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Chemistry

Hyperspektrale Bildgebung als Werkzeug zur Untersuchung der optischen Anisotropie in Lanthanid-basierten molekularen Einzelkristallen

doi: 10.3791/60826 Published: April 14, 2020

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um lumineszierende hyperspektrale Bildgebungsdaten zu erhalten und optische Anisotropie-Features von Lanthanid-basierten Einzelkristallen mit einem Hyperspektral Imaging System zu analysieren.

Abstract

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für eine neuartige Anwendung der hyperspektralen Bildgebung (HSI) bei der Analyse von lumineszierendem Lanthanid (Ln3+)basierenden molekularen Einzelkristallen. Als repräsentatives Beispiel wählten wir einen einzigen Kristall des heterodinuklearen Ln-basierten Komplexes [TbEu(bpm)(tfaa)6] (bpm=2,2'--bipyrimidin, tfaa =1,1,1-trifluoroacetylacetonate), der eine helle sichtbare Emission unter UV-Erregung aufweist. HSI ist eine aufkommende Technik, die die zweidimensionale räumliche Bildgebung einer lumineszierenden Struktur mit spektralen Informationen aus jedem Pixel des erhaltenen Bildes kombiniert. Insbesondere lieferte HSI auf Einzelkristallen des [Tb-Eu]-Komplexes lokale spektrale Informationen, die Variationen der Lumineszenzintensität an verschiedenen Punkten entlang der untersuchten Kristalle enthüllten. Diese Veränderungen wurden auf die optische Anisotropie im Kristall zurückgeführt, die sich aus der unterschiedlichen molekularen Verpackung von Ln3+ Ionen in jeder der Richtungen der Kristallstruktur ergibt. Das hier beschriebene HSI ist ein Beispiel für die Eignung einer solchen Technik für spektroräumliche Untersuchungen molekularer Materialien. Dennoch ist es wichtig, dass dieses Protokoll leicht auf andere Arten von leuchtminen Materialien erweitert werden kann (z. B. molekulare Kristalle in Mikrogröße, anorganische Mikropartikel, Nanopartikel in biologischen Geweben oder markierte Zellen, die viele Möglichkeiten für eine tiefere Untersuchung von Struktur-Eigenschaft-Beziehungen eröffnen. Letztlich werden solche Untersuchungen Wissen liefern, das in die Entwicklung fortschrittlicher Materialien für eine breite Palette von Anwendungen wie Bioimaging bis hin zu technologischen Anwendungen wie Wellenleitern oder optoelektronischen Geräten genutzt werden kann.

Introduction

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Hyperspektrale Bildgebung (HSI) ist eine Technik, die eine räumliche Karte generiert, bei der jede x-y-Koordinate spektrale Informationen enthält, die auf jeder Art von Spektroskopie basieren könnten, nämlich Photolumineszenz-, Absorptions- und Streuspektroskopien1,2,3. Als Ergebnis wird ein dreidimensionaler Datensatz (auch "Hyperspektralwürfel" genannt) erhalten, wobei die x-y-Koordinaten die räumlichen Achsen und die z-Koordinate die Spektralinformationen aus der analysierten Stichprobe sind. Daher enthält der hyperspektrale Würfel sowohl räumliche als auch spektrale Informationen, die eine detailliertere spektroskopische Untersuchung der Probe als die herkömmliche Spektroskopie bieten. Während HSI seit Jahren im Bereich der Fernerkundung bekannt ist (z.B. Geologie, Lebensmittelindustrie4), hat es sich vor kurzem als innovative Technik zur Charakterisierung von Nanomaterialien2,5 oder Sonden für biomedizinische Anwendungen3,6,7,8entwickelt.., Im Allgemeinen ist sie nicht auf die UV/visible/near-infrared (NIR) Domäne beschränkt, sondern kann auch mit anderen Strahlungsquellen, wie Röntgenstrahlen – zum Beispiel zur Charakterisierung der Elementarverteilung in verschiedenen Materialien9 – oder Terahertz-Strahlung erweitert werden, bei der HSI zur thermischen Erfassung in biologischen Geweben8verwendet wurde. Darüber hinaus wurde photoluminescence mapping mit Raman Mapping kombiniert, um die optischen Eigenschaften von Monolayer MoS210zu untersuchen. Unter den gemeldeten Anwendungen von optischem HSI gibt es jedoch nur wenige Beispiele für HSI von Lanthanid-basierten Materialien11,12,13,14,15,16,17. Zum Beispiel können wir zitieren: Nachweis von Krebs im Gewebe6, Analyse der Lichtdurchdringungstiefe in biologischen Geweben7, Multiplexed biologische Bildgebung3, Analyse der Mehrkomponenten-Energieübertragung in Hybridsystemen11, und Untersuchung von Aggregation-induzierten Veränderungen der spektroskopischen Eigenschaften von upconverting nanoparticles12. Die Attraktivität von HSI ergibt sich eindeutig aus seiner Eignung zur Generierung von Wissen über umgebungsspezifische Lumineszenz, die gleichzeitige räumliche und spektrale Informationen über die Sonde liefert.

Unter Ausnutzung dieser leistungsstarken Technik beschreiben wir hier ein Protokoll zur Untersuchung der optischen Anisotropie des heterodinuklearen Tb3+-Eu3+ Einzelkristalls [TbEu(bpm)(tfaa)6] (Abbildung 1a)13. Die beobachtete optische Anisotropie resultierte aus der unterschiedlichen molekularen Verpackung der Ln3+-Ionen in den verschiedenen kristallographischen Richtungen(Abbildung 1b), was dazu führte, dass einige Kristallflächen heller waren, andere dimmerphotolumineszenz zeigten. Es wurde vermutet, dass die erhöhte Lumineszenzintensität an bestimmten Flächen des Kristalls mit einer effizienteren Energieübertragung entlang dieser kristallographischen Richtungen korrelierte, in denen die Ln3+ Ln3+ Ionendistanzen waren die kürzesten13.

Motiviert durch diese Ergebnisse schlagen wir die Einrichtung einer detaillierten Methodik zur Analyse der optischen Anisotropie durch HSI vor, die den Weg für ein besseres Verständnis von Ionen-Ionen-Energieübertragungsprozessen und abstimmbaren Leuchteigenschaften öffnet, die sich aus der spezifischen molekularen Anordnung18,19ergeben. Diese Struktur-Eigenschaften-Beziehungen wurden als wichtige Aspekte für innovative optische Materialgestaltung anerkannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wellenleitersysteme und optomagnetische Speichergeräte im Nano- und Mikromaßstab – um die Nachfrage nach effizienteren und miniaturisierten optischen Systemen zu decken20.

