Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Гиперспектральная визуализация как инструмент для изучения оптической анисотропии в молекулярных однокристаллических кристаллах на основе лантанида

doi: 10.3791/60826 Published: April 14, 2020

Summary

Здесь мы представляем протокол для получения люминесцентных гиперспектральных данных изображения и анализа оптических анисотропных особенностей одиночных кристаллов на основе лантанида с помощью гиперспектральной системы визуализации.

Abstract

В этой работе мы описываем протокол для нового применения гиперспектральной визуализации (HSI) в анализе люминесцентного лантанида (Ln3)на основе молекулярных одиночных кристаллов. В качестве репрезентативного примера мы выбрали единый кристалл неортоненциального комплекса на основе Ln (TbEu (bpm)(tfaa)6( bpm-2,2'-bipyrimidine, tfaa- 1,1,1-трифтороацетететонат), демонстрирующий яркое видимое излучение под ультрафиолетовым возбуждением. HSI является новой техникой, которая сочетает в себе 2-мерную пространственную визуализацию люминесцентной структуры со спектральной информацией с каждого пикселя полученного изображения. В частности, HSI на одиночных кристаллах комплекса «Tb-Eu» предоставил местную спектральную информацию, раскрывающую вариацию интенсивности люминесценции в различных точках вдоль исследуемых кристаллов. Эти изменения были связаны с оптической анисотропией, присутствующей в кристалле, которая является результатом различной молекулярной упаковки ионов Ln3 в каждом из направлений кристаллической структуры. Описанный в настоящем материале HSI является примером пригодности такой техники для спектропространственных исследований молекулярных материалов. Тем не менее, что важно, этот протокол может быть легко расширен для других типов люминесцентных материалов (таких как микрон размера молекулярных кристаллов, неорганических микрочастиц, наночастиц в биологических тканях, или помеченных клеток, среди других), открывая много возможностей для более глубокого исследования структуры собственности отношений. В конечном счете, такие исследования обеспечат знания, которые будут использоваться для разработки передовых материалов для широкого спектра применений от биовизуализации до технологических приложений, таких как волноводы или оптоэлектронные устройства.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Гиперспектральная визуализация (HSI) является метод, который генерирует пространственную карту, где каждая координата x-y содержит спектральную информацию, которая может быть основана на любой спектроскопии, а именно фотолюминесценции, поглощения и рассеяния спектроскопии1,2,3. В результате получается трехмерный набор данных (также называемый «гиперспектральный куб»), где координаты x-y являются пространственными осями, а c-координаты — спектральной информацией из исследуемого образца. z Таким образом, гиперспектральный куб содержит как пространственную, так и спектральную информацию, обеспечивая более детальное спектроскопическое исследование образца, чем традиционная спектроскопия. В то время как HSI был известен в течение многих лет в области дистанционного зондирования (например, геология, пищевая промышленность4),он недавно стал инновационным методом для характеристики наноматериалов2,5 или зондов для биомедицинских приложений3,6,7,., 8. Вообще говоря, он не ограничивается УФ/видимым/ближним инфракрасным (NIR) доменом, но также может быть расширен с помощью других источников излучения, таких как рентгеновские лучи – например, для того, чтобы охарактеризовать элементарное распределение в различных материалах9 - или Terahertz излучения, где HSI был использован для выполнения теплового зондирования в биологических тканях8. Кроме того, фотолюминесценция отображение было объединено с Раман отображение для зондирования оптических свойств монослой MoS210. Тем не менее, среди зарегистрированных приложений оптических HSI, Есть еще только несколько примеров на HSI лантанид основе материалов11,12,13,14,15,16,17. Например, мы можем привести: обнаружение рака в тканях6,анализ глубины проникновения света в биологические ткани7,мультиплексная биологическая визуализация3,анализ многокомпонентной передачи энергии в гибридных системах11,и исследование агрегационных изменений в спектроскопических свойствах переконвертирующих наночастиц12. Очевидно, что привлекательность HSI обусловлена его пригодностью для получения знаний о специфической для окружающей среды люминесценции, обеспечивая одновременную пространственную и спектральную информацию о зонде.

Воспользовавшись этой мощной техникой мы здесь описать протокол для исследования оптической анисотропии неортопедической Tb3 "-Eu3" одного кристалла "TbEu (bpm) (tfaa)6) (Рисунок 1a)13. Оптическая анисотропная наблюдаемая результатом различных молекулярных упаковок ионов Ln3 в различных кристаллографических направлениях(рисунок 1b),в результате чего некоторые кристаллические грани показывают ярче, другие показывая тусклый фотолюминесценции. Было высказано предположение, что повышенная интенсивность люминесценции на конкретных гранях кристалла коррелирует с более эффективной передачей энергии по тем кристаллографическим направлениям, где Ln3 Ln3 "ионные расстояния были кратчайшими13.

Руководствуясь этими результатами, мы предлагаем создать детальную методологию для анализа оптической анизотропии через HSI, открывая путь для лучшего понимания процессов передачи ионно-ионной энергии и настраиваемых люминесцентных свойств, вытекающих из конкретного молекулярного расположения18,19. Эти структуры-свойства отношения были признаны в качестве важных аспектов для инновационного дизайна оптических материалов, включая, но не ограничивайся волнообразной системи и оптико-магнитных устройств хранения на нано и микромасштабе - удовлетворение спроса на более эффективные и миниатюрные оптические системы20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ВНИМАНИЕ: Рекомендуется использовать защитные очки, специфические для волновой длины возбуждения, используемые в любое время при эксплуатации изображения.

1. Конфигурация гиперспектрального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор гиперспектральной системы визуализации приведен на рисунке 2a, с основными компонентами изображения описывается. Система визуализации может быть использована для обнаружения видимого или ближнего инфракрасного (NIR) из образца. В зависимости от того, какое обнаружение желательно (видимый или NIR), свет проходит через два различных световых пути(рисунок 2e). Сочетание различных кубов поворота пучка и кубиков дихроического фильтра (оптические кубики) должны быть расположены в определенных положениях в инструменте, чтобы выбрать соответствующий путь.

