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Chemistry

高光谱成像作为研究基于兰塔尼的分子单晶光学自给性的工具

Published: April 14, 2020 doi: 10.3791/60826
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2Photon etc

Summary

在这里，我们提出了一个协议，以获得发光高光谱成像数据，并使用高光谱成像系统分析基于兰他尼的单晶体的光自给特征。

Abstract

在本作品中，我们描述了高光谱成像（HSI）在分析基于发光的蓝硅（Ln3+）分子单晶时的新应用协议。作为具有代表性的例子，我们选择了基于异核Ln的复合物[TbEu（bpm）（tfaa）6] （bpm=2，2'-双丙氨酸，tfaa= =1，1，1-三氟乙酰聚酰亚酸盐）的单晶，在紫外线激发下表现出明亮的可见发射。6HSI是一种新兴技术，将发光结构的二维空间成像与所获取图像的每个像素的光谱信息相结合。具体来说，[Tb-Eu] 复合体单晶上的HSI提供了局部光谱信息，揭示了所研究晶体不同点的发光强度变化。这些变化归因于晶体中的光学自给性，这是由于Ln3+离子在晶体结构的每个方向中不同的分子包装造成的。本文描述的HSI是这种技术适合分子材料光谱空间研究的一个例子。然而，重要的是，该协议可以很容易地扩展到其他类型的发光材料（如微米大小的分子晶体，无机微粒，生物组织中的纳米粒子，或标记的细胞等），为更深入地研究结构与性质的关系开辟了许多可能性。最终，此类调查将为从生物成像到技术应用（如波导或光电器件）等各种应用的高级材料工程提供可供利用的知识。

Introduction

高光谱成像（HSI）是一种生成空间地图的技术，其中每个x-y坐标包含一个光谱信息，这些信息可以基于任何类型的光谱学，即光致发光、吸收和散射光谱1,1、2、3。,3因此，获得了一组三维数据集（也称为"高光谱立方体"），其中x-y坐标为空间轴，z坐标是分析样本的光谱信息。因此，高光谱立方体包含空间和光谱信息，比传统光谱学对样品进行更详细的光谱研究。,6,7,虽然HSI在遥感领域（如地质学、食品工业4）已有多年所知，但最近它已成为一种用于生物医学应用的纳米材料2、55或探针的特性创新2技术。一般来说，它不限于紫外线/可见/近红外（NIR）领域，而且还可以使用其他辐射源，如X射线扩展，例如，为了描述不同材料9或Terahertz辐射中的元素分布特征，其中HSI用于在生物组织8中进行热传传。此外，光致发光映射与拉曼映射相结合，以探测单层MoS210的光学特性。然而，在光学HSI的应用中，关于基于兰他尼的材料的HSI的例子仍然只有几个例子：11、12、13、14、15、16、17。11,12,13,14,15,16,17例如，我们可以举一个例子：发现组织中的癌症6，分析生物组织中的光穿透深度7，多路复用生物成像3，混合系统中多组分能量转移分析11，以及研究向上转换纳米粒子的聚合诱导光谱特性变化12。显然，HSI的吸引力源于它适合生成关于环境特定发光的知识，同时提供有关探测器的空间和光谱信息。

利用这一强大的技术，本文描述了一种研究异核Tb3+-Eu3+单晶[TbEu（bpm）（tfaa）6] （6图1a）13的光学自给性的协议。13观测到的光相向异性是由于Ln3+离子在不同晶体方向中的分子包装不同（图1b），导致一些晶体表面显示更亮，其他晶体表面显示发光。有人建议，晶体特定表面的发光强度增加与Ln3=[]的晶体方向的更有效能量传输有关。Ln3+ ion 距离最短的13。

在这些结果的激励下，我们建议建立一个详细的方法，通过HSI分析光学各向异性，为更好地了解电离能量转移过程和特定分子排列产生的可调发光特性开辟道路。,19这些结构特性关系被公认为创新光学材料设计的重要方面，包括但不限于纳米和微尺度的波导系统和光磁存储设备，满足对更高效、小型化光学系统20的需求。