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Protocol

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VORSICHT: Es wird empfohlen, Sicherheitsbrillen zu verwenden, die speziell für die Anregungswellenlänge verwendet werden, die bei der Bedienung des Imagers jederzeit verwendet wird.

1. Konfiguration des Hyperspektralmikroskops

HINWEIS: Eine Übersicht über das hyperspektrale Bildgebungssystem ist in Abbildung 2aenthalten, wobei die Hauptkomponenten des Imagers beschrieben werden. Das Bildgebungssystem kann zur Detektion der sichtbaren oder nahinfraroten (NIR) Emission aus einer Probe verwendet werden. Je nachdem, welche Detektion gewünscht wird (sichtbar oder NIR), geht das Licht durch zwei verschiedene Lichtpfade(Abbildung 2e). Eine Kombination aus verschiedenen Strahldrehwürfeln und dichroitischen Filterwürfeln (optische Würfel) muss an bestimmten Positionen im Instrument positioniert werden, um den jeweiligen Pfad auszuwählen.

  1. Schalten Sie den Computer ein, der mit dem Bildgebungssystem verbunden ist. Schalten Sie den Monitor des Computers ein.
  2. Legen Sie die entsprechende konfiguration des optischen Cubes fest (Abbildung 2b,c).
    HINWEIS: Hier wird die Imagerkonfiguration(optische Würfelkonfiguration) für die HSI-Zuordnung mit UV-Anregung und sichtbarer Emissionserkennung beschrieben. Je nach analysierter Probe ist es jedoch auch möglich, sie für die NIR-Erregung und die sichtbare oder NIR-Emissionsdetektion zu ändern. Ein Beispiel finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
    1. Ausgehend von der Mikroskopstufe (1 in Abbildung 2a) und nach dem Emissionsstrahlweg in Richtung der Detektoren (3 in Abbildung 2a)verlassen Sie die erste Position für einen optischen Würfel (4 in Abbildung 2b) frei und platzieren Sie den konfokalen optischen Würfel des Mikroskops (DFM1-P01) in der Position, die in Abbildung 2bals 5 angegeben ist, so dass die Emission aus der Probe durch den sichtbaren Lichtpfad geleitet wird.
    2. Wenn Sie den optischen Weg zum Detektor betrachten, platzieren Sie den sichtbaren optischen Würfel (CM1-P01), der den dichroitischen Spiegel und die Filter enthält, um die sichtbare Emission auf die Erfassungspfade zu lenken, an der Position, die in Abbildung 2bals 6 angegeben ist.
    3. Wenn Sie den Weg zum Detektor fortsetzen, platzieren Sie den konfokalen optischen Pinlochwürfel (DFM1-P01) in der Position, die in der Abbildung 2b als 7 angegeben ist, um das Licht durch den sichtbaren Lichterfassungspfad zu lenken. Legen Sie dann nach dem Pfad den optischen Kubokmeter (DFM1-P01) in Abbildung 2c an Position 8, damit das emittierte Licht den Detektor erreicht.
    4. Für die HSI-Mapping, manuell steuern Sie die Detektor-Schlitzöffnung (9 in Abbildung 2c) um die Größe der verwendeten Lochlöcher (ca. 50 mm ist optimal).
    5. Wählen Sie in der PHySpec-Software die Blende des Lochs aus (5 in Abbildung 3).
      HINWEIS: Je kleiner die Lochöffnung, desto besser ist die HSI-Auflösung auf Kosten der Signalintensität.
  3. Schalten Sie die Breitbandlampe(Abbildung 2d, Inset) ein, indem Sie den Schalter (10 in Abbildung 2d)in die ON-Position positionieren. Um die Intensität des Anregungslichts zu steuern, drehen Sie den mit 11 (Abbildung 2d) angezeigten Knopf auf höhere (32 – niedrigste Intensität) oder niedrigere Werte (1 – höchste Intensität). Halten Sie den Breitband-Lampenverschluss (12 in Abbildung 2d) während des Aufbaus geschlossen.
    HINWEIS: Die höheren Werte entsprechen einer höheren Dämpfung der von der Lampe emittierten Leistungsdichte, während niedrigere Werte einer niedrigeren Dämpfung entsprechen.
  4. Schalten Sie die folgende Hardware in der unten angegebenen Reihenfolge ein, indem Sie ihre Schalter in die ON-Position setzen:
    1. Schalten Sie den ThorLabs-Bewegungscontroller ein.
    2. Schalten Sie die Nikon-Stromquelle ein.
    3. Schalten Sie den ASI-Controller ein.
    4. Schalten Sie den Galvo-Controller ein.
    5. Schalten Sie den ProEm-Detektor ein.
    6. Schalten Sie den Bayspec-Detektorein.
  5. Öffnen Sie am Computer die PHySpec-Software, indem Sie auf das entsprechende Symbol doppelklicken.
    1. Drücken Sie die F8-Taste auf der Tastatur, um das IMA Upconversion-System zu initialisieren, und klicken Sie im Fenster Verbinden mit System auf die Schaltfläche OK.
      HINWEIS: Schritt 1.5.1. kann auch durchgeführt werden, indem Sie auf die Registerkarte System klicken und dann auf Verbinden klicken, um zum Fenster Verbinden mit System zu gelangen. Dann kann auf die Schaltfläche OK geklickt werden, um das Bildgebungssystem mit der Software zu verbinden.
    2. Stellen Sie sicher, dass alle Menüs auf der Benutzeroberfläche (Farbkamera, ProEm und Bayspec) sowie auf der Instrumentensteuerung auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt werden, wie in Abbildung 3dargestellt.

