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Chemistry

Imágenes hiperespectrales como herramienta para estudiar la anisotropía óptica en cristales únicos moleculares basados en lantanoia

doi: 10.3791/60826 Published: April 14, 2020

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para obtener datos de imágenes hiperespectrales luminiscentes y para analizar las características de anisotropía óptica de cristales únicos basados en lantanoide utilizando un sistema de imágenes hiperespectrales.

Abstract

En este trabajo, describimos un protocolo para una novedosa aplicación de imágenes hiperespectrales (HSI) en el análisis de cristales únicos moleculares basados en lantanoide luminiscente (Ln3+). Como ejemplo representativo, elegimos un único cristal del complejo heterodinuclear basado en Ln [TbEu(bpm)(tfaa)6] (bpm-2,2'-bipirimidina, tfaa 1,1,1-trifluoroacetylacetonate) que exhibe una emisión visible brillante bajo excitación UV. HSI es una técnica emergente que combina imágenes espaciales en 2 dimensiones de una estructura luminiscente con información espectral de cada píxel de la imagen obtenida. Específicamente, HSI en cristales individuales del complejo [Tb-Eu] proporcionó información espectral local revelando la variación de la intensidad de la luminiscencia en diferentes puntos a lo largo de los cristales estudiados. Estos cambios se atribuyeron a la anisotropía óptica presente en el cristal, que resulta del embalaje molecular diferente de los iones Ln3+ en cada una de las direcciones de la estructura cristalina. El HSI aquí descrito es un ejemplo de la idoneidad de dicha técnica para las investigaciones espectro-espaciales de materiales moleculares. Sin embargo, es importante destacar que este protocolo se puede extender fácilmente para otros tipos de materiales luminiscentes (como cristales moleculares del tamaño de micrones, micropartículas inorgánicas, nanopartículas en tejidos biológicos o células etiquetadas, entre otros), lo que abre muchas posibilidades para una investigación más profunda de las relaciones estructura-propiedad. En última instancia, estas investigaciones proporcionarán conocimientos que se aprovecharán en la ingeniería de materiales avanzados para una amplia gama de aplicaciones, desde la bioimagen hasta aplicaciones tecnológicas, como guías de ondas o dispositivos optoelectrónicos.

Introduction

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La imagen hiperespectral (HSI) es una técnica que genera un mapa espacial donde cada coordenada x-y contiene una información espectral que podría basarse en cualquier tipo de espectroscopia, a saber, fotoluminiscencia, absorción y dispersión de espectroscopias1,,2,,3. Como resultado, se obtiene un conjunto tridimensional de datos (también llamado "cubo hiperespectral"), donde las coordenadas x-y son los ejes espaciales y la coordenada z es la información espectral de la muestra analizada. Por lo tanto, el cubo hiperespectral contiene información espacial y espectral, proporcionando una investigación espectroscópica más detallada de la muestra que la espectroscopia tradicional. Si bien HSI se conoce desde hace años en el campo de la teledetección (porejemplo, geología, industrias alimentarias4),recientemente surgió como una técnica innovadora para la caracterización de nanomateriales2,,5 o sondas para aplicaciones biomédicas3,6,7,8. En términos generales, no se limita al dominio UV/visible/casi infrarrojo (NIR), sino que también puede extenderse utilizando otras fuentes de radiación, como los rayos X, por ejemplo, con el fin de caracterizar la distribución elemental en diferentes materiales9, o la radiación de Terahertz, donde se utilizó HSI para realizar la sensibilidad térmica en tejidos biológicos8. Además, el mapeo de fotoluminiscencia se ha combinado con el mapeo de Raman para sondear las propiedades ópticas de la monocapa MoS210. Sin embargo, entre las aplicaciones notificadas de HSI óptico, todavía hay sólo unos pocos ejemplos sobre HSI de materiales a base de lantanoide11,12,13,14,15,16,17. Por ejemplo, podemos citar: detección de cáncer en tejidos6,análisis de la profundidad de penetración de la luz en tejidos biológicos7,imágenes biológicas multiplexadas3,análisis de transferencia de energía multicomponente en sistemas híbridos11,e investigación de cambios inducidos por la agregación en propiedades espectroscópicas de la conversión de nanopartículas12. Claramente, el atractivo de HSI surge de su idoneidad para generar conocimiento sobre la luminiscencia específica del entorno, proporcionando información espacial y espectral simultánea sobre la sonda.

Aprovechando esta poderosa técnica aquí describimos un protocolo para investigar la anisotropía óptica del heterodinuclear Tb3+-Eu3+ single crystal [TbEu(bpm)(tfaa)6] (Figura 1a)13. La anisotropía óptica observada fue el resultado del diferente empaque molecular de los iones Ln3+ en las diferentes direcciones cristalográficas(Figura 1b),lo que dio lugar a que algunas caras de cristal mostraran más brillante, otras que muestran fotoluminiscencia más tenue. Se sugirió que el aumento de la intensidad de la luminiscencia en caras específicas del cristal se correlacionaba con una transferencia de energía más eficiente a lo largo de esas direcciones cristalográficas donde el Ln3+ Las distancias de iones Ln3+ fueron las13más cortas.

Motivados por estos resultados, proponemos el establecimiento de una metodología detallada para analizar la anisotropía óptica a través de HSI, abriendo el camino para una mejor comprensión de los procesos de transferencia de energía ión-ion y propiedades luminiscentes ajustables derivadas de la disposición molecular específica18,,19. Estas relaciones estructura-propiedades han sido reconocidas como aspectos importantes para el diseño de materiales ópticos innovadores, incluidos, entre otros, los sistemas de guía de ondas y los dispositivos de almacenamiento optomagnéticos a nano y microescala, atendiendo la demanda de sistemas ópticos más eficientes y miniaturizados20.