  1. Питание на компьютере, который подключен к системе визуализации. Включите монитор компьютера.
  2. Установите соответствующую оптическую конфигурацию куба(рисунок 2b,c).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описана конфигурация изображения(оптическая конфигурация куба)для отображения HSI с использованием УФ-возбуждения и видимого обнаружения выбросов. Тем не менее, можно также изменить его для NIR возбуждения и видимого или обнаружения выбросов NIR, в зависимости от образца проанализированы. В качестве примера обратитесь к разделу «Результаты представительства».
    1. Начиная со стадии микроскопа (1 на рисунке 2a)и следуя пути луча излучения к детекторам (3 на рисунке 2a),оставьте первое положение для оптического куба (4 на рисунке 2b)вакантно и поместите конфопальный микроскоп оптический куб (DFM1-P01) в положении, указанном как 5 на рисунке 2b, так что эмиссия из образца направлена через видимый путь.
    2. Глядя вдоль оптической дорожки к детектору, поместите видимый оптический куб (CM1-P01), который содержит дихроическое зеркало и фильтры, чтобы направить видимое излучение к траекториям обнаружения, в положении, указанном как 6 на рисунке 2b.
    3. Продолжая путь к детектору, поместите конфокальный оптический куб (DFM1-P01) в положение, указанное как 7 на рисунке 2b, чтобы направить свет через видимый путь обнаружения света. Затем, следуя по пути, поместите конфокальный спектрометр оптического куба (DFM1-P01) в положение 8 на рисунке 2c, так что излучаемый свет достигает детектора.
    4. Для отображения HSI вручную управляйте отверстием щели детектора (9 на рисунке 2c),чтобы соответствовать размеру используемых пинхол (оптимально около 50 мм).
    5. В программном обеспечении PHySpec выберите отверстие пинхол (5 на рисунке 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем меньше диафрагма пинхол, тем лучше разрешение HSI, за счет интенсивности сигнала.
  3. Включите широкополосную лампу(рисунок 2d,вставка) путем позиционирования переключателя (10 на рисунке 2d)в положение ON. Чтобы контролировать интенсивность возбуждания света, поверните ручку, указанную 11(рисунок 2d) выше (32 - низкая интенсивность) или более низкие значения (1 - высокая интенсивность). Держите широкополосный затвор лампы (12 на рисунке 2d) закрыты во время настройки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие значения соответствуют более высокому ослаблению плотности мощности, испускаемых лампой, в то время как более низкие значения соответствуют более низкому ослаблению.
  4. Включите следующее оборудование в порядке, приведенном ниже, установив их переключатели в положение ON:
    1. Включите контроллер движения ThorLabs.
    2. Включите источник питания Nikon.
    3. Включите контроллер ASI.
    4. Включите контроллер Galvo.
    5. Включите детектор ProEm.
    6. Включите детектор Bayspec.
  5. На компьютере, открыть программное обеспечение PHySpec, дважды нажав на его значок.
    1. Нажмите клавишу F8 на клавиатуре, чтобы парафализации системы IMA Upconversion и нажмите кнопку OK на октяжусь в окне системы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.5.1. также может быть выполнена, нажав на вкладку системы, а затем нажав на Connect, чтобы прибыть в окно Connect to System. Затем кнопку OK можно нажать, чтобы подключить систему визуализации к программному обеспечению.
    2. Убедитесь, что все меню отображаются на интерфейсе(Цветная камера, ProEm и Bayspec), а также панель управления приборами, на левой стороне экрана, как показано на рисунке 3.