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Protocol

注意：建议在操作成像器时，使用针对任何时候都使用的激发波长特有的安全护目镜。

1. 高光谱显微镜的配置

注：图2a概述了高光谱成像系统，并介绍了成像器的主要组件。成像系统可用于检测样品中的可见或近红外 （NIR） 发射。根据所需的检测（可见或近红外），光通过两个不同的光路（图2e）。不同的光束转向立方体和二色滤波器立方体（光学立方体）的组合必须放置在仪器的特定位置，以选择相应的路径。

  1. 打开连接到成像系统的计算机。打开计算机的显示器。
  2. 设置适当的光学立方体配置（图 2b，c）。
    注：这里介绍了使用紫外激发和可见发射检测进行HSI映射的成像器配置（光学立方体配置）。但是，根据所分析的样品，也可以将其更改为 NIR 激励和可见或近红外发射检测。有关示例，请参阅"代表结果"一节。
    1. 从显微镜阶段（图2a中的1）开始，沿着发射光束路径向探测器方向移动（图2a中的3），将光学立方体的第一个位置（图2b中的4）空置，并将共聚焦显微镜光学立方体（DFM1-P01）置于图2b中指示为5的位置，以便样品的发射通过可见光路径定向。
    2. 沿着向探测器方向的光学路径看，将包含二色镜和滤波器的可见光学立方体 （CM1-P01） 放置在图 2b中指示为 6 的位置，将可见发射定向到检测路径。
    3. 继续向探测器的方向，将共聚焦针孔光学立方体 （DFM1-P01） 置于图 2b中指示为 7 的位置，以引导光线通过可见光检测路径。然后，沿着路径，将共聚焦光谱仪光学立方体 （DFM1-P01） 置于图 2c中的位置 8 中，以便发射光到达探测器。
    4. 对于 HSI 映射，手动控制探测器狭缝开口（图 2c中的 9），以便与所使用的针孔大小相匹配（最佳约为 50 mm）。
    5. 在PHySpec软件中，选择针孔的光圈（图3中的 5）。
      注： 针孔孔径越小，HSI 分辨率越好，以信号强度为代价。
  3. 通过将开关（图 2d中的 10）定位到 ON 位置，打开宽带灯（图 2d，inin）。要控制激发光的强度，请将 11（图 2d）指示的旋钮转向更高（32 = 最低强度）或较低值（1 = 最高强度）。在设置期间保持宽带灯快门（图 2d中的 12）关闭。
    注： 值越高，灯发出的功率密度衰减越高，而较低的值对应于较低的衰减。
  4. 通过将交换机设置为 ON 位置，按以下顺序打开以下硬件：
    1. 打开 ThorLabs 运动控制器。
    2. 打开尼康电源。
    3. 打开 ASI 控制器。
    4. 打开 Galvo 控制器。
    5. 打开 ProEm 探测器。
    6. 打开贝斯佩克探测器。
  5. 在计算机上，双击其图标打开PHySpec软件。
    1. 按键盘上的F8键以初始化 IMA向上转换系统，然后单击"连接到系统"窗口中的"确定"按钮。
      注：步骤 1.5.1。也可以通过单击"系统"选项卡，然后单击"连接"到达"连接系统"窗口来执行。然后，可以单击"确定"按钮将成像系统连接到软件。
    2. 确保所有菜单都显示在界面上（彩色摄像机、ProEm和Bayspec）以及屏幕左侧的仪表板控制面板上，如图3所示。