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Protocol

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ADVERTENCIA: Se recomienda utilizar gafas de seguridad específicas para la longitud de onda de excitación que se utiliza en todo momento al operar el imager.

1. Configuración del microscopio hiperespectral

NOTA: En la Figura 2ase ofrece una visión general del sistema de imágenes hiperespectral, y se describen los principales componentes del imager. El sistema de imágenes se puede utilizar para la detección de la emisión visible o infrarroja cercana (NIR) de una muestra. Dependiendo de qué detección se desea (visible o NIR), la luz pasa a través de dos caminos de luz diferentes(Figura 2e). Se debe colocar una combinación de diferentes cubos de torneado de haz y cubos de filtro dicroico (cubos ópticos) en posiciones específicas del instrumento para seleccionar la ruta respectiva.

  1. Encienda el ordenador que está conectado al sistema de imágenes. Encienda el monitor del ordenador.
  2. Establezca la configuración de cubo óptico adecuada(Figura 2b,c).
    NOTA: Aquí se describe la configuración del imager(configuración de cubo óptico)para la asignación HSI mediante excitación UV y detección de emisiones visibles. Sin embargo, también es posible cambiarlo para la excitación NIR y la detección de emisiones visibles o NIR, dependiendo de la muestra analizada. Consulte la sección Resultados representativos para obtener un ejemplo.
    1. A partir de la etapa del microscopio (1 en la Figura 2a)y siguiendo la vía del haz de emisión hacia los detectores (3 en la Figura 2a), deje la primera posición para un cubo óptico (4 en la Figura 2b)vacante y coloque el cubo óptico del microscopio confocal (DFM1-P01) en la posición indicada como 5 en la Figura 2b,de modo que la emisión de la muestra se dirija a través de la trayectoria de luz visible.
    2. Mirando a lo largo de la trayectoria óptica hacia el detector, coloque el cubo óptico visible (CM1-P01), que contiene el espejo dicroico y los filtros para dirigir la emisión visible a las trayectorias de detección, en la posición indicada como 6 en la Figura 2b.
    3. Continuando con el camino hacia el detector, coloque el cubo óptico de agujero confocal (DFM1-P01) en la posición indicada como 7 en la Figura 2b para dirigir la luz a través de la trayectoria de detección de luz visible. A continuación, siguiendo el camino, coloque el cubo óptico del espectrómetro confocal (DFM1-P01) en la posición 8 de la Figura 2c para que la luz emitida llegue al detector.
    4. Para la asignación HSI, controle manualmente la abertura de la ranura del detector (9 en la figura 2c)para que coincida con el tamaño de los agujeros que se utilizan (alrededor de 50 mm es óptimo).
    5. En el software PHySpec, elija la apertura del agujero (5 en la Figura 3).
      NOTA: Cuanto más pequeña sea la apertura del agujero, mejor será la resolución HSI, a costa de la intensidad de la señal.
  3. Encienda la lámpara de banda ancha(Figura 2d, inserción) colocando el interruptor (10 en la Figura 2d)en la posición ON. Para controlar la intensidad de la luz de excitación, gire la perilla indicada por 11(Figura 2d)a valores más altos (32 – intensidad más baja) o más bajos (1 – intensidad más alta). Mantenga el obturador de la lámpara de banda ancha (12 en la Figura 2d)cerrado durante la configuración.
    NOTA: Los valores más altos corresponden a una mayor atenuación de la densidad de potencia emitida por la lámpara, mientras que los valores más bajos corresponden a una atenuación más baja.
  4. Encienda el siguiente hardware en el orden indicado a continuación estableciendo sus interruptores en la posición ON:
    1. Encienda el controlador de movimiento ThorLabs.
    2. Encienda la fuente de alimentación Nikon.
    3. Encienda el controlador ASI.
    4. Encienda el controlador Galvo.
    5. Encienda el detector ProEm.
    6. Encienda el detector Bayspec.
  5. En el ordenador, abra el software PHySpec haciendo doble clic en su icono.
    1. Presione la tecla F8 en el teclado para inicializar el sistema de upconversion IMA y haga clic el botón OK en la ventana conectar con el sistema.
      NOTA: Paso 1.5.1. También se puede realizar haciendo clic en la pestaña Sistema y luego haciendo clic en Conectar para llegar a la ventana Conectar al sistema. A continuación, se puede hacer clic en el botón Aceptar para conectar el sistema de imágenes al software.
    2. Asegúrese de que todos los menús aparecen en la interfaz (Cámara decolor, ProEm y Bayspec),así como en el panel de control del instrumento, en el lado izquierdo de la pantalla, como se muestra en la Figura 3.