2. Гиперспектральная визуализация «TbEu(bpm)(tfaa)6- одинкристалл

  1. Для того, чтобы подготовить образец, поместите кристалл на микроскопию стеклянной горки. В случае, если необходимо использовать более высокое увеличение, накройте кристалл тонким стеклом крышки и закрепите его лентой, так что образец может быть помещен с тонкой крышкой стекла, обращенного к объективному объективу.
  2. Поместите стеклянную горку, на которой был подготовлен образец на стадии микроскопа, и закрепите его с помощью металлических рукояток(рисунок 4a,b).
  3. Переместите образец с помощью джойстика(Рисунок 4c) контроллера ASI, чтобы позиционировать образец над целями, накоторыезаемыми.
  4. Ручно расположить правый кубик фильтра в колесе под целями (3 на рисунке 5),чтобы выбрать УФ возбуждение лампы и пропустить видимое излучение к детектору.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные кубики фильтра доступны для использования либо зеленого или синего света возбуждение, таким образом, имея правильный куб фильтра на месте имеет важное значение для соответствующей длины волны возбуждения.
  5. Ручно положение 20X цели (указано на 5 на рисунке 5) под образцом и нажмите белую кнопку (6 на рисунке 5) на левой стороне микроскопа, чтобы включить белый свет.
    1. Отрегулируйте яркость, повернув ручку под кнопкой питания белого света (7 на рисунке 5).
  6. В программном обеспечении PHySpec нажмите кнопку Play (видео) на окне цветной камеры, что вызовет приобретение живого сканирования.
    1. Если окно цветной камеры показывает черное изображение, увеличьте время экспозиции (2 на рисунке 3)и/или значение усиления (3 на рисунке 3),найденное в панели управления прибором, под вкладкой Color Camera. Если просмотреное изображение слишком яркое, уменьшите время экспозиции и/или получите значение.
    2. Убедитесь, что передняя ручка на правой стороне микроскопа (2 на рисунке 5) установлена на R для того, чтобы отправить 20% сигнала на камеру / бинокль и 80% сигнала на детектор.
  7. Сосредоточьтесь на выборке, регулируя расстояние между целью и этапом(рисунок 4b). Это делается путем поворота ручки показано на рисунке 4d на правой стороне микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большая ручка используется для грубых регулировок, в то время как меньшая ручка предназначена для более деликатных и небольших изменений фокусировки.
  8. Убедитесь, что выбранная вручную цель также выбрана в программном обеспечении. Во-первых, нажмите на кнопку View в верхней панели меню, а затем нажмите один Показать / скрыть панель масштаба для отображения шкалы бар на изображении (1 на рисунке 3). Затем перейдите на вкладку Galvanometer в панели управления инструкцией и выберите цель, используемую (4 на рисунке 3). Убедитесь, что отображаемый бар масштаба является правильным, выбрав правильную цель в программном обеспечении.
  9. В программном обеспечении, выберите соответствующий детектор, перейдя на вкладку Diverter (ProEM - 6 на рисунке 3) и решетки, перейдя на вкладку Фильтр (1200 гр/мм в случае ProEM - 7 в Рисунок 3) под SpectraPro SP-2300 вкладке.
  10. Откройте затвор широкополосной лампы (12 на рисунке 2),чтобы уф-возбуждение образца состоится. Включите ручку интенсивности (11 на рисунке 2d)в нужное положение (например, 8 - промежуточная интенсивность), чтобы контролировать интенсивность широкополосной лампы (УФ) возбуждения.
    1. Чтобы выбрать между широким освещением поля (открытое отверстие) или меньшее пятно освещения (более закрытой диафрагмы), контролировать размер отверстия УФ-лампы поле с помощью палки и ручки показано в 4 на рисунке 5.
  11. Под вкладкой SpectraPro SP-2300 выберите длину волны для наблюдения за выбросом образца.
  12. Если длина эмиссионных волн образца неизвестна, приобрести спектр выбросов.
    1. В секвенсоре нажмите на знак «Кью», чтобы добавить новую последовательность («узло» для приобретения спектра выбросов.
      1. Нажмите на спектрометр, а затем Спектрум Приобретение (с спектральным сканированием).
      2. Ввуите минимальную длину волны (т.е. 400 нм) и максимальную длину волны (т.е. 700 нм) и нажмите OK, чтобы установить спектральный диапазон, в котором спектр будет записан.
      3. Выберите адекватное время экспозиции в левом боковом меню программного обеспечения. Выберите более короткое время (например, 0,1 с) для очень ярких образцов и более длительное время (например, 2 с) для тусклых излучателей.
      4. Отрегулируйте силу возбуждения в случае возбуждения широкополосной лампы (УФ) (см. шаг 1.3 выше).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В случае возбуждения диода NIR, его можно отрегулировать из меню нейтральной плотности выпадения вниз на левой стороне процирования PHySpec.
    2. На секвенсоре нажмите на кнопку двойной воспроизведения, чтобы запустить всю последовательность. После того, как спектр показан, обратите внимание на регионы, представляющие интерес для обнаружения выборочной эмиссии(например, от 580 до 640 нм в случае Тб3 "- и Eu3 "наоснове образцов).
    3. По мере необходимости оптимизировать обнаружение сигнала, либо изменив фокус образца, либо отрегулируя время экспозиции в программном обеспечении PHySpec. Добиться дальнейшей оптимизации обнаружения сигнала за счет увеличения интенсивности выбросов образца путем изменения мощности источника возбуждения (широкополосной лампы), как описано выше.
  13. Отрегулируйте время экспозиции (например, 0,5 с - 2 на рисунке 3) и получить (3 на рисунке 3) цветной камеры соответственно, чтобы получить хорошее качество изображения. При необходимости добавьте панель масштаба к изображению, нажав на кнопку Show/hide scale bar во втором ряду меню в верхней части окна программного обеспечения PHySpec.
  14. Рекомендация: Перед приобретением гиперспектрального куба, запись яркого поля оптической микроскопии изображения кристалла под белым светом(рисунок 6a) и / или УФ полный(Рисунок 6b) или ограничено(Рисунок 6c) освещение (УФ-освещение контролируется отверстие затвора, показано как 4 на рисунке 5). Для этого, с образцом в фокусе, нажмите на кнопку воспроизведения цветной камеры.
  15. Нажмите на файл, а затем экспорт окно Просмотр, выбрать желаемый формат для экспорта полученного изображения, и сохранить файл с желаемым расширением (.h5, . JPEG).
  16. Перед приобретением гиперспектрального изображения выключите освещение белого света, а также свет в помещении.
  17. Чтобы получить гиперспектральный куб, напишите новую последовательность. Таким образом, в секвенсоре нажмите на знак «Кью», чтобы добавить новый узл.
    1. Нажмите на Confocal Imager.
      1. Нажмите на Multi-Спектр Приобретение. Здесь желаемое поле зрения определяется количеством точек, которые необходимо получить в направлениях x и y, и размером шага. Например, используйте 100 точек в x и 100 точек в y с размером шага 5 мкм, чтобы получить изображение 500 на 500 мкм.
        Примечание: Общее количество точек приобретения и время интеграции в каждой точке напрямую повлияют на общее время приобретения гиперспектрального куба.
        1. Ввод желаемой позиции X (например, 100) и Y Позиции (например, 100) рассчитывает, а также желаемый размер шага (например, 5 мкм). Выберите опцию аппаратного обеспечения для синхронизации камеры для видимого отображения выбросов (и опции программного обеспечения в случае обнаружения NIR). Нажмите OK.
  18. В секвенсоре нажмите на недавно добавленную линию приобретения Multi-Spectrum, чтобы выделить узла.
  19. Нажмите Play кнопку Воспроизведения, чтобы запустить выбранный узла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшееся время, которое займет приобретение, будет отображаться рядом с узлом (в течение нескольких минут, например, 28 мин).
  20. Как только приобретение завершено, сохраните гиперспектральный куб в соответствующем формате файла (.h5).