2. [TbEu（bpm）（tfaa）6= 单晶的超光谱成像

  1. 为了准备样品，请将晶体放在显微镜玻璃幻灯片上。如果需要使用更高的放大倍率，请使用薄盖玻璃盖住晶体，并使用胶带固定晶体，以便样品可以放置，薄盖玻璃朝向客观透镜。
  2. 将样品制备的玻璃幻灯片放在显微镜舞台上，并用金属臂固定（图4a，b）。
  3. 使用ASI 控制器的操纵杆 （图 4c） 移动样品，以便将样品放置在正在使用的目标上。
  4. 手动将右侧滤光片立方体放置在目标下方的车轮中（图 5中的 3），以选择灯的紫外线激发，并让可见发射物传递到探测器。
    注： 其他滤光片立方体可用于使用绿色或蓝光激发，因此，将正确的滤芯位到位对于适当的激发波长非常重要。
  5. 手动将 20X 目标（如图 5中的 5 所示）置于样品下方，然后按显微镜左侧的白色按钮（图 5中的 6）以打开白光。
    1. 通过转动白光电源按钮下方的旋钮来调节亮度（图 5中的 7）。
  6. 在PHySpec软件中，按彩色相机窗口中的"播放（视频）"按钮，这将导致获取实时扫描。
    1. 如果彩色摄像机窗口显示黑色图像，则增加"彩色摄像机"选项卡下的"彩色摄像机"选项卡下的曝光时间（图 3中的 2）和/或"增益值"（图 3 中的3）。如果查看的图像太亮，则减少曝光时间和/或增益值。
    2. 确保显微镜右侧的前进旋钮（图 5中的 2） 设置为 R，以便将 20% 的信号发送到摄像机/望远镜，将 80% 的信号发送到探测器。
  7. 通过调整目标和阶段之间的距离来关注样本（图 4b）。这是通过转动显微镜右侧图 4d所示的旋钮来实现的。
    注： 较大的旋钮用于粗略调整，而较小的旋钮用于更细腻和小的对焦变化。
  8. 确保在软件中也选择了手动选择的目标。首先，单击顶部菜单栏中的"查看"按钮，然后单击一个显示/隐藏比例栏以在图像上显示比例栏（图 3中的 1）。然后，转到指令控制面板中的Galvanometer选项卡，然后选择使用的目标（图 3中的 4）。通过在软件中选择正确的目标，确保显示的刻度条正确。
  9. 在软件中，通过前往 Tab分流器（图 3中的ProEM = 6）和光栅，在SpectraPro SP-2300选项卡下进入选项卡滤波器（1200 g/mm，在ProEM =图 3中的 7）下选择适当的探测器。
  10. 打开宽带灯快门（图2中的12），使样品的紫外线激发得以发生。将强度旋钮（图 2d中的 11）旋转到所需位置（例如，8 = 中等强度），以控制宽带灯 （UV） 激发的强度。
    1. 要选择宽场照明（开孔径）或较小的光点照明（更闭合的光圈），请使用图 5中所示的斗杆和旋钮控制 UV 灯场孔径的大小。
  11. 在SpectraPro SP-2300选项卡下，选择一个波长来观察样品发射。
  12. 如果样品的发射波长未知，则获取发射光谱。
    1. 在定序器中，单击+符号以添加新序列（"节点"）以获取发射频谱。
      1. 单击光谱仪，然后单击光谱采集（带光谱扫描）。
      2. 输入最小波长（即 400 nm ）和最长（即 700 nm ），然后单击确定以设置将记录频谱的光谱范围。
      3. 在软件的左侧菜单中选择适当的曝光时间。选择非常明亮的样品的较短时间（例如 0.1 s），为昏暗发射器选择较长的时间（例如 2 s）。
      4. 调整宽带灯 （UV） 激发时的激发功率（请参阅上一步 1.3）。
        注：在 NIR 二极管激发的情况下，可以从PHySpec软件左侧的中性密度下拉菜单进行调整。
    2. 在音序器上，单击双播放按钮以运行整个序列。显示光谱后，请注意检测样品发射感兴趣的区域（例如，在 Tb3+和基于 Eu3+的样品的情况下为 580 至 640 nm）。
    3. 根据需要，通过更改样品焦点或调整PHySpec软件中的曝光时间来优化信号检测。如上所述，通过改变激励源（宽带灯）的功率，通过提高样品发射强度，进一步优化信号检测。
  13. 相应地调整彩色相机的曝光时间（例如图 3中的 0.5 s = 2）和增益（图 3 中的3），以获得高质量的图像。如果需要，通过单击PHySpec软件窗口顶部菜单第二行的"显示/隐藏比例"栏，将比例栏添加到图像中。
  14. 建议：在获取高光谱立方体之前，在白光下记录晶体的明亮场光学显微镜图像（图6a）和/或紫外全（图6b）或密闭（图6c）照明（由快门光圈控制的紫外线照明，如图5中所示4）。为此，在将示例聚焦时，单击彩色摄像机的播放按钮。
  15. 单击"文件"然后导出窗口视图，选择所需的格式以导出获取的图像，然后使用所需的扩展名 （.h5， . 保存文件）。JPEG）。
  16. 在获取高光谱图像之前，请关闭白光照明以及房间光线。
  17. 要获取高光谱立方体，请编写一个新序列。因此，在序列器中，单击 + 符号以添加新节点。
    1. 单击共聚焦成像器。
      1. 单击多频谱采集。在这里，所需的视图字段由x和y方向中要获取的点数和步长大小定义。例如，使用x中的 100 点和y中的 100 点（5 μm 步长）来获取 500 x 500 μm 的图像。
        注意：采集点的总数和每个点的积分时间将直接影响高光谱立方体的总采集时间。
        1. 输入所需的X 位置（例如，100）和Y 位置（例如 100）计数以及所需的步长大小（例如 5 μm）。为摄像机同步选择"硬件"选项，用于可见发射映射（在红外检测时选择软件选项）。单击"确定"。
  18. 在音序器中，单击新添加的多频谱采集线以突出显示节点。
  19. 单击"播放"按钮以运行所选节点。
    注： 采集所花的剩余时间将显示在节点旁边（以分钟（例如 28分钟）。"
  20. 采集完成后，以适当的文件格式 （.h5） 保存高光谱立方体。