2. Imágenes hiperespectrales de un cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)6]

  1. Para preparar la muestra, coloque el cristal en un portaobjetos de vidrio de microscopía. En caso de que sea necesario utilizar un aumento más alto, cubra el cristal con un vidrio de cubierta delgada y fíjelo con cinta adhesiva, de modo que la muestra se pueda colocar con el vidrio de cubierta delgada orientado hacia la lente objetivo.
  2. Coloque el portaobjetos de vidrio sobre el que se ha preparado la muestra en la etapa del microscopio y fíjela con los brazos metálicos(Figura 4a,b).
  3. Mueva la muestra utilizando el joystick(Figura 4c)del controlador ASI para colocar la muestra sobre los objetivos en uso.
  4. Coloque manualmente el cubo de filtro derecho en la rueda debajo de los objetivos (3 en la Figura 5)para seleccionar la excitación UV de la lámpara y dejar pasar la emisión visible hacia el detector.
    NOTA: Los cubos de filtro adicionales están disponibles para utilizar la excitación de luz verde o azul, por lo tanto, tener el cubo de filtro adecuado en su lugar es importante para la longitud de onda de excitación adecuada.
  5. Coloque manualmente el objetivo 20X (indicado por 5 en la Figura 5)debajo de la muestra y presione el botón blanco (6 en la Figura 5) en el lado izquierdo del microscopio para encender la luz blanca.
    1. Ajuste el brillo girando la perilla debajo del botón de encendido de luz blanca (7 en la Figura 5).
  6. En el software PHySpec, pulse el botón Reproducir (vídeo) en la ventana de la cámara en color, lo que provocará la adquisición de un escaneo en vivo.
    1. Si la ventana de la cámara en color muestra una imagen negra, aumente el tiempo de exposición (2 en la figura 3)y/o el valor de ganancia (3 en la figura 3)que se encuentra en el panel de control del instrumento, en la pestaña Cámara de color. Si la imagen vista es demasiado brillante, disminuya el tiempo de exposición y/o el valor de ganancia.
    2. Asegúrese de que la perilla delantera en el lado derecho del microscopio (2 en la Figura 5)esté establecida en R para enviar el 20% de la señal a la cámara/binoculares y el 80% de la señal al detector.
  7. Concéntrese en la muestra ajustando la distancia entre el objetivo y la etapa(Figura 4b). Esto se hace girando las perillas que se muestran en la Figura 4d en el lado derecho del microscopio.
    NOTA: La perilla más grande se utiliza para ajustes gruesos, mientras que la perilla más pequeña es para cambios de enfoque más delicados y pequeños.
  8. Asegúrese de que el objetivo elegido manualmente también está seleccionado en el software. En primer lugar, haga clic en el botón Ver en la barra de menú superior y, a continuación, haga clic en una barra de escala Mostrar/ocultar para mostrar la barra de escala en la imagen (1 en la Figura 3). A continuación, vaya a la pestaña Galvanómetro en el panel de control de instrucciones y seleccione el Objetivo utilizado (4 en la Figura 3). Asegúrese de que la barra de escala mostrada es correcta seleccionando el objetivo adecuado en el software.
  9. En el software, seleccione el detector adecuado yendo a la pestaña Diverter (ProEM – 6 en la Figura 3) y las rejillas yendo a la pestaña Filtro (1200 gr/mm en caso de ProEM – 7 en la Figura 3) en la pestaña SpectraPro SP-2300 .
  10. Abra el obturador de la lámpara de banda ancha (12 en la Figura 2)para permitir que se lleve a cabo la excitación UV de la muestra. Gire la perilla de intensidad (11 en la Figura 2d)a la posición deseada (por ejemplo, 8 – intensidad intermedia) para controlar la intensidad de la excitación de la lámpara de banda ancha (UV).
    1. Para elegir entre una iluminación de campo ancho (apertura abierta) o una iluminación puntual más pequeña (apertura más cerrada), controle el tamaño de la apertura del campo de la lámpara UV utilizando el stick y las perillas que se muestran en 4 en la Figura 5.
  11. En la pestaña SpectraPro SP-2300, seleccione una longitud de onda para observar la emisión de la muestra.
  12. Si se desconocen las longitudes de onda de emisión de la muestra, adquiera un espectro de emisión.
    1. En el secuenciador, haga clic en el signo + para agregar una nueva secuencia ("nodo") para la adquisición de un espectro de emisiones.
      1. Haga clic en Espectrómetro y luego en Adquisición de espectro (con escaneo espectral).
      2. Introduzca una longitud de onda mínima (es decir, 400 nm) y una longitud de onda máxima (es decir, 700 nm) y haga clic en Aceptar para establecer el rango espectral en el que se registrará el espectro.
      3. Elija el tiempo de exposición adecuado en el menú del lado izquierdo del software. Elija tiempos más cortos (por ejemplo, 0,1 s) para muestras muy brillantes y tiempos más largos (por ejemplo, 2 s) para emisores tenues.
      4. Ajuste la potencia de excitación en caso de excitación de la lámpara de banda ancha (UV) (véase el paso 1.3 anterior).
        NOTA: En caso de excitación de diodos NIR, se puede ajustar desde el menú desplegable Densidad neutra en el lado izquierdo del software PHySpec.
    2. En el secuenciador, haga clic en el botón de reproducción doble para ejecutar toda la secuencia. Una vez mostrado el espectro, tenga en cuenta las regiones de interés para la detección de la emisión de la muestra (porejemplo, 580 a 640 nm en el caso de las muestras basadas en Tb3+y Eu3+).
    3. Según sea necesario, optimice la detección de señal cambiando el enfoque de la muestra o ajustando el tiempo de exposición en el software PHySpec. Lograr una mayor optimización de la detección de señal a través del aumento de la intensidad de emisión de la muestra cambiando la potencia de la fuente de excitación (lámpara de banda ancha), como se ha descrito anteriormente.
  13. Ajuste el tiempo de exposición (p. ej., 0,5 s – 2 en la Figura 3) y la ganancia (3 en la figura 3)de la cámara de color en consecuencia, para obtener una imagen de buena calidad. Color Camera Si es necesario, agregue la barra de escala a la imagen haciendo clic en el botón Mostrar/ocultar barra de escala en la segunda fila del menú en la parte superior de la ventana del software PHySpec.
  14. Recomendación: Antes de adquirir el cubo hiperespectral, registre una imagen de microscopía óptica de campo brillante del cristal bajo luz blanca(Figura 6a)y/o iluminación UV completa(Figura 6b)o confinada(Figura 6c)(iluminación UV controlada por la abertura del obturador, mostrada como 4 en la Figura 5). Para ello, con la muestra enfocada, haga clic en el botón de reproducción de la cámara a color.
  15. Haga clic en Archivo y luego en Exportar vistade ventana , elija el formato deseado para exportar la imagen obtenida y guarde el archivo con la extensión deseada (.h5, . JPEG).
  16. Antes de adquirir la imagen hiperespectral, apague la iluminación de luz blanca, así como la luz de la habitación.
  17. Para obtener el cubo hiperespectral, escriba una nueva secuencia. Por lo tanto, en el secuenciador, haga clic en el signo + para agregar un nuevo nodo.
    1. Haga clic en Confocal Imager.
      1. Haga clic en Adquisición multiespectro. Aquí, el campo de visión deseado se define por el número de puntos a adquirir en las direcciones x e y y el tamaño del paso. Por ejemplo, utilice 100 puntos en x y 100 puntos en y con un tamaño de paso de 5 m para obtener una imagen de 500 por 500 m.
        Nota: El número total de puntos de adquisición y el tiempo de integración en cada punto afectarán directamente al tiempo total de adquisición del cubo hiperespectral.
        1. Introduzca los recuentos de posición X deseada (p. ej., 100) y posición Y (p. ej., 100) así como el tamaño de paso deseado (p. ej., 5 m). Seleccione la opción Hardware para la sincronización de la cámara, para la asignación de emisiones visible (y la opción Software en caso de detección NIR). Haga clic en Aceptar.
  18. En el secuenciador, haga clic en la línea de adquisición multiespectro recién agregada para resaltar el nodo.
  19. Haga clic en el botón Reproducir para ejecutar el nodo seleccionado.
    NOTA: El tiempo restante que tomará la adquisición aparecerá junto al nodo (en minutos, por ejemplo, 28 min).
  20. Una vez completada la adquisición, guarde el cubo hiperespectral en el formato de archivo adecuado (.h5).