3. Гиперспектральный анализ данных

  1. Сразу после приобретения, если сохраненный гиперспектральный куб не открывается автоматически в программном обеспечении, восстановить гиперспектральный куб, который был сохранен как файл .h5, нажав на файл в верхней панели меню, а затем зависания курсора и нажмите на Open File.... Когда окно под названием Выберите данные (s), чтобы открыть всплывает, выберите папку, где .h5 файл сохраняется и дважды щелкните на файле, чтобы открыть его, чтобы открыть его, выберите папку, где сохранен файл .h5 и дважды нажмите на файл, который откроется.
  2. После импорта гиперспектрального файла куба измените отображаемый гиперспектральный куб, чтобы показать интенсивность определенной спектральной длины волны, переместив бар в верхней части изображения куба влево (нижняя длина волны, например, 580 нм) или вправо (более высокая длина волны, например, 638 нм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранная длина волны отображается в левой части этой верхней панели (1 на рисунке 7).
  3. После выбора длины волны интереса для анализа(например,максимальная интенсивность, которая в случае «TbEu (bpm)(tfaa)6) 6) 613.26 нм), сделайте один (или все) из трех возможных типов спектрального анализа: (A) спектральное распределение в виде изображения (2 на рисунке 7); (B) профиль интенсивности выбросов в интересуемом регионе (3 на рисунке 7); (C) извлечение спектра в определенной точке или области интереса (4 на рисунке 7).
    1. В случае спектрального распределения от изображения используйте функцию Crop и Bin для увеличения соотношения сигнала к шуму на изображении. Для этого нажмите в верхней обработке меню затем выберите данные, а затем вариант Урожай и бин.
    2. Для профиля интенсивности выбросов, на изображении куба, правой кнопкой мыши и выберите Создать цель или создать профиль X или создать профиль Y в зависимости от того, если только одна точка (цель - 5 и 6 на рисунке 7)или строки (профиль - 7 и 8 на рисунке 7) должна быть проанализирована. Выберите область анализа, перетащив цель, горизонтальный или вертикальный профиль линии с курсором и переместите его через куб.
      1. После правильного выбора профиля нажмите на регион и выберите цель добавления в график. Выбирайте возможность создания нового графика для отображения интенсивности выбросов(y axis) в качестве функции физического положения цели(x оси). Спектр появится на новом графике, который был вставлен (6 и 7 на рисунке 7).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько целей могут быть созданы, и они будут отображаться как различные цветные профили выбросов (5 и 6 на рисунке 7).
    3. Кроме того, получить спектр выбросов конкретной области выборки (9 на рисунке 7). Для начала нависните курсор над изображением куба и правым щелчком мыши. Нажмите на Rectangle Selection или варианты выбора Ellipse на вкладке, которая всплывает.
      1. Нарисуйте форму выбора (например, прямоугольник) над желаемой областью, нажав и перетащив курсор по кубу. После правильного выбора области нажмите на регион и выберите выбор добавить в график.
      2. В появившомся окне Добавить в график,выберите Создать новый график для отображения спектров выбросов цели и нажмите OK.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Новая цветная линия (8 на рисунке 7) появится на графике, на котором показано целевое излучение, с интенсивностью выбросов, как оси y и длина волны на оси x. Этот спектр соответствует средней интенсивности выбранной области для каждой длины волны.
  4. Как только спектр получен, сохраните его перед выбором нового региона, потому что только один регион может быть выбран одновременно. Для этого выберите окно, в котором содержится график. В меню файла выберите Сохранить как и выбрать для сохранения графика в папке выбора, используя имя выбора, либо в формате .h5, который может быть открыт в программном обеспечении PHySpec, или в формате .csv, который может быть импортирован в Excel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Чтобы проиллюстрировать конфигурацию гиперспектрального микроскопа для получения данных на Ln-основе, молекулярный один кристалл (т.е., «TbEu(bpm)(tfaa)6, Рисунок 1a), Рисунок 2 показывает обзор системы, а также правильное размещение оптических кубов в установке. На рисунке 3 показан скриншот программного обеспечения PHySpec, содержащего меню, используемые во время приобретения HSI. Рисунок 4 и рисунок 5 более подробно показывают стадию микроскопа, включая размещение стеклянного слайда, содержащего образец для анализа. Выбранное ультрафиолетовое освещение было включено, чтобы показать видимое красное свечение кристалла(рисунок 4a и 1 на рисунке 5). На рисунке 6а показано яркое полевое изображение кристалла, записанное после регулировки образца в нужном фокусе. Хорошо видно игольчатую морфологию кристалла. Рисунок 6b,c показывает изображение того же кристалла под ультрафиолетовым возбуждением либо с полным видом(рисунок 6b)или локально ограничено(рисунок 6c) освещение. Под широким ультрафиолетовым освещением сразу видны различия яркости выбросов от различных граней кристалла. Ограниченное освещение может быть использовано в качестве опции, главным образом для исследования любых эффектов энергии или передачи света в кристалле, которые могут вызвать волнообразное поведение. В этом случае сильное излучение обнаруживается в точке, не непосредственно под возбуждением. Это говорит о том, что эффективная энергетическая миграция происходит через кристалл13 (5 и 6 на рисунке 7).