2. Hyperspektrale Bildgebung eines [TbEu(bpm)(tfaa)6]

  1. Um die Probe vorzubereiten, legen Sie den Kristall auf eine Mikroskopie Glasrutsche. Falls es notwendig ist, eine höhere Vergrößerung zu verwenden, bedecken Sie den Kristall mit einem dünnen Deckglas und befestigen Sie ihn mit Klebeband, so dass die Probe mit dem dünnen Deckglas zur Objektivlinse hin platziert werden kann.
  2. Legen Sie die Glasrutsche, auf die die Probe vorbereitet wurde, auf die Mikroskopbühne und sichern Sie sie mit den Metallarmen (Abbildung 4a,b).
  3. Verschieben Sie die Probe mit dem Joystick (Abbildung 4c) des ASI-Controllers, um die Probe über den verwendungsgemäßen Zielen zu positionieren.
  4. Positionieren Sie den rechten Filterwürfel manuell im Rad unter den Zielen (3 in Abbildung 5), um die UV-Erregung der Lampe auszuwählen und die sichtbare Emission in Richtung des Detektors passieren zu lassen.
    HINWEIS: Zusätzliche Filterwürfel stehen zur Verfügung, um entweder grüne oder blaue Lichtanregung zu verwenden, daher ist es wichtig, den richtigen Filterwürfel an Ort und Stelle zu haben, um die entsprechende Anregungswellenlänge zu erhalten.
  5. Positionieren Sie das 20X-Objektiv (angezeigt durch 5 in Abbildung 5) manuell unter der Probe und drücken Sie die weiße Taste (6 in Abbildung 5) auf der linken Seite des Mikroskops, um das weiße Licht einzuschalten.
    1. Stellen Sie die Helligkeit ein, indem Sie den Knopf unter dem weißen Licht-Power-Regler drehen (7 in Abbildung 5).
  6. Drücken Sie in der PHySpec-Software die Play-Taste (Video) im Farbkamerafenster, wodurch ein Live-Scan erstellt wird.
    1. Wenn im Farbkamerafenster ein schwarzes Bild angezeigt wird, erhöhen Sie die Belichtungszeit (2 in Abbildung 3) und/oder den Gain-Wert (3 in Abbildung 3), der sich im Bedienfeld des Instruments unter der Registerkarte Farbkamera befindet. Wenn das angezeigte Bild zu hell ist, verringern Sie die Belichtungszeit und/oder den Gain-Wert.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Vorwärtsknopf auf der rechten Seite des Mikroskops (2 in Abbildung 5) auf R eingestellt ist, um 20 % des Signals an die Kamera/das Fernglas und 80 % des Signals an den Detektor zu senden.
  7. Konzentrieren Sie sich auf die Stichprobe, indem Sie den Abstand zwischen dem Objektiv und der Stufe anpassen (Abbildung 4b). Dies geschieht durch Drehen der in Abbildung 4d dargestellten Knöpfe auf der rechten Seite des Mikroskops.
    HINWEIS: Der größere Knopf wird für grobe Einstellungen verwendet, während der kleinere Knopf für zartere und kleine Fokusänderungen ist.
  8. Stellen Sie sicher, dass das manuell gewählte Ziel auch in der Software ausgewählt ist. Klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche Ansicht in der oberen Menüleiste, und klicken Sie dann auf eine Maßstabsleiste anzeigen/ausblenden, um die Maßstabsleiste auf dem Bild anzuzeigen (1 in Abbildung 3). Gehen Sie dann auf die Registerkarte Galvanometer im Befehlsbedienfeld und wählen Sie das verwendete Ziel aus (4 in Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass die angezeigte Skalenleiste korrekt ist, indem Sie das richtige Ziel in der Software auswählen.
  9. Wählen Sie in der Software den entsprechenden Detektor aus, indem Sie auf die Registerkarte Diverter (ProEM – 6 in Abbildung 3) und Gitterrosten gehen, indem Sie zum Tabfilter (1200 gr/mm bei ProEM – 7 in Abbildung 3) unter der Registerkarte SpectraPro SP-2300 gehen.
  10. Öffnen Sie den Breitband-Lampenverschluss (12 in Abbildung 2), damit die UV-Erregung der Probe stattfinden kann. Drehen Sie den Intensitätsknopf (11 in Abbildung 2d) auf die gewünschte Position (z. B. 8 – Zwischenintensität), um die Intensität der Breitbandlampe (UV) Zustärke zu steuern.
    1. Um zwischen einer Breitenfeldbeleuchtung (offene Öffnung) oder einer kleineren Spotbeleuchtung (geschlossener Blende) zu wählen, steuern Sie die Größe der UV-Lampenfeldöffnung mit dem Stick und den Knöpfen, die in 4 in Abbildung 5dargestellt sind.
  11. Wählen Sie unter der Registerkarte SpectraPro SP-2300 eine Wellenlänge aus, um die Probenemission zu beobachten.
  12. Wenn die Emissionswellenlängen der Probe unbekannt sind, erfassen Sie ein Emissionsspektrum.
    1. Klicken Sie im Sequenzer auf das +-Zeichen, um eine neue Sequenz ("Knoten") für die Erfassung eines Emissionsspektrums hinzuzufügen.
      1. Klicken Sie auf Spektrometer und dann Spektrumerfassung (mit Spektralscan).
      2. Geben Sie eine Minimale Wellenlänge (d. h. 400 nm) und eine maximale Wellenlänge (d. h. 700 nm) ein und klicken Sie auf OK, um den Spektralbereich festzulegen, in dem das Spektrum aufgezeichnet wird.
      3. Wählen Sie die passende Belichtungszeit im linken Menü der Software aus. Wählen Sie kürzere Zeiten (z.B. 0,1 s) für sehr helle Proben und längere Zeiten (z.B. 2 s) für Dim-Emitter.
      4. Stellen Sie die Anregungsleistung bei der Anregung der Breitbandlampe (UV) ein (siehe Schritt 1.3 oben).
        HINWEIS: Im Falle einer NIR-Diodenerregung kann es über das Dropdown-Menü Neutraldichte auf der linken Seite der PHySpec-Software eingestellt werden.
    2. Klicken Sie auf den Sequenzer auf die Doppelabspiel-Schaltfläche, um die gesamte Sequenz auszuführen. Beachten Sie nach der Anzeige des Spektrums die Bereiche, die für den Nachweis der Probenemission von Interesse sind(z. B. 580 bis 640 nm bei Tb3+- und Eu3+-basierten Proben).
    3. Optimieren Sie bei Bedarf die Signalerkennung, indem Sie entweder den Fokus der Probe ändern oder die Belichtungszeit in der PHySpec-Software anpassen. Erzielen Sie eine weitere Optimierung der Signalerkennung durch die Erhöhung der Probenemissionsintensität durch Änderung der Leistung der Anregungsquelle (Breitbandlampe), wie oben beschrieben.
  13. Passen Sie die Belichtungszeit (z. B. 0,5 s – 2 in Abbildung 3) und Gain (3 in Abbildung 3) der Farbkamera entsprechend an, um ein Bild in guter Qualität zu erhalten. Fügen Sie bei Bedarf die Maßstabsleiste zum Bild hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Maßstabsleiste anzeigen/ausblenden in der zweiten Zeile des Menüs oben im PHySpec-Softwarefenster klicken.
  14. Empfehlung: Zeichnen Sie vor dem Erwerb des hyperspektralen Würfels ein helles optisches Mikroskopiebild des Kristalls unter weißem Licht auf (Abbildung 6a) und/oder UV-Voll (Abbildung 6b) oder eingeschränkt (Abbildung 6c) Beleuchtung (UV-Beleuchtung, gesteuert durch die Verschlussöffnung, dargestellt als 4 in Abbildung 5). Klicken Sie dazu mit dem Sample im Fokus auf den Wiedergabeknopf der Farbkamera.
  15. Klicken Sie auf Datei und dann Fensteransicht exportieren, wählen Sie das gewünschte Format aus, um das erhaltene Bild zu exportieren, und speichern Sie die Datei mit der gewünschten Erweiterung (.h5, . JPEG).
  16. Bevor Sie das hyperspektrale Bild erfassen, schalten Sie die weiße Lichtbeleuchtung sowie das Raumlicht aus.
  17. Um den hyperspektralen Cube zu erhalten, schreiben Sie eine neue Sequenz. Klicken Sie daher im Sequenzer auf das +-Zeichen, um einen neuen Knoten hinzuzufügen.
    1. Klicken Sie auf Confocal Imager.
      1. Klicken Sie auf Multi-Spectrum Acquisition. Hier wird das gewünschte Sichtfeld durch die Anzahl der Punkte definiert, die in x- und y-Richtung erfasst werden sollen, und die Schrittgröße. Verwenden Sie z. B. 100 Punkte in x und 100 Punkte in y mit einer Schrittgröße von 5 m, um ein Bild von 500 x 500 m zu erhalten.
        Hinweis: Die Gesamtzahl der Erfassungspunkte und die Integrationszeit an jedem Punkt wirken sich direkt auf die Gesamterfassungszeit des Hyperspektralcubes aus.
        1. Geben Sie die gewünschte X-Position (z.B. 100) und Y-Position (z.B. 100) sowie die gewünschte Schrittgröße (z.B. 5 m) ein. Wählen Sie die Option Hardware für die Kamerasynchronisierung für die sichtbare Emissionszuordnung (und Softwareoption im Falle der NIR-Erkennung). Klicken Sie auf OK.
  18. Klicken Sie im Sequenzer auf die neu hinzugefügte Multi-Spectrum-Erfassungszeile, um den Knoten hervorzuheben.
  19. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um den ausgewählten Knoten auszuführen.
    HINWEIS: Die verbleibende Zeit, die die Erfassung in Anspruch nimmt, wird neben dem Knoten angezeigt (in Minuten, z. B. 28 min).
  20. Speichern Sie den Hyperspektralwürfel im entsprechenden Dateiformat (.h5).