3. Análisis de datos hiperespectrales

  1. Justo después de la adquisición, si el cubo hiperespectral guardado no se abre automáticamente en el software, recupere el cubo hiperespectral, que se guardó como archivo .h5, haciendo clic en Archivo en la barra de menú superior y luego pasando el cursor y haga clic en Abrir archivo.... Cuando la ventana titulada Seleccionar datos para abrir aparezca, elija la carpeta donde se guarda el archivo .h5 y haga doble clic en el archivo para abrirlo.
  2. Una vez importado el archivo de cubo hiperespectral, modifique la imagen del cubo hiperespectral mostrada para mostrar la intensidad de una longitud de onda espectral específica moviendo la barra en la parte superior de la imagen del cubo hacia la izquierda (longitud de onda inferior, por ejemplo, 580 nm) o derecha (longitud de onda más alta, por ejemplo, 638 nm).
    NOTA: La longitud de onda seleccionada se muestra en el lado izquierdo de esta barra superior (1 en la Figura 7).
  3. Después de elegir la longitud de onda de interés para el análisis(porejemplo, la intensidad máxima, que en el caso de [TbEu(bpm)(tfaa)6] es 613,26 nm), hacer uno (o todos) de los tres tipos posibles de análisis espectral: (A) la distribución espectral en forma de imagen (2 en la Figura 7); (B) un perfil de intensidad de emisión en una región de interés (3 en la figura 7); (C) extracción de un espectro en un punto o región de interés específico (4 en la Figura 7).
    1. En el caso de la distribución espectral de una imagen, utilice la función Recortar y Bin para aumentar la relación señal-ruido en la imagen. Para hacer eso, haga clic en el menú superior Procesamiento entonces elija los datos y después la opción Recortar y Bin.
    2. Para un perfil de intensidad de emisión, en la imagen del cubo, haga clic con el botón derecho y seleccione el perfil Crear destino o Crear X o Crear y, dependiendo de si solo es necesario analizar un punto (Objetivo - 5 y 6 en la Figura 7)o una línea (Perfil - 7 y 8 en la Figura 7). Seleccione el área de análisis arrastrando el destino, el perfil de línea horizontal o vertical con el cursor y muévalo a través del cubo.
      1. Una vez que el perfil se ha seleccionado correctamente, haga clic con el botón derecho en la región y seleccione Agregar destino al gráfico. Elija la opción para crear un nuevo gráfico para mostrar la intensidad de emisión (ejey) en función de la posición física del objetivo (eje x). El espectro aparecerá en el nuevo gráfico que se insertó (6 y 7 en la Figura 7).
        NOTA: Se pueden crear varios objetivos, que se mostrarán como perfiles de emisión de diferentes colores (5 y 6 en la Figura 7).
    3. Alternativamente, obtener un espectro de emisión de un área específica de la muestra (9 en la figura 7). Para empezar, coloque el cursor sobre la imagen del cubo y haga clic con el botón derecho. Haga clic en las opciones Selección de rectángulo o Selección de elipse en la pestaña que aparece.
      1. Dibuje la forma de selección (por ejemplo, un rectángulo) sobre la región deseada haciendo clic y arrastrando el cursor por el cubo. Una vez que el área se ha seleccionado correctamente, haga clic con el botón derecho en la región y seleccione Agregar selección al gráfico.
      2. En la ventana que aparece Añadir al gráfico, seleccione Crear un nuevo gráfico para mostrar los espectros de emisión del objetivo y haga clic en Aceptar.
        NOTA: Aparecerá una nueva línea de color (8 en la Figura 7) en el gráfico en el que se muestra la emisión objetivo, con la intensidad de emisión como eje y y la longitud de onda en el eje x. Este espectro corresponde a la intensidad promediada del área seleccionada para cada longitud de onda.
  4. Una vez obtenido el espectro, guárdelo antes de seleccionar una nueva región porque solo se puede seleccionar una región a la vez. Para ello, seleccione la ventana en la que contiene el gráfico. En el menú Archivo, seleccione Guardar como y elija guardar el gráfico en la carpeta de su elección, utilizando el nombre de elección, ya sea en formato .h5, que se puede abrir en el software PHySpec, o en formato .csv, que se puede importar en Excel.

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Representative Results

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Para ilustrar la configuración del microscopio hiperespectral para la adquisición de datos en un cristal único molecular basado en Ln (es decir, [TbEu(bpm)(tfaa)6], Figura 1a), la Figura 2 muestra una visión general del sistema, así como la colocación correcta de los cubos ópticos en la configuración. La Figura 3 muestra una captura de pantalla del software PHySpec que contiene los menús utilizados durante la adquisición de HSI. La Figura 4 y la Figura 5 muestran la etapa del microscopio con mayor detalle, incluyendo la colocación de la diapositiva de vidrio que contiene la muestra a analizar. La iluminación UV seleccionada se encendió para mostrar la luminiscencia roja visible del cristal(Figura 4a y 1 en la Figura 5). La Figura 6a muestra una imagen de campo brillante del cristal grabada después de ajustar la muestra en el enfoque adecuado. La morfología del cristal se puede ver claramente. La Figura 6b,c muestra la imagen del mismo cristal bajo excitación UV con vista completa(Figura 6b)o confinado localmente(Figura 6c). Bajo la amplia iluminación UV, las diferencias de brillo de emisión de las diferentes caras del cristal son inmediatamente visibles. La iluminación confinada se puede utilizar como una opción, principalmente para investigar cualquier efecto de la transferencia de energía o luz en el cristal, que puede desencadenar un comportamiento similar a la guía de ondas. En este caso, se detecta una fuerte emisión en un punto que no está directamente bajo excitación. Esto sugiere que la migración energética eficiente se lleva a cabo a través del cristal13 (5 y 6 en la Figura 7).

A partir del cubo hiperespectral adquirido, es posible obtener la distribución espectral en forma de una imagen que representa una longitud de onda específica, el perfil de intensidad de una longitud de onda de emisión específica, así como los espectros de emisión en cualquier píxel o área del cubo hiperespectral adquirido. Por ejemplo, los espectros de emisión indicados en la Figura 7 (panel 4) muestran las bandas de emisión más características del ion Eu3+: la banda observada a 590 nm se asigna al dipolo magnético (MD) 5D0a7F1 transición de Eu3+,mientras que los picos de emisión en la región de 610 a 630 nm provienen del dipolo eléctrico forzado hipersensible (ED) 5D0a7F2 Eu3+. La relación entre la intensidad integrada de estas dos transiciones es bien conocida por ser una excelente sonda del entorno químico alrededor del ion Ln3+ en la estructura del cristal único21:cuanto menor sea la simetría alrededor del ln3+, mayor será la relación ED/MD. Esto permite sacar conclusiones sobre el carácter de simetría del entorno químico del ion Ln3+. Por otra parte, la división de Stark de la transición 5D0a7F2 también se puede correlacionar con la simetría alrededor del Ln3+ en su entorno cristalográfico - cuanto menor sea la simetría, mayor será el número de subniveles de Stark. En el caso del polimorfo similar a una aguja cristalizado en el sistema de cristal triclínico simétrico bajo, la transición de 5D0a7F2 se divide en cuatro subpicos (espectros mostrados en la Figura 7,panel 4). Este análisis es particularmente atractivo cuando se comparan las propiedades ópticas de varios polimorfos de un cristal luminiscente. Anteriormente demostramos que la información sobre el entorno químico se dedujo del análisis óptico se correlacionaba bien con la estructura de cristal molecular obtenida por el análisis de rayos X de cristal único13. Por otra parte, el perfil espectral a lo largo de las diferentes caras de cristal que se muestra en la Figura 7 (panel 3), que indica una emisión más brillante en la punta y las caras laterales, también se puede correlacionar con el Ln3+ Las distancias de iones Ln3+ en las tres direcciones espaciales(Figura 1b):el embalaje más denso Ln3+ a lo largo de los ejes perpendiculares a la punta y las caras laterales, respectivamente, favorecen la transferencia de energía ión-ion. Por lo tanto, la mejora de las emisiones se observa en las caras respectivas, por lo tanto, anisotropía óptica.

En general, las diversas opciones de análisis de datos, que se muestran en la Figura 7 y la Figura 8,constituyen las características más importantes de la información espectroscópica y espacial combinada, que es posible explorar mediante el análisis HSI de muestras luminiscentes.

Figure 1
Figura 1: Estructura molecular y disposición cristalográfica. ( a ) Estructura del complejo heterodinuclear basado en Ln [TbEu(bpm)(tfaa)6], donde Ln1 y Ln2 son iones Tb3+ y Eu3+. a Los grupos desordenados y los átomos de hidrógeno se omiten para mayor claridad. Código de color: Eu: cian oscuro; C: gris; O: rojo; N: azul; F: verde lima. (b) Representación del embalaje molecular en el cristal: i) vista superior y (ii) vista de punta de la estructura de cristal único similar a una aguja con Ln- Las distancias Ln (subunidades de tfaa y átomos de hidrógeno se omiten para mayor claridad). (iii) Disposición de embalaje de cristal de los dimers [TbEu(bmp)(tfaa)6] (se omiten átomos de hidrógeno para mayor claridad). (iv) Diagrama de las caras de crecimiento de cristal del dimer que revela la Ln. Distancias Ln en las direcciones (0 1 0) y (2 -1 1). La cifra se ha modificado de la referencia 13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Descripción general del sistema de imágenes hiperespectrales. Se muestra la configuración necesaria para el mapeo de luminiscencia en la región espectral visible mediante excitación UV. (a) Vista general del sistema, donde 1 es la etapa del microscopio, 2 es la sección que contiene la configuración óptica, y 3 es el espectrómetro con los detectores visibles y NIR. (b) Vista abierta de la configuración óptica cerca de la etapa del microscopio (lado derecho de a) que muestra la configuración óptica para el experimento: la posición del cubo óptico 4 permanece vacía y el cubo del microscopio confocal se coloca en la posición 5 para enrutar la luz a través de la trayectoria visible, el cubo visible se coloca en la posición 6 para dirigir la luz visible a la trayectoria de detección, y el cubo de agujero confocal se coloca en la posición 7 con el fin de enrutar la luz a la trayectoria de detección visible. (c) Vista abierta de la configuración óptica más cercana a los detectores (lado izquierdo de a), mostrando la posición 8,donde se coloca el cubo del espectrómetro confocal para reflejar la luz en el espectrómetro y la cámara visible. El recuadro 9 muestra el tornillo para ajustar la anchura de apertura de la ranura del espectrómetro. (d) Vista de la etapa del microscopio, ordenador y lámpara de banda ancha (utilizada para excitación UV). En el recuadro, el controlador de la lámpara de banda ancha se muestra con más detalle: 10 es el botón de encendido / apagado, 11 es el mando para controlar la intensidad de la lámpara, y 12 es el botón del obturador. (e) Esquema que muestra la trayectoria óptica visible/NIR desde la etapa del microscopio hasta los detectores, incluidas las posiciones del cubo óptico de 4 a 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Captura de pantalla del software PHySpec que muestra el menú con los parámetros a ajustar para el HSI. 1 permite insertar la barra de escala en la imagen de la cámara en color; 2 y 3 permiten controlar el tiempo de exposición y el valor de ganancia de la cámara de color, respectivamente; la lente objetivo adecuada debe seleccionarse en 4; 5 permite la selección de la abertura del agujero; 6 (Diverter) y 7 (Filtro) permiten elegir el detector y la rejilla, respectivamente; el tiempo de exposición del detector visible se establece en 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Vista general de la etapa del microscopio. (a) Colocación del portaobjetos de vidrio que contiene la muestra en el escenario, con la iluminación UV ON que muestra la luminiscencia roja de la muestra (pequeño punto rojo en el centro de la diapositiva de vidrio). (b) Vista de la etapa del microscopio con el condensador de iluminación de luz blanca en la parte superior. (c) Controlador de etapa que muestra el joystick que controla el movimiento del escenario en las direcciones indicadas por las flechas naranja y amarilla (también se muestra en (a). (d) Vista detallada del botón de enfoque, que mueve el escenario en las direcciones indicadas por la flecha roja (también se muestra en (b)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Los componentes de la etapa del microscopio. 1 etapa del microscopio con la muestra en la diapositiva de vidrio colocada en la etapa de la muestra en la parte superior de las lentes objetivo; 2 ruedas para ajustar el enfoque (rueda grande) y dirigir la emisión capturada (rueda pequeña) ya sea sólo al detector (L), parcialmente al detector y parcialmente a la cámara (R), o únicamente a las lentes binoculares (ojo); 3 rueda de filtros de excitación/emisión utilizada para elegir el rango de longitud de onda de excitación. El detalle de la derecha muestra el cubo de filtro que contiene el filtro UV y el filtro de paso largo utilizado en este experimento; 4 en la parte superior/inferior se muestran las perillas para mover el haz de excitación a través de la muestra, mientras que en el medio, el control de apertura de campo circular; 5 lentes objetivas; 6 Botón ON/OFF de la iluminación de luz blanca; 7 perilla para ajustar el brillo de la lámpara de luz blanca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Imágenes de microscopía óptica del cristal único analizado. Estas imágenes se obtuvieron bajo (a) iluminación de luz blanca, (b) iluminación UV de visión completa, utilizando la apertura circular de excitación completamente abierta, y (c) iluminación UV confinada localmente (marcada por el círculo blanco), utilizando una apertura circular de excitación más cercana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Captura de pantalla del software PHySpec que muestra el proceso de análisis de datos de cubo hiperespectral. Se pueden aplicar diversos métodos de análisis espectral en el cubo hiperespectral adquirido: 1 muestra la longitud de onda que se eligió para la distribución de imagen espectral que se muestra en 2; 3 muestra los perfiles de intensidad horizontal (7) y vertical (8) de 613,26 nm; 4 muestra los espectros de emisión extraídos de los objetivos 5 y 6, así como del área resaltada en 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Aplicación alternativa de HSI sondeando la sinergia entre la conversión de nanopartículas y complejos de lantanoide. Este ejemplo muestra el análisis hiperespectral de un sistema híbrido compuesto por cristales moleculares ([Tb2(bpm)(tfaa)6]) combinado con nanopartículas de conversión ascendente (NaGdF4:Tm3+,Yb3+). (a) Fotomicrografías bajo iluminación de luz blanca y UV junto con la región de interés (ROI) utilizada para imágenes hiperespectrales bajo irradiación de luz de 980 nm. (b) Emisiones Tm3+ e indirectas de Tb3+ supervisadas en un área de 20 x 20 m2. (c) La variación de la intensidad absoluta de las bandas de emisión fluctuó en todo el sistema híbrido indicando cierta variabilidad en la cantidad total de material distribuido sobre la superficie. (d) La constancia de la relación entre la emisión integrada del complejo frente a Tm3+: 1G4a3H6 (cuadrados) y Tm3+: 1G4x3F4 (círculos) confirmó la presencia simultánea de las dos mitades en todo el sistema híbrido y la interacción homogénea entre ellas. Las barras de escala son de 20 m en los fotomicrografías y de 5 m en los ROI y mapas espectrales. Los fotomicrografías se presentan en colores reales. La figura se ha modificado de la referencia 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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El protocolo de imágenes hiperespectrales aquí descrito proporciona un enfoque sencillo que permite obtener información espectroscópica en ubicaciones precisas de la muestra. Usando la configuración descrita, la resolución espacial (asignaciónx e y) puede alcanzar hasta 0.5 m mientras que la resolución espectral puede ser de 0.2 nm para la asignación en el rango visible y 0.6 nm para el rango NIR.