Из приобретенного гиперспектрального куба можно получить спектральное распределение в виде изображения, представляющего определенную длину волны, профиль интенсивности конкретной длины волны эмиссии, а также спектры выбросов в любом пикселе или области приобретенного гиперспектрального куба. В качестве примера, спектры выбросов, приведенные в Рисунке 7 (панель 4) показывают наиболее характерные диапазоны выбросов Eu 3"ион: полоса наблюдается на 590 нм присваивается магнитный диполь (MD)7 50D07F1 переход2 Eu3+ 3 " 5 Соотношение между интегрированной интенсивностью этих двух переходов хорошо известно, что отличный зонд химической среды вокруг Ln3 "ион в структуре одного кристалла21: чем ниже симметрия вокруг Ln3 "ион, тем больше соотношение ED / MD. Это позволяет сделать выводы о симметрии характера химической среды иона Ln3 ". Кроме того, расщепление Старка переходом 5D0и7F2 также может быть коррелировано с симметрией вокруг Ln3 в его кристаллографической среде – чем ниже симметрия, тем выше количество подуровней Старка. В случае иглы, как полиморф кристаллизуется в низкой симметричной трехклинической кристаллической системы, 5D0и7F2 переход делится на четыре субпиков (спектра показано на рисунке 7, панель 4). Такой анализ особенно привлекателен при сравнении оптических свойств нескольких полиморфов люминесцентного кристалла. Ранее мы продемонстрировали, что информация о химической среде, выведенная из оптического анализа, хорошо коррелирует с молекулярно-кристаллической структурой, полученной в ходе одного кристаллического рентгеновского анализа13. Кроме того, спектральный профиль вдоль различных кристаллических граней, показанных на рисунке 7 (панель 3), указывающий на более яркие выбросы на кончике и боковых гранях, также может быть коррелирован с Ln3 Ln3 "ионные расстояния в трех пространственных направлениях (Рисунок 1b): плотнее Ln 3"упаковки вдоль осей перпендикулярно кончик и боковые грани, соответственно, пользу ионно-ионной передачи энергии. Таким образом, повышение выбросов наблюдается на соответствующих лицах, таким образом, оптическая анисотропия.

В целом, различные варианты анализа данных, показанные на рисунке 7 и рисунке 8,представляют собой наиболее важные особенности комбинированной спектроскопической и пространственной информации, которую можно изучить с помощью анализа люминесцентных образцов.

Figure 1
Рисунок 1: Молекулярная структура и кристаллографическая композиция. () Структура неортодоксального комплекса на основе Ln «TbEu (bpm)(tfaa)6,где Ln1 и Ln2 являются Тб и ионами Eu3. Неупорядоченные группы и атомы водорода опущены для ясности. Цветовой код: Eu: темный циан; C: серый; O: красный; N: синий; F: зеленый лайм. bb) Представление молекулярной упаковки в кристалле: (i) вид верхнего верха и (ii) вид наконечника иглы- однокристаллической структуры с выбранными межмолекулярными и внутримолекулярными Ln Ln расстояния (tfaa субъединиц и атомов водорода опущены для ясности). iii) Расположение кристаллической упаковки «TbEu(bmp)(tfaa)6и dimers (атомы водорода опущены для ясности). (iv) Диаграмма кристаллических граней роста димера, показывающих кратчайший Ln Ln расстояния в (0 1 0) и (2 -1 1) кристаллографических направлениях. Цифра была изменена из ссылки 13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Обзор гиперспектральной системы визуализации. Показана конфигурация, необходимая для картирования люминесценции в видимом спектральном регионе с использованием УФ-возбуждения. ()Общий вид системы, где 1 является микроскопом этапе, 2 является раздел, содержащий оптическую конфигурацию, и 3 спектрометр с видимыми и NIR детекторов. (b) Открытый вид оптической настройки близко к стадии микроскопа (правая сторона a), показывающая оптическую конфигурацию для эксперимента: оптическое положение куба 4 остается пустым, а куб конфокального микроскопа помещается в положение 5 для того, чтобы направить свет через видимый путь, видимый куб помещается в положение 6 для того, чтобы направить видимый свет на путь обнаружения, и конфокальный pinhole находится в положении 7 видимого пути. (c)Открытый вид оптической установки ближе к детекторам (левая сторона), показывая положение 8, где конфокальный куб спектрометра cube помещается для отражения света к спектрометру и видимой камере. В врезка 9 показывает винт для регулировки ширины открывания разреза спектрометра. (d)Вид стадии микроскопа, компьютера и широкополосной лампы (используется для УФ возбуждения) контроллер. В входе контроллер широкополосной лампы отображается с более подробной информацией: 10 — кнопка выключения/выключения, 11 — ручка для управления интенсивностью лампы, а 12 — кнопка затвора. (e)Схема, показывающая видимый/NIR оптический путь от стадии микроскопа к детекторам, включая оптические положения куба от 4 до 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Скриншот программного обеспечения PHySpec, показывающий меню с параметрами, которые должны быть скорректированы для HSI. 1 позволяет вставить панель масштаба в изображение цветной камеры; 2 и 3 позволяют контролировать время экспозиции и приобретать ценность цветной камеры соответственно; правильный объективный объектив должен быть выбран в 4; 5 позволяет подбирать отверстие пинхол; 6 (Diverter) и 7 (фильтр) позволяют выбрать детектор и решетку соответственно; время экспозиции видимого детектора установлено в 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Общий вид стадии микроскопа. (a) Размещение стеклянной горки, содержащей образец на этапе, с ультрафиолетовым освещением ON, показывающим красную люминесценцию образца (маленькая красная точка в центре стеклянной горки). (b)Вид на сцену микроскопа с конденсатором белого освещения сверху. (c)Контроллер сцены, показывающий джойстик, который контролирует движение сцены в направлениях, обозначенных оранжевыми и желтыми стрелками (также показаны в (a). (d)Детальное представление кнопки фокусировки, которая перемещает сцену в направлениях, обозначенных красной стрелкой (также показана в (b)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Компоненты стадии микроскопа. 1 этап микроскопа с образцом на стеклянной горке, размещенной на этапе образца в верхней части объективных линз; 2 колеса для регулировки фокуса (большое колесо) и направления захваченного излучения (малого колеса) либо только на детектор (L), частично на детектор и частично на камеру (R), или исключительно на бинокличные линзы (глаз); 3 возбуждания / выбросов фильтры колесо, используемое для выбора диапазона длины волн возбуждения. Деталь справа показывает куб ифильтр, держащий УФ-фильтр, и фильтр с длинным проходом, используемый в этом эксперименте; 4 в верхней / нижней показывают ручки для перемещения возбуждания пучка через образец, в то время как между ними, круговой контроль диафрагмы поля; 5 объективных линз; 6 кнопка ON/OFF белого светового освещения; 7 ручка для регулировки яркости белой лампы света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Оптическая микроскопия изображений проанализированных одного кристалла. Эти изображения были получены под(a)белое освещение света, (b)полное представление УФ-освещение, используя возбуждение круговой диафрагмы полностью открытым, и (с) локально ограничивается УФ-освещение (отмеченный белым кругом), используя более тесное возбуждение круговой диафрагмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Скриншот программного обеспечения PHySpec, показывающий процесс анализа данных гиперспектрального куба. Разнообразные методы спектрального анализа могут быть применены на приобретенном гиперспектральном кубе: 1 показывает длину волны, которая была выбрана для спектрального распределения изображений, показанного в 2; 3 показывает 613.26 нм горизонтальные (7) и вертикальные (8) профили интенсивности; 4 показывает спектры выбросов, извлеченные из целей 5 и 6, а также из области, выделенной в 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Альтернативное применение HSI зондирования синергии между upconverting наночастиц и лантанидных комплексов. Этот пример показывает гиперспектральный анализ гибридной системы, состоящей из молекулярных кристаллов (Tb2(bpm)(tfaa)6) в сочетании с переоборудованием наночастиц (NaGdF4:Tm3 ',Yb3 ). ()Фотомикрографы под белым и ультрафиолетовым светом освещения наряду с областью интереса (ROI) используется для гиперспектральной визуализации под 980 нм свет облучения. (b)ТМ3 "и косвенные Выбросы Тб3" контролируется на площади 20 х 20 мкм2. (c)Изменение абсолютной интенсивности полос выбросов колебалось по всей гибридной системе, что указывает на некоторую изменчивость общего количества материала, распределенного по поверхности. (d) Постоянство соотношения между интегрированным выбросом комплекса против ТМ3 ": 1G4-3H6 (квадраты) и ТМ3 ": 1G43F4 (круги) подтвердило одновременное присутствие двух moieties по всей гибридной системе и однородное взаимодействие между ними. Шкала баров 20 мкм в фотомикрографах и 5 мкм в ROIs и спектральных карт. Фотомикрографы представлены в реальных цветах. Рисунок был изменен из ссылки 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Описанный здесь протокол гиперспектральной визуализации обеспечивает простой подход, позволяющий получать спектроскопическую информацию в точных местах выборки. Используя описанную установку, пространственное разрешение(x и y отображение) может достигать 0,5 мкм, в то время как спектральное разрешение может быть 0,2 нм для отображения на видимом диапазоне и 0,6 нм для диапазона NIR.