3. Hyperspektrale Datenanalyse

  1. Direkt nach der Erfassung, wenn der gespeicherte hyperspektrale Würfel nicht automatisch in der Software geöffnet wird, stellen Sie den hyperspektralen Würfel wieder her, der als .h5-Datei gespeichert wurde, indem Sie in der oberen Menüleiste auf Datei klicken und dann den Cursor bewegen und auf Datei öffnen klicken.... Wenn das Fenster mit dem Titel Daten auswählen erscheint, wählen Sie den Ordner aus, in dem die .h5-Datei gespeichert ist, und klicken Sie auf die Datei, um sie zu öffnen.
  2. Nachdem die hyperspektrale Würfeldatei importiert wurde, ändern Sie das angezeigte hyperspektrale Würfelbild, um die Intensität einer bestimmten Spektralwellenlänge anzuzeigen, indem Sie den Balken auf der Oberseite des Würfelbildes nach links (untere Wellenlänge, z. B. 580 nm) oder rechts (höhere Wellenlänge, z. B. 638 nm) bewegen.
    HINWEIS: Die ausgewählte Wellenlänge wird auf der linken Seite dieses oberen Balkens angezeigt (1 in Abbildung 7).
  3. Nach der Wahl der Wellenlänge von Interesse für die Analyse(z.B.die maximale Intensität, die im Fall von [TbEu(bpm)(tfaa)6] 613.26 nm beträgt), machen Sie eine (oder alle) der drei möglichen Arten der Spektralanalyse: (A) die Spektralverteilung in Form eines Bildes (2 in Abbildung 7); (B) ein Emissionsintensitätsprofil in einer Interessenregion (3 in Abbildung 7); (C) Extraktion eines Spektrums an einem bestimmten Punkt oder einer bestimmten Interessenregion (4 in Abbildung 7).
    1. Im Falle der Spektralverteilung von einem Bild verwenden Sie die Crop- und Bin-Funktion, um das Signal-Rausch-Verhältnis im Bild zu erhöhen. Um dies zu tun, klicken Sie im oberen Menü Verarbeitung dann wählen Sie Daten und dann die Option Zuschneiden und Bin.
    2. Für ein Emissionsintensitätsprofil klicken Sie auf dem Cubebild mit der rechten Maustaste auf das Profil Ziel erstellen oder X erstellen oder Y erstellen, je nachdem, ob nur ein Punkt (Ziel - 5 und 6 in Abbildung 7) oder eine Linie (Profil - 7 und 8 in Abbildung 7) analysiert werden muss. Wählen Sie den Analysebereich aus, indem Sie das Ziel, das horizontale oder das vertikale Linienprofil mit dem Cursor ziehen und über den Cube bewegen.
      1. Nachdem das Profil ordnungsgemäß ausgewählt wurde, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Region, und wählen Sie das Ziel zu Diagramm hinzufügenaus. Wählen Sie die Option zum Erstellen eines neuen Diagramms, um die Emissionsintensität(y-Achse) als Funktion der physikalischen Position des Ziels(x-Achse) anzuzeigen. Das Spektrum wird auf dem neuen Diagramm angezeigt, das eingefügt wurde (6 und 7 in Abbildung 7).
        HINWEIS: Es können mehrere Ziele erstellt werden, die als unterschiedliche farbige Emissionsprofile angezeigt werden (5 und 6 in Abbildung 7).
    3. Alternativ können Sie ein Emissionsspektrum eines bestimmten Bereichs der Probe erhalten (9 in Abbildung 7). Bewegen Sie zunächst den Mauszeiger über das Cubebild, und klicken Sie mit der rechten Maustaste. Klicken Sie auf die Optionen Rechteckauswahl oder Ellipsenauswahl auf der Registerkarte, die angezeigt wird.
      1. Zeichnen Sie die Auswahlform (z. B. ein Rechteck) über den gewünschten Bereich, indem Sie auf den Cursor klicken und über den Würfel ziehen. Nachdem der Bereich ordnungsgemäß ausgewählt wurde, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Region, und wählen Sie die Option Auswahl zu Diagramm hinzufügenaus.
      2. Wählen Sie im angezeigten Fenster Zum Diagrammhinzufügen aus, um die Emissionsspektren des Ziels anzuzeigen, und klicken Sie auf OK.
        ANMERKUNG: In der Grafik, in der die Zielemission angezeigt wird, wird eine neue farbige Linie (8 in Abbildung 7)angezeigt, wobei die Emissionsintensität als y-Achse und die Wellenlänge an der x-Achse angezeigt werden. Dieses Spektrum entspricht der gemittelten Intensität des ausgewählten Bereichs für jede Wellenlänge.
  4. Nachdem das Spektrum abgerufen wurde, speichern Sie es, bevor Sie eine neue Region auswählen, da jeweils nur eine Region ausgewählt werden kann. Wählen Sie dazu das Fenster aus, in dem sich das Diagramm befindet. Wählen Sie im Menü Datei die Option Speichern unter aus, und wählen Sie aus, ob Sie das Diagramm im Ordner der Wahl speichern möchten, indem Sie den Namen der Wahl verwenden, entweder im .h5-Format, das in der PHySpec-Software geöffnet werden kann, oder im .csv-Format, das in Excel importiert werden kann.