3. 高光谱数据分析

  1. 采集后，如果保存的高光谱立方体未在软件中自动打开，请通过单击顶部菜单栏中的"文件"然后悬停光标并单击"打开文件..."，将名为"选择数据"的窗口打开时，选择保存 .h5 文件的文件夹，然后双击该文件以打开该文件，从而恢复高光谱立方体。
  2. 导入高光谱立方体文件后，修改显示的高光谱立方体图像，通过将立方体图像顶部的条移动到左侧（低波长，例如580 nm）或右侧（高波长，例如638 nm），显示特定光谱波长的强度。
    注： 所选波长显示在此上柱的左侧（图 7中的 1）。
  3. 选择分析感兴趣的波长（例如，在 [TbEu（bpm）（tfaa）6= 为 613.26 nm 的情况下的最大强度），使三种可能的光谱分析类型（A）以图像形式进行光谱分布（图 7中的 2）;（B） 跨感兴趣区域的排放强度剖面（图 7中的 3）;（C） 在特定感兴趣点或区域提取频谱（图 7中的 4）。
    1. 如果图像的光谱分布，请使用"裁剪"和"Bin"功能来增加图像中的信噪比。为此，请在顶部菜单"处理"中单击"处理"，然后选择"数据"，然后选择"裁剪"和"Bin"。
    2. 对于排放强度配置文件，在立方体图像上，右键单击并选择"创建目标"或"创建 X 配置文件"或"创建 Y 配置文件"，具体取决于是否需要分析一个点（图7中的目标 5 和 6）或一行（图 7 中的配置文件7和 8）。通过拖动目标、水平或带光标的垂直线轮廓，选择分析区域，并将其移动到立方体。
      1. 正确选择配置文件后，右键单击该区域并选择"将目标添加到图形"。选择该选项以创建一个新图形以显示发射强度（y轴） 作为目标（x轴）的物理位置的函数。频谱将显示在插入的新图形上（图 7中的 6 和 7）。
        注： 可以创建多个目标，这些目标将显示为不同的彩色排放配置文件（图 7中为 5 和 6）。
    3. 或者，获取样本特定区域的排放光谱（图 7中的 9）。首先，将光标悬停在立方体图像上，然后右键单击。单击弹出的选项卡上的"矩形选择"或"椭圆选择"选项。
      1. 通过单击并拖动光标穿过立方体，在所需区域上绘制选择形状（例如矩形）。正确选择区域后，右键单击该区域并选择"添加选择到图形"。
      2. 在显示的窗口"添加到图形"中，选择"创建新图形"以显示目标的排放光谱，然后单击"确定"。
        注：显示目标发射的图形上将显示一条新的彩色线（图 7中的 8），其中发射强度为 y 轴，x 轴处为波长。此频谱对应于每个波长所选区域的平均强度。
  4. 获得频谱后，在选择新区域之前保存它，因为一次只能选择一个区域。为此，请选择包含图形的窗口。在"文件"菜单中，选择"保存为"，然后选择使用选择的名称（以 .h5 格式（可在PHySpec软件中打开）或 .csv 格式（可在 Excel 中导入）将图形保存在您选择的文件夹中。