Для проведения гиперспектрального отображения на одном кристалле, подготовка образца следует легкой процедуре: кристалл можно просто поместить на стеклянную микроскопическую горку, покрытую крышкой стекла по мере необходимости. Сосредоточение образца с использованием надлежащих объективных линз и яркое поле изображения на цветовой камеры настройки в программном обеспечении является очень важным шагом на этапе предварительного анализа для получения лучше гоуместная проблемагиперспектральных изображений. Как правило, более высокая интенсивность выбросов повышается, когда выборка хорошо сфокусирована. Как только это будет сделано, выбор параметров анализа, таких как x и y рассчитывает и размер шага будет диктовать поле зрения и пространственной выборки, соответственно, полученного гиперспектрального куба. Тем не менее, численное отверстие цели и возбуждание/длина волн выбросов диктуют реальный объем образца, который исследуется в каждой точке приобретения. Например, для цели, используемой в данном исследовании, с численной диафрагмой (NA) 0,4, и с использованием возбуждения в УФ-спектральном диапазоне (390 нм), сфокусированное лазерное пятно имеет размер примерно 0,6 х 0,6 мкм в направлении x и y. Размер лазерного пятна был рассчитан с помощью веб-сайта (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, доступ к нему 26 сентября 2019 года). Если выбранный размер шага больше, чем пространственная выборка, на самом деле можно выборки области меньше, чем тот, который дается размер шага. Если выборка однородна, недовыборка не может быть проблемой. Тем не менее, если пространственные изменения в выборке имеют важное значение для обнаружения, оптимальная выборка получена с размером шага, установленным в два раза меньше лазерного луча на образце. Выбранное время экспозиции и интенсивность ВЫБРАНного УФ-освещения будут контролировать интенсивность полученных спектров. Такие параметры варьируются от выборки к выборке, в зависимости от интенсивности выбросов и чувствительности к уф-возбуждению.

На данный момент, критические шаги в протоколе могут быть перечислены как: выравнивание оптической системы, правильное размещение оптических кубов, регулирование круговой диафрагмы возбуждения и детектор прорези отверстия, выбор пинхол, фокус образца в цветовой камере с использованием надлежащего объективных линз, интенсивность широкополосной лампы и правильный выбор длинного прохода фильтра (позволяет УФ-эксцитации) , а также выбор надлежащего размера шага и время экспозиции, как упоминалось выше. Наконец, освещение комнаты должно быть выключено в течение всего времени гиперспектрального приобретения куба.