Con el fin de realizar mapeo hiperespectral en un solo cristal, la preparación de la muestra sigue un procedimiento fácil: el cristal se puede colocar simplemente en una diapositiva de microscopía de vidrio, cubierta por un vidrio de cubierta según sea necesario. Enfocar la muestra utilizando las lentes objetivas adecuadas y la imagen de campo brillante en la configuración de la cámara de color en el software es un paso muy importante durante la etapa de preanálisis para obtener las mejores imágenes hiperespectrales resueltas. Típicamente, mayores intensidades de emisión se obtienen cuando la muestra está bien enfocada. Una vez hecho esto, la elección de los parámetros del análisis como los recuentos x e y y el tamaño del paso dictará el campo de visión y el muestreo espacial, respectivamente del cubo hiperespectral obtenido. Sin embargo, la apertura numérica del objetivo y las longitudes de onda de excitación/emisión dictan el volumen real de la muestra que se sondea en cada punto de adquisición. Por ejemplo, para el objetivo utilizado en este estudio, con apertura numérica (NA) de 0,4, y utilizando la excitación en el rango espectral UV (390 nm), el punto láser enfocado tiene un tamaño de aproximadamente 0,6 x 0,6 m en la dirección x e y. El tamaño del punto láser se calculó utilizando el sitio web (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, al que se accede el 26 de sep. 2019). Si el tamaño de paso elegido es mayor que el muestreo espacial, uno puede estar muestreando un área menor que la dada por el tamaño del paso. Si la muestra es homogénea, el submuestreo puede no ser un problema. Sin embargo, si las variaciones espaciales en la muestra son importantes de detectar, el muestreo óptimo se obtiene con un tamaño de paso establecido a la mitad del tamaño del rayo láser en la muestra. El tiempo de exposición elegido y la intensidad de la iluminación uv seleccionada controlarán la intensidad de los espectros obtenidos. Estos parámetros varían de una muestra a una muestra, dependiendo de la intensidad de emisión y la sensibilidad hacia la excitación UV.

En este punto, los pasos críticos dentro del protocolo se pueden enumerar como: la alineación del sistema óptico, la correcta colocación de los cubos ópticos, la regulación de la apertura circular de las aberturas de excitación y de corte del detector, la elección del agujero, el enfoque de la muestra en la cámara de color utilizando las lentes de objetivo adecuados, la intensidad de la lámpara de banda ancha y la elección adecuada del cubo de filtro de paso largo (permitiendo la excitación UV) , así como la elección del tamaño de paso adecuado y el tiempo de exposición como se mencionó anteriormente. Por último, las luces de la habitación deben estar apagadas durante todo el tiempo de la adquisición del cubo hiperespectral.

En caso de detección de señal deficiente, ya sea con la cámara de color o el espectrómetro, la solución de problemas de la técnica debe incluir la comprobación cuidadosa de cada uno de los pasos críticos dados anteriormente, antes de iniciar la adquisición del cubo hiperespectral. La configuración de la señal de salida en la etapa del microscopio también es importante. Las tres configuraciones posibles son: ojo (100 % de la señal de salida se envía al soporte binocular del microscopio), L (100 % de la señal de salida se envía a los detectores) y R (el 80 % de la señal de salida se envía a los detectores y el 20 % al soporte binocular del microscopio). Durante la adquisición del cubo hiperespectral, se debe utilizar la configuración R o L. Si se eligen correctamente todos los parámetros enumerados anteriormente, se puede obtener información espacial y espectral de alta resolución de la muestra.

Algunas posibles modificaciones de la técnica aquí descrita pueden ser ejemplificadas por las imágenes hiperespectrales de otros sistemas, como las micropartículas luminiscentes14 o los sistemas híbridos ópticos compuestos por cristales moleculares combinados con nanopartículas de conversión ascendente(Figura 8)11. En estos ejemplos, el diodo láser NIR (980 nm) se utilizó como fuente de excitación, reemplazando la excitación UV, mientras se detectaba la emisión visible generada. En este último ejemplo del sistema híbrido, HSI reveló la homogeneidad de las películas híbridas que combinan nanopartículas de conversión ascendente (NaGdF4:Tm3+,Yb3+) y [Tb2(bpm)(tfaa)6] cristales en un sistema isotrópico multilongitud de onda sensible, exhibiendo transferencia de energía entre materiales y moléculas (Figura 8)11. Además, mediante el uso del detector InGaAs del sistema, la detección de emisiones en la región espectral NIR (1000 a 1700 nm) es posible. Esto es de particular interés cuando se solicita la investigación de sondas ópticas basadas en NIR para aplicaciones biomédicas3. En este caso, la configuración de cubos ópticos del sistema(figura 2e)tiene que fijarse para la trayectoria NIR. En el caso de la emisión NIR excitación-NIR, una de las limitaciones de la técnica hiperespectral aquí descrita se hace evidente: al ser dependiente de la longitud de onda, la resolución espectral en la región NIR es menor que la de la detección visible, es decir, aproximadamente 0,6 nm(frente a 0,2 nm). Por otra parte, en el caso de las entidades de sub-1 m, en, por ejemplo, cristales moleculares más pequeños, nanopartículas o sistemas híbridos, la resolución espacial, dictada por la configuración del sistema (objetivos utilizados y longitudes de onda de excitación/emisión), se convierte en otra limitación potencial.

Por último, (independientemente de la configuración HSI elegida y el régimen de longitud de onda) la manipulación de datos se puede realizar con el software del instrumento o, como se muestra en el caso de los perfiles espectrales, puede exportarse para ser analizado en otros paquetes de software como Origin® o Microsoft Excel. En nuestro ejemplo, la anisotropía óptica del cristal también se reveló rápidamente en la imagen de la cámara de color, a saber, por la fuerte variación de intensidad a lo largo de las diferentes caras de cristal. Además, en el marco de la amplia excitación UV, se obtienen diferentes intensidades de emisión en función de qué cara se analice(Figura 7). La posibilidad de obtener el perfil de intensidad de emisión en diferentes puntos de interés en el cristal (objetivos en la Figura 7)permite además estudiar la variación en la intensidad de emisión y, si está presente, también en forma espectral. El polimorfo en forma de bloque del [TbEu(bpm)(tfaa)6] constituye un ejemplo en el que dos caras de cristal presentaban intensidades de emisión igualmente altas y una menor intensidad de emisión para el tercero13. Dependiendo de esto, en caso de un sistema sin ninguna anisotropía, la intensidad de emisión sería la misma para todas las caras de cristal.

Los métodos complementarios para sondear la anisotropía óptica están, por ejemplo, relacionados con la presencia de emisión polarizada de una muestra. Estos incluyen memoria de polarización o elipsometría espectroscópica. La primera consiste en la correlación entre el estado de polarización de la luz emitida por el material con el estado de polarización de la luz de excitación incidente,22,,23 mientras que el segundo mide el cambio en el estado de polarización de la luz después de ser reflejada oblicuamente por una película de muestra delgada24. Sin embargo, una ventaja de utilizar imágenes hiperespectrales como herramienta para sondear la anisotropía óptica, como se muestra aquí, viene con el hecho de que la presencia de polarización no es un requisito para el análisis de muestras. Además, la preparación de la muestra no requiere la fabricación de películas delgadas, ni una orientación muy cuidadosa del cristal con respecto al incidente y la luz recogida. Estos aspectos hacen que la técnica de HSI sea potencialmente más aplicable. Además, las características anisotrópicas se visualizan rápidamente en el momento de la adquisición de imágenes, y el análisis de datos es sencillo (como se ejemplifica anteriormente).

Teniendo en cuenta un alcance más amplio, la importancia de la técnica HSI se puede atribuir a su característica única para corelacionar la señal óptica con características dependientes del entorno. Por ejemplo, esta conexión es esencial para mejorar la comprensión de las interacciones nanobio3,15,16 en el campo creciente de la nanomedicina o incluso para entender la relación estructura-propiedades en la ciencia de los materiales10,11,12,13. Como tal, las futuras aplicaciones potenciales de la técnica aquí descrita pueden ser nombradas como, pero no limitarse a: análisis de muestras biológicas in vitro, ex vivo e in vivo realizando el mapeo de moléculas de interés biológico4,6, adaptación de la etapa del microscopio para estudiar propiedades optoelectrónicas específicas del entorno (porejemplo, muestras incrustadas en circuitos eléctricos), detección óptica de temperatura8,,15 (mediante la adición de un controlador de temperatura a la etapa del microscopio) o detección de gas (mediante la adaptación de una cámara de gas a la etapa del microscopio). HSI se ha demostrado además como adecuado para técnicas de excitación de fluorescencia en lugar de emisión de fluorescencia25. Un buen ejemplo del uso de esta adaptación técnica hiperespectral en particular es la detección de células cancerosas en los tejidos biológicos6. En consecuencia, el protocolo aquí descrito tiene el potencial de extenderse en gran medida al estudio de las características espectroscópicas de muchos tipos diferentes de estructuras luminiscentes.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar. Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores agradecen al Sr. Dylan Errulat y al Prof. Muralee Murugesu del Departamento de Química y Ciencias Biomoleculares de la Universidad de Ottawa por el suministro de cristales únicos [TbEu(bpm)(tfaa)6]. E.M.R, N.R. y E.H. agradecen el apoyo financiero proporcionado por la Universidad de Ottawa, la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI) y el Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope glass slides FisherBrand 12-550-15 Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager PhotonETC Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number

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Imágenes hiperespectrales como herramienta para estudiar la anisotropía óptica en cristales únicos moleculares basados en lantanoia
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Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).More

Rodrigues, E. M., Rutajoga, N., Rioux, D., Yvon-Leroux, J., Hemmer, E. Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals. J. Vis. Exp. (158), e60826, doi:10.3791/60826 (2020).

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