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Representative Results

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Zur Veranschaulichung der Konfiguration des Hyperspektralmikroskops für die Datenerfassung auf einem Ln-basierten, molekularen Einzelkristall (d.h. [TbEu(bpm)(tfaa)6], Abbildung 1azeigt Abbildung 2 einen Überblick über das System sowie die richtige Platzierung der optischen Würfel im Setup. Abbildung 3 zeigt einen Screenshot der PHySpec-Software mit den Menüs, die während der HSI-Erfassung verwendet wurden. Abbildung 4 und Abbildung 5 zeigen die Mikroskopstufe detaillierter, einschließlich der Platzierung des Glasschlittens, der die zu analysierende Probe enthält. Die ausgewählte UV-Beleuchtung wurde aktiviert, um die sichtbare rote Lumineszenz des Kristalls anzuzeigen (Abbildung 4a und 1 in Abbildung 5). Abbildung 6a zeigt ein helles Feldbild des Kristalls, das nach dem Einstellen der Probe im richtigen Fokus aufgenommen wurde. Die nadelartige Morphologie des Kristalls ist deutlich zu erkennen. Abbildung 6b,c zeigt das Bild desselben Kristalls unter UV-Erregung mit vollsichtbarer (Abbildung 6b) oder lokal begrenzter (Abbildung 6c) Beleuchtung. Bei der breiten UV-Beleuchtung sind die Unterschiede der Emissionshelligkeit von den verschiedenen Flächen des Kristalls sofort sichtbar. Die eingeschränkte Beleuchtung kann als Option verwendet werden, vor allem um alle Auswirkungen von Energie oder Lichtübertragung im Kristall zu untersuchen, die wellenleiterartiges Verhalten auslösen können. In diesem Fall wird eine starke Emission an einem Punkt festgestellt, der nicht direkt unter Anregung steht. Dies deutet darauf hin, dass eine effiziente Energiemigration durch den Kristall13 erfolgt (5 und 6 in Abbildung 7).

Aus dem erworbenen Hyperspektralwürfel ist es ferner möglich, die Spektralverteilung in Form eines Bildes zu erhalten, das eine bestimmte Wellenlänge darstellt, das Intensitätsprofil einer bestimmten Emissionswellenlänge sowie die Emissionsspektren an jedem Pixel oder Bereich des erworbenen hyperspektralen Würfels. Als Beispiel zeigen die in Abbildung 7 (Panel 4) angegebenen Emissionsspektren die charakteristischsten Emissionsbänder des Eu 3+-Ions: Das bei 590 nm beobachtete Band wird dem magnetischen Dipol (MD) 5D0-7F1 Übergang von Eu3+zugeordnet, während die Emissionsspitzen im Bereich von 610 bis 630 nm aus dem überempfindlichen3+ erzwungenen elektrischen Dipol (ED) 5D0-7F2 Eu3+ Übergang stammen. Das Verhältnis zwischen der integrierten Intensität dieser beiden Übergänge ist bekanntlich eine ausgezeichnete Sonde der chemischen Umgebung um das Ln3+ Ion in der Struktur des Einzelkristalls21:Je niedriger die Symmetrie um das Ln3+ Ion, desto größer ist das ED/MD-Verhältnis. Dies ermöglicht rückschlüsse auf den Symmetriecharakter der chemischen Umgebung des Ln3+ Ion. Darüber hinaus kann die Starkspaltung des 5D0- 7F2-Übergangs auch mit der Symmetrie um den Ln3+ in seiner kristallographischen Umgebung korreliert werden – je niedriger die Symmetrie, desto höher ist die Anzahl der Stark-Unterebenen. Bei dem nadelartigen Polymorph, das im niedrigsymmetrischen triklinischen Kristallsystem kristallisiert ist, teilt sich der Übergang 5D0x7F2 in vier Unterspitzen auf (Spektren in Abbildung 7, Panel 4). Eine solche Analyse ist besonders ansprechend, wenn man die optischen Eigenschaften mehrerer Polymorphen eines Leuchtkristalls vergleicht. Wir haben zuvor gezeigt, dass die aus der optischen Analyse abgeleiteten Informationen über die chemische Umgebung gut mit der molekularen Kristallstruktur korrelierten, die durch die Einkristall-Röntgenanalyse13gewonnen wurde. Darüber hinaus kann das Spektralprofil entlang der verschiedenen In-Abbildung7 (Panel 3) dargestellten Kristallflächen, das eine hellere Emission an der Spitze und an den Seitenflächen anzeigt, auch mit dem Ln3+korreliert werden. Ln3+ Ionenabstände in den drei räumlichen Richtungen(Abbildung 1b):Die dichtere Ln3+-Verpackung entlang der Achsen senkrecht zur Spitze bzw. Seitenflächen begünstigt die Ionen-Ionen-Energieübertragung. Daher wird eine Emissionssteigerung an den jeweiligen Flächen, also der optischen Anisotropie, beobachtet.

Insgesamt stellen die verschiedenen Optionen der Datenanalyse, dargestellt in Abbildung 7 und Abbildung 8,die wichtigsten Merkmale der kombinierten spektroskopischen und räumlichen Informationen dar, die durch die HSI-Analyse von Lumineszenzproben untersucht werden können.

Figure 1
Abbildung 1: Molekulare Struktur und kristallographische Anordnung. (a) Struktur des heterodinuklearen Ln-basierten Komplexes [TbEu(bpm)(tfaa)6], wobei Ln1 und Ln2 Tb3+ und Eu3+ Ionen sind. Ungeordnete Gruppen und Wasserstoffatome werden aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen. Farbcode: Eu: dunkler Cyan; C: grau; O: rot; N: blau; F: lindgrün. (b) Darstellung der molekularen Verpackung im Kristall: (i) Ansicht von oben und (ii) Spitzenansicht der nadelartigen Einkristallstruktur mit ausgewählten intermolekularen und intramolekularen Ln-Abstände (tfaa-Untereinheiten und Wasserstoffatome werden aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen). iii) Kristallverpackungsanordnung der [TbEu(bmp)(tfaa)(tfaa)6] Dimer (Wasserstoffatome werden aus Gründen der Klarheit weggelassen). iv) Diagramm der Kristallwachstumsflächen des Dimers, das die kürzeste Ln-Entfernungen in den (0 1 0) und (2 -1 1) kristallographischen Richtungen. Die Zahl wurde von Bezug 13 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Übersicht über das Hyperspektral Imaging System. Gezeigt wird die Konfiguration, die für die Lumineszenzzuordnung im sichtbaren Spektralbereich mit UV-Erregung erforderlich ist. (a) Allgemeine Ansicht des Systems, wobei 1 die Mikroskopstufe ist, 2 der Abschnitt, der die optische Konfiguration enthält, und 3 ist das Spektrometer mit den sichtbaren und NIR-Detektoren. (b) Offene Ansicht des optischen Aufbaus in der Nähe der Mikroskopstufe (rechte Seite von a) mit der optischen Konfiguration für das Experiment: Optische Würfelposition 4 bleibt leer und der konfokale Mikroskopwürfel wird in Position 5 platziert, um das Licht durch den sichtbaren Pfad zu leiten, der sichtbare Würfel wird in Position 6 platziert, um das sichtbare Licht zum Erfassungspfad zu lenken, und der konfokale Lochwürfel wird in Position 7 platziert, um Licht zum sichtbaren Erfassungspfad zu leiten. (c) Offene Ansicht des optischen Aufbaus näher an den Detektoren (linke Seite von a), zeigt Position 8, wo der konfokale Spektrometerwürfel cube platziert wird, um Licht zum Spektrometer und der sichtbaren Kamera zu reflektieren. Das Einset 9 zeigt die Schraube, um die Öffnungsbreite des Spektrometerschlitzes einzustellen. (d) Ansicht der Mikroskopstufe, des Computers und der Breitbandlampe (zur UV-Anregung) Controller. Im Einset wird der Breitband-Lampenregler mit mehr Details angezeigt: 10 ist die Ein/Aus-Taste, 11 ist der Knopf, um die Intensität der Lampe zu steuern, und 12 ist der Auslöser. (e) Schema, das den sichtbaren/NIR-optischen Pfad von der Mikroskopstufe zu den Detektoren zeigt, einschließlich der optischen Würfelpositionen von 4 bis 8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Screenshot der PHySpec-Software, der das Menü mit den für das HSI einzustellenden Parametern anzeigt. 1 ermöglicht das Einfügen der Skalenleiste in das Farbkamerabild; 2 und 3 ermöglichen es, die Belichtungszeit und den Gain-Wert der Farbkamera zu steuern; die richtige Objektivlinse muss in 4ausgewählt werden; 5 ermöglicht die Auswahl der Öffnung des Lochs ; 6 (Diverter) und 7 (Filter) ermöglichen die Wahl des Detektors bzw. Gitters; die Belichtungszeit für den sichtbaren Detektor ist in 8eingestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Allgemeine Ansicht der Mikroskopstufe. (a) Platzierung des Glasschlittens mit der Probe auf der Bühne, wobei die UV-Beleuchtung EIN zeigt die rote Lumineszenz der Probe (kleiner roter Punkt in der Mitte des Glasschlittens). (b) Blick auf die Mikroskopstufe mit dem Weißlicht-Beleuchtungskondensator oben. (c) Stage Controller zeigt den Joystick, der die Bewegung der Bühne in die durch orange und gelbe Pfeile angezeigten Richtungen steuert (siehe Buchstabe a). (d) Detailansicht der Fokustaste, die die Bühne in die durch den roten Pfeil angezeigten Richtungen verschiebt (auch in (b) dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Die Komponenten der Mikroskopstufe. 1 Mikroskopstufe mit der Probe auf dem Glasschlitten auf der Probenstufe auf der Oberseite der Objektivlinsen; 2 Räder zur Einstellung des Fokus (großes Rad) und zur Ausrichtung der erfassten Emission (kleines Rad) entweder nur an den Detektor (L), teilweise an den Detektor und teilweise an die Kamera (R) oder nur an die Fernglaslinsen (Auge); 3 Anregungs-/Emissionsfilterrad zur Auswahl des Anregungswellenlängenbereichs. Das Detail auf der rechten Seite zeigt den Filterwürfel mit dem UV-Filter und dem Langpassfilter, der in diesem Experiment verwendet wird; 4 in der Oberen /unteren zeigen die Knöpfe, um den Anregungsstrahl durch die Probe zu bewegen, während zwischendurch die kreisförmige Feldöffnungssteuerung; 5 Objektive; 6 EIN/AUS-Taste der weißen Lichtbeleuchtung; 7 Knopf, um die Helligkeit der weißen Lichtlampe einzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Optische Mikroskopiebilder des analysierten Einzelkristalls. Diese Bilder wurden unter (einer) weißen Lichtbeleuchtung, (b) Vollansichts-UV-Beleuchtung, unter Verwendung der Anregungskreisöffnung vollständig offen, und (c) lokal beschränkte UV-Beleuchtung (durch den weißen Kreis markiert), mit einer näheren Anregungskreisöffnung erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Screenshot der PHySpec-Software, die den Hyperspektral-Würfeldatenanalyseprozess zeigt. Auf den erworbenen hyperspektralen Würfel können verschiedene Spektralanalysemethoden angewendet werden: 1 zeigt die Wellenlänge, die für die in 2dargestellte Spektralbildverteilung ausgewählt wurde; 3 zeigt die 613,26 nm horizontalen (7) und vertikalen (8) Intensitätsprofile; 4 zeigt die Emissionsspektren, die aus den Zielen 5 und 6 sowie aus dem in 9 hervorgehobenen Bereich extrahiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Alternative Anwendung von HSI, die die Synergie zwischen hochkonvertierenden Nanopartikeln und Lanthanidkomplexen untersucht. Dieses Beispiel zeigt die hyperspektrale Analyse eines Hybridsystems, das aus molekularen Kristallen besteht ([Tb2(bpm)(tfaa)6]) kombiniert mit hochkonvertierenden Nanopartikeln (NaGdF4:Tm3+,Yb3+). (a) Photomikroskope unter Weißer und UV-Lichtbeleuchtung zusammen mit dem Bereich von Interesse (ROI), der für die hyperspektrale Bildgebung unter 980 nm Lichtbestrahlung verwendet wird. (b) Die Emissionen von Tm3+ und indirekt tb3+ werden auf einer Fläche von 20 x 20 m2überwacht. (c) Die Veränderung der absoluten Intensität der Emissionsbänder schwankte im gesamten Hybridsystem, was auf eine gewisse Variabilität der Gesamtmenge des über die Oberfläche verteilten Materials hindeutet. (d) Die Konstanz des Verhältnisses zwischen der integrierten Emission des Komplexes vs. Tm3+: 1G4-3H6 (Quadrate) und Tm3+: 1G4-3F4 (Kreise) bestätigte das gleichzeitige Vorhandensein der beiden Moieties im gesamten Hybridsystem und die homogene Wechselwirkung zwischen ihnen. Die Maßstabsbalken sind in den Photomikroskopen 20 m und in ROIs und Spektralkarten 5 m. Photomikroskope werden in echten Farben präsentiert. Die Abbildung wurde von Punkt 11 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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Das hier beschriebene hyperspektrale Bildgebungsprotokoll bietet einen einfachen Ansatz, der es ermöglicht, spektroskopische Informationen an genauen Stellen der Probe zu erhalten. Mit dem beschriebenen Setup kann die räumliche Auflösung(x- und y-Mapping) bis zu 0,5 m erreichen, während die Spektralauflösung für die Zuordnung im sichtbaren Bereich 0,2 nm und für den NIR-Bereich 0,6 nm betragen kann.

Um eine hyperspektrale Kartierung auf einem einzelnen Kristall durchzuführen, folgt die Probenvorbereitung einem einfachen Verfahren: Der Kristall kann einfach auf einem Glasmikroskopie-Dia platziert werden, das bei Bedarf mit einem Deckglas bedeckt ist. Die Fokussierung der Probe mit den richtigen Objektiven und dem hellen Feldbild an der Farbkamera-Einrichtung in der Software ist ein sehr wichtiger Schritt während der Voranalysephase, um am besten aufgelöste hyperspektrale Bilder zu erhalten. In der Regel werden höhere Emissionsintensitäten erreicht, wenn die Probe gut fokussiert ist. Sobald dies geschehen ist, bestimmt die Auswahl der Parameter der Analyse, wie die anzahl x und y, und die Schrittgröße das Sichtfeld bzw. die räumliche Stichprobenauswahl des erhaltenen hyperspektralen Würfels. Die numerische Blende des Objektivs und die Anregungs-/Emissionswellenlängen bestimmen jedoch das reale Volumen der Probe, das an jedem Erfassungspunkt untersucht wird. Für das in dieser Studie verwendete Ziel mit einer numerischen Blende (NA) von 0,4 und der Anregung im UV-Spektralbereich (390 nm) hat der fokussierte Laserfleck beispielsweise eine Größe von etwa 0,6 x 0,6 m in x- und y-Richtung. Die Größe des Laserflecks wurde über die Website berechnet (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, abgerufen am 26. September 2019). Wenn die gewählte Schrittgröße größer als die räumliche Stichprobenauswahl ist, kann man tatsächlich eine Fläche abtasten, die kleiner ist als die durch die Schrittgröße angegebene. Wenn die Probe homogen ist, ist die Unterstichprobenabtastung möglicherweise kein Problem. Wenn jedoch räumliche Variationen in der Probe wichtig sind, um sie zu erkennen, wird eine optimale Probenahme erhalten, wobei eine Schrittgröße auf die Hälfte der Größe des Laserstrahls auf der Probe festgelegt ist. Die gewählte Belichtungszeit und die Intensität der UV-auswahlbeleuchteten Beleuchtung steuern die Intensität der erhaltenen Spektren. Diese Parameter variieren von Probe zu Probe, abhängig von der Emissionsintensität und der Empfindlichkeit gegenüber der UV-Erregung.

An dieser Stelle können die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls wie folgt aufgeführt werden: die Ausrichtung des optischen Systems, die korrekte Platzierung der optischen Würfel, die Regelung der kreisförmigen Blende der Anregungs- und Detektorschlitzöffnungen, die Wahl des Lochs, der Fokus der Probe in der Farbkamera mit den richtigen Objektiven, die Intensität der Breitbandlampe und die richtige Wahl des Langpassfilterwürfels (ermöglicht UV-Erregung) , sowie die Wahl der richtigen Schrittgröße und Belichtungszeit wie oben erwähnt. Schließlich müssen die Raumlichter während der gesamten Zeit der hyperspektralen Würfelerfassung ausgeschaltet sein.

Im Falle einer schlechten Signalerkennung entweder mit der Farbkamera oder dem Spektrometer sollte die Fehlerbehebung der Technik eine sorgfältige Überprüfung jedes der oben genannten kritischen Schritte umfassen, bevor die hyperspektrale Würfelerfassung gestartet wird. Wichtig ist auch die Konfiguration des Ausgangssignals im Mikroskopstadium. Die drei möglichen Konfigurationen sind: Auge (100 % des Ausgangssignals wird an die Mikroskop-Binokularhalterung gesendet), L (100 % des Ausgangssignals wird an die Detektoren gesendet) und R (80 % des Ausgangssignals wird an die Detektoren und 20 % an die Mikroskop-Binokularhalterung gesendet). Während der Hyperspektralcubeerfassung muss die R- oder L-Konfiguration verwendet werden. Wenn alle oben aufgeführten Parameter richtig ausgewählt sind, können räumliche und spektrale Informationen mit hoher Auflösung der Probe erhalten werden.

Einige mögliche Modifikationen der hier beschriebenen Technik lassen sich durch die hyperspektrale Bildgebung anderer Systeme, wie lumineszierende Mikropartikel14 oder optische Hybridsysteme aus molekularen Kristallen in Kombination mit upconvertierenden Nanopartikeln (Abbildung 8)11, verdeutlichn. In diesen Beispielen wurde die NIR-Laserdiode (980 nm) als Anregungsquelle verwendet, die die UV-Erregung ersetzte und gleichzeitig die erzeugte sichtbare Emission erfasste. Im letztgenannten Beispiel des Hybridsystems zeigte HSI die Homogenität von Hybridfilmen, die upconverting nanoparticles (NaGdF4:Tm3+, Yb3+) und [Tb2(bpm)(tfaa)6] Kristalle zu einem multiwellenwellig-responsiven isotropen System kombinieren, das einen Energietransfer zwischen Materialien und Molekülen aufweist (Abbildung 8)11. Darüber hinaus wird durch den Einsatz des InGaAs-Detektors des Systems die Detektion von Emissionen im NIR-Spektralbereich (1000 bis 1700 nm) möglich. Dies ist von besonderem Interesse bei der Suche nach der Untersuchung von NIR-basierten optischen Sonden für biomedizinische Anwendungen3. In diesem Fall muss die Konfiguration der optischen Würfel des Systems (Abbildung 2e) für den NIR-Pfad festgelegt werden. Bei der NIR-Erregungs-NIR-Emission wird eine der Hierbeschriebenen einer der Grenzen der hyperspektralen Technik deutlich: Als wellenlängenabhängig ist die Spektralauflösung im NIR-Bereich niedriger als bei der sichtbaren Detektion, d.h. etwa 0,6 nm(vs. 0,2 nm). Darüber hinaus wird bei Unter-1-m-Features, z.B. in kleineren Molekülkristallen, Nanopartikeln oder Hybridsystemen, die räumliche Auflösung, die durch die Systemkonfiguration diktiert wird (Ziele und Anregungs-/Emissionswellenlängen), zu einer weiteren potenziellen Einschränkung.

Schließlich kann die Datenmanipulation (unabhängig von der gewählten HSI-Konfiguration und dem Wellenlängenregime) entweder mit der Software des Instruments durchgeführt werden oder, wie für die Spektralprofile dargestellt, exportiert werden, um sie in anderen Softwarepaketen wie Origin® oder Microsoft Excel zu analysieren. In unserem Beispiel wurde die optische Anisotropie des Kristalls auch prompt am Farbkamerabild offenbart, nämlich durch die starke Intensitätsvariation entlang der verschiedenen Kristallflächen. Darüber hinaus werden unter der breiten UV-Erregung unterschiedliche Emissionsintensitäten ermittelt, je nachdem, welche Fläche analysiert wird (Abbildung 7). Die Möglichkeit, das Emissionsintensitätsprofil an verschiedenen Sehenswürdigkeiten am Kristall zu erhalten (Ziele in Abbildung 7), ermöglicht es ferner, Variationen der Emissionsintensität und, falls vorhanden, auch in spektraler Form zu untersuchen. Die blockartige Polymorphe der [TbEu(bpm)(tfaa)6] ist ein Beispiel dafür, dass zwei Kristallflächen für die dritte13gleich hohe Emissionsintensitäten und eine geringere Emissionsintensität aufwiesen. Im Falle eines Systems ohne Anisotropie wäre die Emissionsintensität für alle Kristallflächen gleich.

Ergänzende Methoden zur Untersuchung der optischen Anisotropie stehen beispielsweise im Zusammenhang mit dem Vorhandensein polarisierter Emissionen aus einer Probe. Dazu gehören Polarisationsgedächtnis oder spektroskopische Ellipsometrie. Die erste besteht in der Korrelation zwischen dem Polarisationszustand des vom Material emittierten Lichts mit dem Polarisationszustand des einfallenden Anregungslichts,22,23, während letztere die Veränderung des Polarisationszustands des Lichts misst, nachdem sie schräg durch einen dünnen Probenfilm24reflektiert wurde. Ein Vorteil der Verwendung von hyperspektraler Bildgebung als Werkzeug zur Untersuchung der optischen Anisotropie, wie hier gezeigt, ergibt sich jedoch aus der Tatsache, dass das Vorhandensein von Polarisation keine Voraussetzung für die Probenanalyse ist. Darüber hinaus erfordert die Probenvorbereitung nicht die Herstellung von dünnen Folien, weder eine sehr sorgfältige Ausrichtung des Kristalls in Bezug auf den einfallenden und gesammelten Licht. Diese Aspekte machen die Technik von HSI potenziell weiter anwendbar. Darüber hinaus werden die anisotropen Merkmale bei der Bildaufnahme zeitnah visualisiert, und die Datenanalyse ist einfach (wie oben dargestellt).

Unter Berücksichtigung eines breiteren Umfangs kann die Bedeutung der HSI-Technik auf ihre einzigartige Eigenschaft zurückgeführt werden, um das optische Signal mit umgebungsabhängigen Merkmalen zu corelatieren. Zum Beispiel ist eine solche Verbindung wesentlich, um das Verständnis von Nano-Bio-Wechselwirkungen zu verbessern3,15,16 im wachsenden Bereich der Nanomedizin oder sogar um Struktur-Eigenschaften-Beziehung in der Materialwissenschaft zu verstehen10,11,12,13. Als solche, zukünftige mögliche Anwendungen der hier beschriebenen Technik können wie folgt bezeichnet werden: Analyse biologischer Proben in vitro, ex vivo und in vivo, die die Kartierung von Molekülen von biologischem Interesse4,6, Anpassung der Mikroskopstufe zur Untersuchung umweltspezifischer optoelektronischer Eigenschaften(z. B. in elektrische Schaltkreise eingebettete Proben), optische Temperaturerfassung8,15 (durch Hinzufügen eines Temperaturreglers zum Mikroskopstadium) oder Gassensorierung (durch Ananpassung einer Gaskammer) durchführen. HSI wurde ferner als geeignet für Fluoreszenzanregungstechniken anstelle der Fluoreszenzemission25nachgewiesen. Ein gutes Beispiel für den Einsatz dieser speziellen hyperspektralen Technik Anpassung ist der Nachweis von Krebszellen in biologischen Geweben6. Folglich hat das hier beschriebene Protokoll das Potenzial, weitgehend auf die Untersuchung spektroskopischer Merkmale vieler verschiedener Arten von Leuchtstrukturen ausgedehnt zu werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten. Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Herrn Dylan Errulat und Prof. Muralee Murugesu vom Department of Chemistry and Biomolecular Sciences der University of Ottawa für die Bereitstellung von [TbEu(bpm)(tfaa)6] Einzelkristallen. E.M.R, N.R. und E.H. danken der finanziellen Unterstützung durch die University of Ottawa, die Canadian Foundation for Innovation (CFI) und den Natural Sciences and Engineering Research Council Canada (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope glass slides FisherBrand 12-550-15 Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager PhotonETC Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number

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Hyperspektrale Bildgebung als Werkzeug zur Untersuchung der optischen Anisotropie in Lanthanid-basierten molekularen Einzelkristallen
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Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).More

Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).

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