В случае плохого обнаружения сигнала либо с цветной камерой или спектрометр, устранение неполадок техники должны включать тщательное рассмотрение каждого из критических шагов, приведенных выше, перед началом гиперспектрального приобретения куба. Также важна конфигурация выходного сигнала на стадии микроскопа. Три возможные конфигурации: глаз (100% выходного сигнала направляется на бинокулярное крепление микроскопа), L (100% выходного сигнала отправляется на детекторы) и R (80% выходного сигнала направляется детекторам и 20% - в бинокулярное крепление микроскопа). Во время гиперспектрального приобретения куба необходимо использовать конфигурацию R или L. Если все вышеперечисленные параметры выбраны правильно, можно получить пространственную и спектральную информацию образца с высоким разрешением.

Некоторые возможные изменения описанной в настоящей истории методики могут быть иллюстрированы гиперспектральной визуализацией других систем, таких как люминесцентные микрочастицы14 или оптические гибридные системы, состоящие из молекулярных кристаллов в сочетании с переконвертируемыми наночастицами (Рисунок 8)11. В этих примерах лазерный диод NIR (980 нм) использовался в качестве источника возбуждения, заменяя ультрафиолетовое возбуждение при обнаружении генерируемого видимого выброса. В последнем примере гибридной системы, HSI показал однородность гибридных пленок, которые сочетают в себе upconverting наночастиц (NaGdF4:Tm3 ",Yb3 "и "Tb2(bpm) (tfaa)6кристаллов в многоволновой реакции изотропной системы, демонстрируя передачу энергии между материалами и молекулами (Рисунок 8)11. Кроме того, с помощью детектора InGaAs системы становится возможным обнаружение выбросов в спектральном регионе NIR (от 1000 до 1700 нм). Это представляет особый интерес при поиске исследования NIR основе оптических зондов для биомедицинских приложений3. В этом случае конфигурация оптических кубов системы(рисунок 2e)должна быть установлена для траектории NIR. В случае выброса NIR excitation-NIR одно из ограничений описанного здесь гиперспектрального метода становится очевидным: как зависимое от длины волны, спектральное разрешение в регионе NIR ниже, чем для видимого обнаружения, т.е. примерно 0,6 нм(против 0,2 нм). Кроме того, для объектов суб-1 мкм, например, меньших молекулярных кристаллов, наночастиц или гибридных систем, пространственное разрешение, которое диктуется конфигурацией системы (используемые цели и эксгитация/длина волн выбросов), становится еще одним потенциальным ограничением.

Наконец, (независимо от выбранной конфигурации HSI и режима длины волны) манипуляции данными могут быть осуществлены либо с помощью программного обеспечения инструмента, либо, как показано в случае спектральных профилей, могут быть экспортированы для анализа в других пакетах программного обеспечения, таких как Origin® или Microsoft Excel. В нашем примере оптическая анизотропия кристалла также была быстро выявлена на цветном изображении камеры, а именно сильным изменением интенсивности вдоль различных кристаллических граней. Кроме того, при широком уфимцах получаются различные интенсивности выбросов в зависимости от того, какое лицо анализируется(рисунок 7). Возможность получения профиля интенсивности выбросов в различных точках интереса на кристалле (цели на рисунке 7)далее позволяет изучить изменение интенсивности выбросов и, если присутствует, также в спектральной форме. Блок-подобный полиморф «TbEu(bpm)(tfaa)является примером, когда две кристаллические лица продемонстрировали одинаково высокую интенсивность выбросов и более низкую интенсивность выбросов для третьего13. Потратив на это, в случае системы без какой-либо анизотропии, интенсивность выбросов будет одинаковой для всех кристаллических граней.

Дополнительные методы зондирования оптической анизотропии, например, связаны с наличием поляризованного выброса из образца. К ним относятся поляризация памяти или спектроскопической эллипсометрии. Первый состоит в корреляции между состоянием поляризации света, излучаемого материалом с состоянием поляризации света возбуждения инцидента,22,,23 в то время как последний измеряет изменение в состоянии поляризации света после отражения косо тонкой пленки образца24. Однако преимущество использования гиперспектральной визуализации в качестве инструмента для зондирования оптической анизотропии, как показано здесь, связано с тем, что наличие поляризации не является обязательным условием для анализа образцов. Кроме того, подготовка образца не требует изготовления тонких пленок, ни очень тщательной ориентации кристалла по отношению к инциденту и собранного света. Эти аспекты делают метод HSI потенциально более широко применимым. Кроме того, анизотропные особенности быстро визуализироваться при приобретении изображения, и анализ данных прост (как это можно просмотреть выше).

