisotropie.

Over het geheel genomen vormen de verschillende opties voor gegevensanalyse, zoals weergegeven in figuur 7 en figuur 8,de belangrijkste kenmerken van de gecombineerde spectroscopische en ruimtelijke informatie, die door HSI-analyse van luminescente monsters kan worden onderzocht.

Figuur 1: Moleculaire structuur en kristallografische opstelling. a) Structuur van het heterodinucleaire Ln-gebaseerde complex [TbEu(bpm)(tfaa)₆], waar Ln₁ en Ln₂ Tb³⁺ en Eu³⁺ ionen zijn. Ongeordende groepen en waterstofatomen worden voor de duidelijkheid weggelaten. Kleurcode: Eu: donkere cyaan; C: grijs; O: rood; N: blauw; F: limoengroen. bb) Vertegenwoordiging van de moleculaire verpakking in het kristal: i) bovenzicht en (ii) tipweergave van de naaldachtige enkele kristalstructuur met geselecteerde intermoleculaire en intramoleculaire Ln··· Ln afstanden (tfaa subeenheden en waterstofatomen worden weggelaten voor de duidelijkheid). iii) Kristalverpakkingsregeling van de [TbEu(bmp)(tfaa)_6]dimers (waterstofatomen worden voor de duidelijkheid weggelaten). iv) Diagram van de kristalgroeigezichten van dimer die kortste Ln··· Ln afstanden in de (0 1 0) en (2 -1 1) kristallografische richtingen. Het cijfer is gewijzigd van referentie 13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van het Hyperspectral Imaging System. Getoond is de configuratie die nodig is voor het in kaart brengen van luminescentie op het zichtbare spectrale gebied met behulp van UV-excitatie. aa) Algemene weergave van het systeem, waarbij 1 de microscoopfase is, 2 het gedeelte met de optische configuratie en 3 de spectrometer met de zichtbare en NIR-detectoren. bb) Open weergave van de optische opstelling dicht bij het microscoopstadium (rechterkant van a) met de optische configuratie voor het experiment: optische kubuspositie 4 blijft leeg en de confocale microscoopkubus cube wordt in positie 5 geplaatst om het licht door het zichtbare pad te leiden, de zichtbare kubus wordt in positie 6 geplaatst om het zichtbare licht naar het detectiepad te leiden en de confocale pinhole-kubus wordt in positie 7 geplaatst om het licht naar het zichtbare detectiepad te leiden. c) Open zicht op de optische opstelling dichter bij de detectoren (linkerkant van a), met positie 8, waar de confocale spectrometer kubus is geplaatst om licht te reflecteren op de spectrometer en zichtbare camera. De set 9 toont de schroef om de openingsbreedte van de spectrometerspleet aan te passen. d) Weergave van de microscoopfase, computer- en breedbandlamp (gebruikt voor UV-excitatie) controller. In de ingestelde, de breedband lamp controller wordt getoond met meer detail: 10 is de aan /uit knop, 11 is de knop om de intensiteit van de lamp te regelen, en 12 is de sluiterknop. e) Regeling met het zichtbare/NIR optische pad van de microscoopfase tot de detectoren, met inbegrip van de optische kubusposities van 4 tot 8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Screenshot van de PHySpec-software met het menu met de parameters die moeten worden aangepast voor de HSI. 1 maakt het mogelijk om de schaalbalk in het kleurencamerabeeld in te voegen; 2 en 3 maken het mogelijk om de belichtingstijd te controleren en waarde van de kleurencamera te verkrijgen; de juiste objectieve lens moet in 4worden gekozen ; 5 maakt de selectie van het diafragma van het gaatje mogelijk ; 6 (Diverter) en 7 (Filter) maken het mogelijk om respectievelijk de detector en het rooster te kiezen; de belichtingstijd voor de zichtbare detector is ingesteld in 8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Algemene weergave van het microscoopstadium. aa) Plaatsing van de glazen plaat die het monster in het stadium bevat, waarbij de UV-verlichting op de rode luminescentie van het monster (kleine rode stip in het midden van de glasplaat) wordt weergegeven. bb) Weergave van het microscoopstadium met de witte lichtverlichtingscondensor erbovenop. c) De werkregeler met de joystick die de beweging van het podium regelt in de richtingen aangegeven door oranje en gele pijlen (ook weergegeven in (a). d) Gedetailleerde weergave van de focusknop, die de fase in de richtingen die door de rode pijl worden aangegeven (ook weergegeven in (b))beweegt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: De componenten van het microscoopstadium. 1 microscoopfase met het monster op de glazen plaat die bovenop de objectieve lenzen op het monsterstadium wordt geplaatst; 2 wielen om de scherpstelling (groot wiel) aan te passen en de vastgelegde emissie (klein wiel) alleen naar de detector (L), gedeeltelijk aan de detector en gedeeltelijk aan de camera (R) te richten, of uitsluitend op de verrekijkerlenzen (oog); 3 excitatie/emissiefilters wiel gebruikt om de excitatie golflengte bereik te kiezen. Het detail aan de rechterkant toont de filterkubus met het UV-filter en het long-pass filter dat in dit experiment wordt gebruikt; 4 in de boven/onderzijde tonen de knoppen om de excitatiestraal door het monster te bewegen, terwijl tussendoor de cirkelvormige velddiafragmaregeling; 5 objectieve lenzen; 6 Aan/UIT knop van de witlichtverlichting; 7 knop om de helderheid van de witte lamp aan te passen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Optische microscopiebeelden van het geanalyseerde kristal. Deze beelden werden verkregen onder (a) wit licht verlichting, (b) full-view UV-verlichting, met behulp van de excitatie cirkelvormige diafragma volledig open, en (c) lokaal beperkt UV-verlichting (gemarkeerd door de witte cirkel), met behulp van een nauwere excitatie cirkelvormige diafragma. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Screenshot van de PHySpec-software met het hyperspectrale kubusgegevensanalyseproces. Diverse spectrale analysemethoden kunnen worden toegepast op de verworven hyperspectrale kubus: 1 toont de golflengte die werd gekozen voor de spectrale beeldverdeling in 2; 3 toont de 613,26 nm horizontale (7) en verticale (8) intensiteitprofielen; 4 toont de emissiespectra die uit de doelstellingen 5 en 6 worden gehaald, evenals uit het in 9 gemarkeerde gebied. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: Alternatieve toepassing van HSI die de synergie tussen het omzetten van nanodeeltjes en lanthanidecomplexen onderzoekt. Dit voorbeeld toont de hyperspectrale analyse van een hybride systeem bestaande uit moleculaire kristallen ([Tb₂(bpm)(tfaa)₆]) gecombineerd met upconverting nanodeeltjes (NaGdF₄:Tm³⁺,Yb³⁺). (a) Fotomicrografen onder witte en UV-lichtverlichting samen met de regio van belang (ROI) gebruikt voor hyperspectrale beeldvorming onder 980 nm lichtbestraling. bb) Tm³⁺ en indirecte Tb³⁺ emissies die worden gecontroleerd over een oppervlakte van 20 x 20 μm². c) De variatie van de absolute intensiteit van de emissiebanden fluctueerde door het hybride systeem, wat wijst op enige variabiliteit in de totale hoeveelheid materiaal die over het oppervlak wordt verdeeld. d) De bestendigheid van de verhouding tussen de geïntegreerde emissie van het complex vs. Tm³⁺: ¹G₄→³H₆ (vierkanten) en Tm³⁺: ¹G₄→³F₄ (cirkels) bevestigde de gelijktijdige aanwezigheid van de twee moieties in het hybride systeem en de homogene interactie tussen hen. Schaalbalken zijn 20 μm in de fotomicrografen en 5 μm in ROI's en spectrale kaarten. Fotomicrografen worden gepresenteerd in echte kleuren. Het cijfer is gewijzigd van referentie 11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Het hier beschreven hyperspectrale beeldvormingsprotocol biedt een eenvoudige aanpak die het mogelijk maakt spectroscopische informatie te verkrijgen op precieze locaties van het monster. Met behulp van de beschreven opstelling kan de ruimtelijke resolutie(x- en y-mapping) oplopen tot 0,5 μm, terwijl de spectrale resolutie kan oplopen tot 0,2 nm voor de mapping op het zichtbare bereik en 0,6 nm voor het NIR-bereik.

Om hyperspectrale mapping op een enkel kristal uit te voeren, volgt monstervoorbereiding een eenvoudige procedure: het kristal kan eenvoudig worden geplaatst op een glazen microscopieplaat, die naar behoefte door een afdekglas wordt bedekt. Het scherpstellen van het monster met behulp van de juiste objectieve lenzen en het heldere veld beeld op de Color Camera set-up in de software is een zeer belangrijke stap tijdens de pre-analyse fase om de beste opgeloste hyperspectrale beelden te verkrijgen. Doorgaans worden hogere emissie-intensiteiten verkregen wanneer het monster goed is gericht. Zodra dit is gebeurd, zal de keuze van de parameters van de analyse, zoals de x en y telt en de stap grootte dicteren het gezichtsveld en ruimtelijke bemonstering, respectievelijk van de verkregen hyperspectrale kubus. Het numerieke diafragma van de doelstelling en de excitatie-/emissiegolflengten dicteren echter het werkelijke volume van het monster dat op elk overnamepunt wordt onderzocht. Bijvoorbeeld, voor de doelstelling die in deze studie wordt gebruikt, met numeriek diafragma (NA) van 0,4, en het gebruik van de excitatie in het UV-spectrale bereik (390 nm), heeft de gerichte laserspot een grootte van ongeveer 0,6 x 0,6 μm in de x- en y-richting. De grootte van de laserspot is berekend aan de hand van de website (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, toegankelijk op 26 september 2019). Als de gekozen stapgrootte groter is dan de ruimtelijke bemonstering, kan men daadwerkelijk een gebied bemonsteren dat kleiner is dan het gebied dat door de stapgrootte wordt gegeven. Als het monster homogeen is, kan onderbemonstering geen probleem zijn. Maar als ruimtelijke variaties in het monster belangrijk zijn om te detecteren, wordt optimale bemonstering verkregen met een stapgrootte die is ingesteld op de helft van de grootte van de laserstraal op het monster. De gekozen belichtingstijd en de intensiteit van de UV-geselecteerde verlichting bepalen de intensiteit van de verkregen spectra. Dergelijke parameters variëren van monster tot monster, afhankelijk van de emissie-intensiteit en de gevoeligheid voor de UV-excitatie.

Op dit punt kunnen de kritische stappen binnen het protocol worden vermeld als: de uitlijning van het optische systeem, de juiste plaatsing van de optische kubussen, de regulering van het cirkelvormige diafragma van de excitatie- en detectorspleetopeningen, keuze van het gaatje, focus van het monster in de kleurencamera met behulp van de juiste objectieve lenzen, de intensiteit van de breedbandlamp en de juiste keuze van de lange pasfilterkubus (waardoor UV-excitatie mogelijk is) , evenals de keuze van de juiste stap grootte en belichtingstijd zoals hierboven vermeld. Ten slotte moeten de kamerlichten uit zijn tijdens alle tijd van de hyperspectrale kubusverwerving.

In het geval van slechte signaaldetectie, hetzij met de kleurencamera of de spectrometer, moet het oplossen van de techniek omvatten het zorgvuldig controleren van elk van de hierboven vermelde kritieke stappen, voordat u begint met de hyperspectrale kubusverwerving. De configuratie van het uitgangssignaal in de microscoopfase is ook belangrijk. De drie mogelijke configuraties zijn: oog (100 % van het uitgangssignaal wordt naar de verrekijkerhouder van de microscoop gestuurd), L (100 % van het uitgangssignaal wordt naar de detectoren gestuurd) en R (80 % van het uitgangssignaal wordt naar de detectoren gestuurd en 20 % naar de verrekijkerhouder). Tijdens de hyperspectrale kubusverwerving moet de R- of L-configuratie worden gebruikt. Als alle bovengenoemde parameters naar behoren zijn gekozen, kan ruimtelijke en spectrale informatie met hoge resolutie van het monster worden verkregen.

Enkele mogelijke wijzigingen van de hierbeschreven techniek kunnen worden geïllustreerd door de hyperspectrale beeldvorming van andere systemen, zoals lichtgevende microdeeltjes¹⁴ of optische hybride systemen bestaande uit moleculaire kristallen in combinatie met upconverting nanodeeltjes (Figuur 8)¹¹. In deze voorbeelden werd de NIR-laserdiode (980 nm) gebruikt als excitatiebron, ter vervanging van UV-excitatie, terwijl de gegenereerde zichtbare emissie werd gedetecteerd. In het laatste voorbeeld van het hybride systeem onthulde HSI de homogeniteit van hybride films die up-converting nanodeeltjes combineren (NaGdF₄:Tm³⁺,Yb³⁺) en [Tb₂(bpm)(tfaa)₆] kristallen in een multigolflengte-responsief isotropic systeem, dat energieoverdracht tussen materialen en moleculen vertoont (Figuur 8)¹¹. Bovendien wordt detectie van emissies in het NIR-spectrale gebied (1000 tot 1700 nm) mogelijk door gebruik te maken van de InGaAs-detector van het systeem. Dit is van bijzonder belang bij het zoeken naar het onderzoek naar op NIR gebaseerde optische sondes voor biomedische toepassingen³. In dit geval moet de optische kubussen configuratie van het systeem (Figuur 2e) worden ingesteld voor het NIR-pad. In het geval van NIR excitatie-NIR-emissie wordt een van de hier beschreven beperkingen van de hyperspectrale techniek duidelijk: omdat de spectrale resolutie in het NIR-gebied lager is dan die voor de zichtbare detectie, d.w.z. ongeveer 0,6 nm (vs. 0,2 nm). Bovendien wordt voor sub-1 μm-kenmerken, bijvoorbeeld kleinere moleculaire kristallen, nanodeeltjes of hybride systemen, de ruimtelijke resolutie, die wordt bepaald door de systeemconfiguratie (gebruikte doelstellingen en excitatie/emissiegolflengten), een andere potentiële beperking.

Ten slotte kan (ongeacht de gekozen HSI-configuratie en golflengteregeling) de gegevensmanipulatie worden uitgevoerd met de software van het instrument of, zoals blijkt uit het geval van de spectrale profielen, worden geëxporteerd om te worden geanalyseerd in andere softwarepakketten zoals Origin® of Microsoft Excel. In ons voorbeeld, de optische anisotropie van het kristal werd ook onmiddellijk onthuld op de kleur camera beeld, namelijk door de sterke intensiteit variatie langs de verschillende kristallen gezichten. Bovendien worden onder de brede UV-excitatie verschillende emissie-intensiteiten verkregen, afhankelijk van welk gezicht wordt geanalyseerd (Figuur 7). De mogelijkheid om het emissieintensiteitsprofiel te verkrijgen in verschillende aandachtspunten bij het kristal (doelstellingen in figuur 7)maakt het verder mogelijk om variatie in emissieintensiteit en, indien aanwezig, ook in spectrale vorm te bestuderen. De blokachtige polymorf van de [TbEu(bpm)(tfaa)₆] vormt een voorbeeld waarbij twee kristallen vlakken even hoge emissie-intensiteiten en een lagere emissie-intensiteit vertoonden voor de derde¹³. Afhankelijk hiervan zou in het geval van een systeem zonder anisotropie de emissie-intensiteit voor alle kristalvlakken hetzelfde zijn.

Aanvullende methoden om optische anisotropie te onderzoeken zijn bijvoorbeeld gerelateerd aan de aanwezigheid van gepolariseerde emissies van een monster. Deze omvatten polarisatie geheugen of spectroscopische elliptische pvanmetrie. De eerste bestaat uit de correlatie tussen de polarisatietoestand van het licht dat door het materiaal wordt uitgezonden met de polarisatietoestand van het incidentexcitatielicht,^22,23, terwijl de laatste de verandering in de polarisatietoestand van het licht meet nadat het schuin wordt gereflecteerd door een dunne monsterfilm²⁴. Echter, een voordeel van het gebruik van hyperspectrale beeldvorming als een instrument voor het indringende optische anisotropie, zoals hier getoond, komt met het feit dat de aanwezigheid van polarisatie is geen vereiste voor monsteranalyse. Bovendien vereist de monstervoorbereiding geen fabricage van dunne folies, noch een zeer zorgvuldige oriëntatie van het kristal ten opzichte van het incident en verzameld licht. Deze aspecten maken de techniek van HSI potentieel breder toepasbaar. Bovendien worden de anisotropische functies onmiddellijk gevisualiseerd bij het verzamelen van afbeeldingen en is gegevensanalyse eenvoudig (zoals hierboven beschreven).

Gezien een breder toepassingsgebied kan de betekenis van de HSI-techniek worden toegeschreven aan zijn unieke kenmerk om het optische signaal te coreleren met omgevingsafhankelijke functies. Een dergelijke verbinding is bijvoorbeeld essentieel om het begrip van nano-bio interacties^3,15^,16op het groeiende gebied van de nanogeneeskunde te verbeteren of zelfs om de relatie tussen structuur-eigenschappen in de materiaalkunde te begrijpen^10,11,12,13.¹⁶ Als zodanig kunnen toekomstige potentiële toepassingen van de hierin beschreven techniek worden genoemd als, maar niet beperkt tot: analyse van biologische monsters in vitro, ex vivo en in vivo het in kaart brengen van moleculen van biologisch belang^4,6, aanpassing van de microscoopfase om milieuspecifieke opto-elektronische eigenschappen te bestuderen(bijvoorbeeld monsters ingebed in elektrische circuits), optische temperatuurdetectie^8,15 (door een temperatuurregelaar toe te voegen aan de microscoopfase) of gasdetectie (door een gaskamer aan te passen aan het stadium). HSI is verder aangetoond geschikt voor fluorescentieexcittechnieken in plaats van fluorescentie-emissie²⁵. Een goed voorbeeld van het gebruik van deze specifieke hyperspectrale techniek aanpassing is de detectie van kankercellen in biologische weefsels⁶. Bijgevolg heeft het hier beschreven protocol het potentieel om grotendeels te worden uitgebreid tot de studie van spectroscopische kenmerken van veel verschillende soorten luminescente structuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope glass slides	FisherBrand	12-550-15	Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager	PhotonETC		Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number