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Representative Results

为了说明高光谱显微镜在基于Ln的分子单晶（即[TbEu（bpm）（tfaa）6+，图1a）上采集数据的配置，图2显示了系统的概述以及光学立方体在设置中的正确位置。6图 3显示了包含 HSI 采集期间使用的菜单的 PHySpec 软件的屏幕截图。图 4和图 5更详细地显示了显微镜阶段，包括包含要分析的样品的玻璃幻灯片的位置。选定的紫外线照明被打开，以显示晶体的可见红色发光（图5中图4a和图1）。 Figure 5图 6a显示了在适当聚焦中调整样品后记录的晶体的明亮场图像。晶体的针状形态清晰可见。图 6b，c显示了紫外激发下同一晶体的图像，其图像具有全视图（图 6b）或局部限制 （图 6c） 照明。在宽的紫外光下，晶体不同面的发射亮度差异可立即显现出来。密闭照明可用作一种选择，主要用于研究晶体中能量或光传递的任何影响，从而触发波导行为。在这种情况下，在不直接激发的点中检测到强发射。这表明，有效的能量迁移通过晶体13（图7中的5和6）发生。

从获得高光谱立方体中，还可以进一步获得代表特定波长的图像形式的光谱分布、特定发射波长的强度曲线以及获得高光谱立方体任何像素或区域的发射光谱。例如，图 7（面板 4）中给出的排放光谱显示了 Eu3+电离的最典型发射带：在 590 nm 处观察到的频段分配给磁偶极子 （MD） 5D0+7F 1 E3+过渡，而该区域从超灵敏强制电偶极子 （ED） 5D0=7F2 Eu3+过渡处的排放峰值从 610 到 630 nm 的发射峰值。1众所周知，这两种过渡的集成强度之间的比率是单晶21结构中Ln3+电离周围化学环境的极佳探针：Ln3+电子周围的对称度越低，ED/MD比越大。这样就可以对Ln3+电龙化学环境的对称性得出结论。此外，5D0=7F2过渡的 Stark 分割也可以与其晶体环境中 Ln3+周围的对称性相关 - 对称性越低，斯塔克子级别的数量就越高。在低对称三角晶体系统中结晶的针状多态晶体中，5D0+7F2过渡分为四个子峰（如图 7所示，面板 4 所示）。在比较发光晶体的几种多态的光学特性时，这种分析特别有吸引力。此前，我们曾证明，光学分析所推断的化学环境信息与单晶X射线分析13所获得的分子晶体结构密切相关。此外，图 7（面板 3）所示的不同晶体面的光谱轮廓（指示尖端和侧面的更亮发射）也可以与 Ln3_[ ] 相关。Ln3+电离距离在三个空间方向（图1b）：沿垂直于尖端和侧面的轴的更密集的 Ln3+封装，分别有利于电离能量传递。因此，在各自的面上观察到辐射增强，因此，光学各向异性。

总体而言，图7和图8所示的各种数据分析选项构成了光谱和空间信息组合的最重要特征，HSI对发光样品的分析可以探讨这些特征。

Figure 1
图1：分子结构和晶体排列.（a ）a基于异核Ln的复合物[TbEu（bpm）（tfaa）6]的结构，其中6Ln1和Ln2是Tb3+和Eu3+离子。为了清楚起见，省略了无序的组和氢原子。颜色代码：Eu：暗青;C：灰色;O： 红色;N：蓝色;F：石灰绿色。（bi） 晶体中分子包装的表示：（i） 顶部视图和 （ii） 针状单晶体结构的尖端视图，以及选定的分子间和分子内 Ln_*Ln 距离（为了清晰起见，省略了 tfaa 子单位和氢原子）。（三） [TbEu（bmp）（tfaa）6= 二分器（为了清楚起见，省略氢原子）的晶体包装安排。（四） 暗子晶体生长面图，露出最短的Ln__Ln 距离（0 1 0）和 （2 -1 1） 晶体方向。该图已从参考文献 13 修改。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图2：高光谱成像系统的概述。所示是使用紫外线激发在可见光谱区域进行发光映射所需的配置。（a） 系统的一般视图，其中1是显微镜阶段，2是包含光学配置的部分，3是具有可见和近红外探测器的光谱仪。（b） 靠近显微镜阶段（a 右侧）的光学设置的打开视图，显示实验的光学配置：光学立方体位置4保持空，共聚焦显微镜立方体放置在位置5中，以便通过可见路径传递光线，将可见立方体放置在位置6中，以便将可见光定向到检测路径，并将共聚焦针孔立方体放置在位置7中，以便将光线路由到可见检测路径。（c） 靠近探测器（a 左侧）的光学设置的打开视图，显示位置8，其中共聚焦光谱仪立方体将光反射到光谱仪和可见摄像机。内侧9显示螺钉以调整光谱仪狭缝的开口宽度。（d） 显微镜阶段、计算机和宽带灯（用于紫外线激发）控制器的视图。在内部，宽带灯控制器显示更多细节：10是开/关按钮，11是控制灯强度的旋钮，12是快门按钮。（e） 显示从显微镜阶段到探测器的可见/NIR光学路径的方案，包括从 4到8的光学立方体位置。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图3：PHySpec软件的屏幕截图，显示菜单的参数为HSI调整。11允许在彩色摄像机图像中插入比例条;2和3分别允许控制彩色摄像机的曝光时间和增益值;正确的客观透镜必须选择在4;5允许选择针孔的光圈;6（分流器）和7（过滤器）分别允许选择探测器和光栅;可见探测器的曝光时间设定在8。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 4
图4：显微镜阶段的一般视图。（a） 将包含样品的玻璃幻灯片放置在舞台上，紫外线照明 ON 显示样品的红色发光（玻璃幻灯片中央的小红点）。（b） 顶部使用白光照明冷凝器查看显微镜舞台。（c） 舞台控制器显示控制舞台在橙色和黄色箭头指示的方向上移动的操纵杆（也显示在 （a） 中）。（d） 焦点按钮的详细视图，该按钮以红色箭头指示的方向移动舞台（也显示在 （b）中）。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 5
图 5：显微镜阶段的组件。1显微镜阶段，将玻璃幻灯片上的样品放在目标镜片顶部的样品舞台上;2个轮子来调整对焦（大轮），并将捕获的发射（小轮）引导到探测器（L），部分转向探测器，部分转向相机（R），或仅定向双筒望远镜镜头（眼睛）;3个激励/发射滤轮用于选择激发波长范围。右侧的详细信息显示了保存本实验中使用的 UV 滤光片和长通滤波器的滤波立方体;顶部/底部的4个显示旋钮，以移动激励光束通过样品，而中间，圆形场孔径控制;5个目标镜头;6白光照明的开/关按钮;7旋钮调节白灯的亮度。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 6
图6：分析的单晶光学显微镜图像。这些图像是在 （a） 白光照明下获得的， （b） 全视图紫外线照明， 使用激发圆形光圈完全打开， 和 （c） 局部限制的紫外线照明 （由白色圆圈标记）， 使用更密切的激发圆形光圈.请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 7
图 7：显示高光谱立方体数据分析过程的 PHySpec 软件的屏幕截图。不同的光谱分析方法可应用于采集的超光谱立方体：1显示为2所示的光谱图像分布选择的波长;3显示了 613.26 nm 水平 （7） 和垂直 （8） 强度轮廓;4显示了从目标 5 和 6 以及 9 突出显示的区域提取的发射光谱。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 8
图8：HSI的替代应用，探讨上转化纳米粒子和兰他化物复合物之间的协同效应。此示例显示了由分子晶体（[Tb 2（bpm）（tfaa）26+）组成的混合系统的高光谱分析与向上转换的纳米粒子（NaGdF4：Tm3+，Yb3+）相结合。（a） 白色和紫外线光照下的显微图，以及用于980纳米光照射下高光谱成像的感兴趣区域（ROI）。（b） Tm3+和间接 Tb3+排放在 20 x 20 μm2的区域内被监测。（c） 在整个混合系统中，发射带的绝对强度变化波动，表明分布在表面的材料总量存在一些变化。（d）复合体与 Tm3+： 1G4+3H6 （平方） 和 Tm3+： 1G4+3F4 （圆） 之间的综合发射比例的恒定性证实了两个摩尔在整个混合系统中同时存在，以及它们之间的同质相互作用。光显微图中的比例条为 20 μm，在 ROI 和光谱贴图中为 5 μm。显微图以真实颜色呈现。图已由参考 11 修改。请点击此处查看此图形的较大版本。

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Discussion

此处描述的高光谱成像协议提供了一种直接的方法，允许在样品的精确位置获取光谱信息。使用所述设置，空间分辨率（x和y映射）可以达到 0.5 μm，而可见范围内的映射的光谱分辨率可以达到 0.2 nm，NIR 范围的光谱分辨率为 0.6 nm。

为了对单个晶体进行高光谱映射，样品制备遵循一个简单的过程：晶体可以简单地放置在玻璃显微镜幻灯片上，根据需要由盖玻璃覆盖。在软件中的颜色相机设置中使用适当的客观镜头和亮场图像对样品进行聚焦，是预分析阶段获得最佳分辨率高光谱图像的非常重要的一步。通常，当样品聚焦良好时，获得更高的排放强度。完成此操作后，分析参数的选择（如x和y计数和步长大小）将分别决定获取的高光谱立方体的视场和空间采样。但是，目标的数值孔径和激发/发射波长决定了在每个采集点探测的样品的实际体积。例如，对于本研究中使用的目标，数值孔径 （NA） 为 0.4，并在 UV 光谱范围 （390 nm） 中使用激发，聚焦激光光点在x和y方向上的大小约为 0.6 x 0.6 μm。激光点的大小是使用网站计算的（https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna，2019年9月26日访问）。如果所选步长大小大于空间采样，则实际采样的区域可能小于步长大小给出的区域。如果样品是均匀的，则采样不足可能不是问题。然而，如果样品的空间变化对检测很重要，则通过将步长大小设置为样品上激光束的一半，获得最佳采样。所选的曝光时间和 UV 选择照明的强度将控制获得光谱的强度。此类参数因样品而异，具体取决于发射强度和对紫外线激发的灵敏度。

此时，协议内的关键步骤可以列出：光学系统的对齐、光学立方体的正确放置、激发和探测器狭缝开口的圆形孔长度的调节、针孔的选择、彩色相机中样品的聚焦以及宽带灯的强度以及长通滤波器立方体的正确选择（允许紫外线激发），以及上述正确步长尺寸和曝光时间的选择。最后，在高光谱立方体采集的所有时间，房间灯必须熄灭。

如果使用彩色摄像机或光谱仪的信号检测不良，该技术的故障排除应包括在开始高光谱立方体采集之前仔细检查上述每个关键步骤。在显微镜阶段输出信号的配置也很重要。三种可能的配置是：眼睛（100%的输出信号发送到显微镜双筒式安装）、L（100% 输出信号发送到探测器）和 R（80% 的输出信号发送到探测器，20% 发送到显微镜双筒式安装）。在高光谱立方体采集过程中，必须使用 R 或 L 配置。如果正确选择上述所有参数，则可以获得样品的高分辨率空间和光谱信息。

本文所述对技术的一些可能修改可以用其他系统的高光谱成像来说明，例如发光微粒子14或由分子晶体组成的光学混合系统，结合上转换纳米粒子（图8）11。11在这些示例中，NIR 激光二极管 （980 nm） 用作激励源，取代紫外线激发，同时检测生成的可见发射。在混合系统的后一个示例中，HSI揭示了混合薄膜的同质性，这些混合薄膜将向上转换的纳米粒子（NaGdF4：Tm3+，Yb3+）和 [Tb2（bpm）（tfaa）6= 晶体结合成多波长响应各向异性系统，表现出材料和分子之间的能量转移（图8）11。此外，通过使用系统的InGaAs探测器，可以探测近红外光谱区域（1000至1700nm）中的排放。在寻求研究基于近红外的生物医学应用光学探头时，这尤其令人感兴趣。在这种情况下，必须为 NIR 路径设置系统的光学立方体配置（图 2e）。在NIR激励-NIR发射的情况下，此处描述的高光谱技术的限制之一变得显而易见：由于与波长相关，NIR区域的光谱分辨率低于可见探测的光谱分辨率，即大约0.6nm（与0.2nm）。此外，对于子1 μm特征，例如较小的分子晶体、纳米粒子或混合系统，由系统配置（使用的目标和激励/发射波长）决定的空间分辨率成为另一个潜在的限制。

最后，（无论选择的 HSI 配置和波长系统如何），数据操作都可以使用仪器的软件进行，或者，如光谱配置文件所示，可以导出以在其他软件包（如原点®或 Microsoft Excel）中进行分析。在我们的示例中，在彩色摄像机图像中也及时揭示了晶体的光学相向异性，即不同晶体表面的强强度变化。此外，在宽紫外激发下，根据分析的面，获得不同的发射强度（图7）。获得晶体不同点发射强度剖面的可能性（图7中的目标）进一步允许研究发射强度的变化，如果存在，则也以光谱形状进行研究。[TbEu（bpm）（tfaa）6的块状多态构成一个例子，其中两个晶体面表现出同样高的排放强度，第三个13的发射强度较低。在此，如果系统没有任何自给性，所有晶体面的排放强度都是一样的。

例如，探测光学各向异性的补充方法与样品中存在偏振发射有关。其中包括偏振记忆或光谱椭圆测定。第一种是材料发射的光的偏振状态与射入射光的偏振状态之间的相关性，22、23，,23后者测量光的偏振状态变化，经薄样膜24倾斜反射后。然而，使用高光谱成像作为探测光学各向异性的工具的优点，如这里所示，其优点是，极化的存在不是样品分析的要求。此外，样品制备不需要制造薄膜，也不要求对入射和采集光的晶体进行非常仔细的方向处理。这些方面使得HSI技术具有更广泛的应用性。此外，各向异性特征在图像采集时会迅速可视化，数据分析非常简单（如上文所示）。

考虑到更广泛的范围，HSI技术的意义可以归因于其独特特性，即以依赖于环境的特征对光信号进行核心化。例如，这种联系对于增进对纳米-生物相互作用33、15、16在纳米医学领域的认识，甚至理解材料科学中的结构-属性关系,16，对于理解10、11、12、13。至关重要。,11,12,1315因此， 本文所述技术的未来潜在应用可以命名为：对体外、体外和体内生物样品的分析，对生物感兴趣的分子进行映射4、6，6适应显微镜阶段以研究环境特定的光电子特性（例如4嵌入电路中的样品）、光学温度传感8、15（15通过在显微镜阶段添加温度控制器）或气体感应（通过调整显微镜阶段）。8HSI进一步被证明适合荧光激发技术，而不是荧光发射25。使用这种特殊的高光谱技术适应的一个很好的例子是检测在生物组织6中的癌细胞。因此，这里描述的议定书有可能在很大程度上扩展到研究许多不同类型的发光结构的光谱特征。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。作者没有相互竞争的财务利益。

Acknowledgments

作者感谢渥太华大学化学和生物分子科学系的迪伦·埃鲁拉特先生和穆拉利·穆鲁格苏教授提供[TbEu（bpm）（tfaa）6] 单晶。6E.M.R.、N.R.和E.H.感谢渥太华大学、加拿大创新基金会和加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）提供的财政支助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope glass slides FisherBrand 12-550-15 Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager PhotonETC Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number

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化学， 第 158 期， 高光谱成像， 光致发光， 蓝层， 单晶， 光学各向异性， 发光映射
高光谱成像作为研究基于兰塔尼的分子单晶光学自给性的工具
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Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).

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