Учитывая более широкий охват, значение метода HSI можно объяснить его уникальной характеристикой для corelate оптический сигнал с окружающе-зависимыми характеристиками. Например, такое соединение имеет важное значение для улучшения понимания нано-био взаимодействий3,,15,16 в растущей области наномедицины или даже понять структурно-свойства отношения в материаловедении10,11,12,13. Таким образом, будущие потенциальные применения описанной в этом методике можно назвать следующими, но не ограничивается: анализ биологических образцов in vitro, ex vivo и in vivo, выполняющих картирование молекул биологического интереса4,,6,адаптация стадии микроскопа для изучения экологически специфических оптоэлектронных свойств(например, образцов, встроенных в электрические схемы), оптическое зондирование температуры8,,15 (путем добавления контроллера температуры к стадии микроскопа) или газового зондирования (адаптация газовой камеры). HSI также было продемонстрировано как подходящий для методов флуоресценции возбуждения вместо флуоресценции выбросов25. Хорошим примером использования данной гиперспектральной техники адаптации является обнаружение раковых клеток в биологических тканях6. Следовательно, описанный здесь протокол может быть в значительной степени распространен на изучение спектроскопических особенностей многих различных типов люминесцентных структур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать. Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят г-на Дилана Эррулата и профессора Мурали Муругесу (Muralee Murugesu) из кафедры химии и биомолекулярных наук Университета Оттавы за предоставление «TEu(bpm)(tfaa)6» одиночных кристаллов. E.M.R., N.R. и E.H. с благодарностью признают финансовую поддержку, оказываемую Университетом Оттавы, Канадским фондом инноваций (CFI) и Канадским советом естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope glass slides FisherBrand 12-550-15 Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager PhotonETC Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ElMasry, G., Sun, D. W. Principles of Hyperspectral Imaging Technology. Hyperspectral Imaging for Food Quality Analysis and Control. 3-43 (2010).
  2. Dong, X., Jakobi, M., Wang, S., Köhler, M. H., Zhang, X., Koch, A. W. A review of hyperspectral imaging for nanoscale materials research. Applied Spectroscopy Reviews. 54, (4), 285-305 (2019).
  3. Yakovliev, A., et al. Hyperspectral Multiplexed Biological Imaging of Nanoprobes Emitting in the Short-Wave Infrared Region. Nanoscale Research Letters. 14, (243), 1-11 (2019).
  4. Cheng, W., Sun, D. W., Pu, H., Wei, Q. Heterospectral two-dimensional correlation analysis with near-infrared hyperspectral imaging for monitoring oxidative damage of pork myofibrils during frozen storage. Food Chemistry. 248, 119-127 (2018).
  5. Liu, Y., Liu, L., He, Y., Zhu, L., Ma, H. Decoding of quantum dots encoded microbeads using a hyperspectral fluorescence imaging method. Analytical Chemistry. 87, (10), 5286-5293 (2015).
  6. Leavesley, S. J., et al. Colorectal cancer detection by hyperspectral imaging using fluorescence excitation scanning. Optical Biopsy XVI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. 10489, (2018).
  7. Zhang, H., Salo, D., Kim, D. M., Komarov, S., Tai, Y. -C., Berezin, M. Y. Penetration depth of photons in biological tissues from hyperspectral imaging in shortwave infrared in transmission and reflection geometries. Journal of Biomedical Optics. 21, (12), 126006 (2016).
  8. Naccache, R., et al. Terahertz Thermometry: Combining Hyperspectral Imaging and Temperature Mapping at Terahertz Frequencies. Laser and Photonics Reviews. 11, (5), 1-9 (2017).
  9. Jacques, S. D. M., Egan, C. K., Wilson, M. D., Veale, M. C., Seller, P., Cernik, R. J. A laboratory system for element specific hyperspectral X-ray imaging. Analyst. 138, (3), 755-759 (2013).
  10. Birmingham, B., et al. Probing the Effect of Chemical Dopant Phase on Photoluminescence of Monolayer MoS2 Using in Situ Raman Microspectroscopy. Journal of Physical Chemistry C. 123, (25), 15738-15743 (2019).
  11. Marin, R., et al. Harnessing the Synergy between Upconverting Nanoparticles and Lanthanide Complexes in a Multiwavelength-Responsive Hybrid System. ACS Photonics. 6, (2), 436-445 (2019).
  12. Gonell, F., et al. Aggregation-induced heterogeneities in the emission of upconverting nanoparticles at the submicron scale unfolded by hyperspectral microscopy. Nanoscale Advances. 1, 2537-2545 (2019).
  13. Errulat, D., Gabidullin, B., Murugesu, M., Hemmer, E. Probing Optical Anisotropy and Polymorph-Dependent Photoluminescence in [Ln2] Complexes by Hyperspectral Imaging on Single Crystals. Chemistry - A European Journal. 24, (40), 10146-10155 (2018).
  14. Panov, N., Marin, R., Hemmer, E. Microwave-Assisted Solvothermal Synthesis of Upconverting and Downshifting Rare-Earth-Doped LiYF4 Microparticles. Inorganic Chemistry. 57, (23), 14920-14929 (2018).
  15. Debasu, M. L., Brites, C. D. S., Balabhadra, S., Oliveira, H., Rocha, J., Carlos, L. D. Nanoplatforms for Plasmon-Induced Heating and Thermometry. ChemNanoMat. 2, (6), 520-527 (2016).
  16. Nadort, A., et al. Quantitative Imaging of Single Upconversion Nanoparticles in Biological Tissue. PLoS ONE. 8, (5), 1-13 (2013).
  17. Sava Gallis, D. F., et al. Tunable Metal-Organic Framework Materials Platform for Bioimaging Applications. ACS Applied Materials and Interfaces. 9, (27), 22268-22277 (2017).
  18. Varghese, S., Das, S. Role of molecular packing in determining solid-state optical properties of π-conjugated materials. Journal of Physical Chemistry Letters. 2, (8), 863-873 (2011).
  19. Yan, D., Evans, D. G. Molecular crystalline materials with tunable luminescent properties: From polymorphs to multi-component solids. Materials Horizons. 1, (1), 46-57 (2014).
  20. Mu, S., Oniwa, K., Jin, T., Asao, N., Yamashita, M., Takaishi, S. A highly emissive distyrylthieno[3,2-b]thiophene based red luminescent organic single crystal: Aggregation induced emission, optical waveguide edge emission, and balanced ambipolar carrier transport. Organic Electronics: Physics, Materials, Applications. 34, 23-27 (2016).
  21. Binnemans, K. Interpretation of europium(III) spectra. Coordination Chemistry Reviews. 295, 1-45 (2015).
  22. Koyama, H., Fauchet, P. M. Anisotropic polarization memory in thermally oxidized porous silicon. Applied Physics Letters. 77, (15), 2316-2318 (2000).
  23. Kushida, T., Takushi, E., Oka, Y. Memories of photon energy, polarization and phase in luminescence of rare earth ions under resonant light excitation. Journal of Luminescence. 12-13, 723-727 (1976).
  24. Onuma, T., et al. Spectroscopic ellipsometry studies on β-Ga2O3 films and single crystal. Japanese Journal of Applied Physics. 55, (12), (2016).
  25. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, (4), 046010 (2014).
Гиперспектральная визуализация как инструмент для изучения оптической анисотропии в молекулярных однокристаллических кристаллах на основе лантанида
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).More

Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter