यहां, हम प्रोटीन (आईसी-एफपीओपी) के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को प्रोटीन फुटप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन संरचना और इंटरैक्शन साइटों की विशेषता रखते हैं।
प्रोटीन (एफपीओपी) का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण प्रोटीन संरचना और बातचीत की विशेषता के लिए उपयोग की जाने वाली एक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी प्रोटीन पदचिह्न विधि है। FPOP हाइड्रोक्साइल कणों का उत्पादन हाइड्रोजन पेरोक्साइड को फोटोयुक्त करने के लिए 248 एनएम एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है। ये कण 20 अमीनो एसिड में से 19 के विलायक उजागर साइड चेन को संशोधित करते हैं। हाल ही में, इस विधि का उपयोग लाइव कोशिकाओं (आईसी-एफपीओ) में उनके मूल वातावरण में प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गया है। कोशिकाओं में प्रोटीन का अध्ययन अंतरआणविक भीड़ और विभिन्न प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए होता है जो इन विट्रो अध्ययनों के लिए बाधित होते हैं। आईसी-एफपीओ के दौरान सेल एग्रीग्रेशन और क्लोजिंग को कम करने के लिए एक कस्टम सिंगल सेल फ्लो सिस्टम डिजाइन किया गया था। यह प्रवाह प्रणाली व्यक्तिगत रूप से एक्सीमर लेजर पिछले कोशिकाओं को केंद्रित करती है, इस प्रकार लगातार विकिरण सुनिश्चित करती है। एक क्रिस्टल संरचना से गणना प्रोटीन की विलायक पहुंच के लिए FPOP से उत्पादित ऑक्सीकरण की सीमा की तुलना करके, आईसी-FPOP प्रोटीन की विलायक सुलभ साइड चेन की सटीक जांच कर सकता है।
हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) एक ऐसी विधि है जो हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स से उत्पादित सहसंयोजक संशोधनों के माध्यम से प्रोटीन की विलायक पहुंच की जांच करती है। जब प्रोटीन संरचना या प्रोटीन इंटरैक्शन बदलते हैं, तो यह अमीनो एसिड के विलायक एक्सपोजर को बदल देगा, इस प्रकार अवशेषों के संशोधन की सीमा में फेरबदल करेगा। एचआरपीएफ के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन1,2,,3 और प्रोटीन प्रसंरचना परिवर्तन,4,,5,,6 को सफलतापूर्वक विट्रो में पूछताछ की गई है । ऐसे कई तरीके हैं जो एचआरपीएफ प्रयोगों के लिए हाइड्रोक्सिल कण उत्पन्न करते हैं, एक प्रोटीन (एफपीओपी) का तेजी से फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण है। एफपीओ को 2005 में हैम्बली और ग्रॉस द्वारा विकसित किया गया था और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)7के फोटोलिसिस के माध्यम से हाइड्रोक्सिल कणों का उत्पादन करने के लिए 248 एनएम एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है।
हाल ही में, एस्पिनो एट अल ने लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए एफपीओ के उपयोग को बढ़ाया, एक विधि जिसे इन-सेल एफपीओ (आईसी-एफपीओ)8कहा जाता है। इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, विभिन्न प्रोटीन इंटरैक्शन के साथ आणविक भीड़ के लिए कोशिकाओं में प्रोटीन का अध्ययन करना जो संभावित रूप से संरचना को प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटेम वाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी करने के लिए एक बार में कई प्रणालियों की संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने वाले पूर्ण प्रोटेम का एक स्नैपशॉट प्रदान करने का लाभ प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, यह तकनीक प्रोटीन के लिए आदर्श है जो झिल्ली प्रोटीन की तरह विट्रो का अध्ययन करना मुश्किल है।
आईसी-एफपीओ के प्रारंभिक अध्ययनों ने प्रोटीन बहुतायत और सेलुलर स्थानीयकरण में शामिल 105 प्रोटीन की सफलतापूर्वक जांच की। आईसी-एफपीओ विधि में सुधार करने के लिए, रिनास एट अल ने एकल सेल प्रवाह9के लिए एक माइक्रोफ्लो सिस्टम विकसित किया। मूल प्रवाह प्रणाली की वृद्धि सेल एकत्रीकरण को सीमित करता है और विकिरण के लिए उपलब्ध उपलब्ध एच2ओ2 को बढ़ाता है। प्रारंभिक प्रवाह प्रणाली में, सिलिका ट्यूबिंग में झुरमुट कोशिकाओं के परिणामस्वरूप मोजे और असमान विकिरण हुआ। एक म्यान बफर हाइड्रोडायनामिक रूप से दो धाराओं का समावेश कोशिकाओं को केंद्रित करता है, जिससे उन्हें लेजर के पिछले व्यक्तिगत रूप से प्रवाहित करने की अनुमति मिलती है। एच2ओ2 के लिए एक अलग सिरिंज का समावेश प्रतिकूल प्रभावों के बिना उच्च एच2ओ2 सांद्रता की अनुमति देने वाले अधिक नियंत्रित और अनुकूलनीय एक्सपोजर समय को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, ऊष्मायन समय को सीमित करने से एंडोजेनस कैटालास द्वारा एच2ओ2 के टूटने की सीमा होती है। इस नए प्रवाह प्रणाली को शामिल करके, एक FPOP संशोधन के साथ प्रोटीन की पता लगाया संख्या 13 गुना वृद्धि हुई है, इस प्रकार इस विधि की क्षमताओं का विस्तार करने के लिए रहने वाले कोशिकाओं में प्रोटीन की एक भीड़ की जांच । इस प्रोटोकॉल में आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली की असेंबली पर ध्यान केंद्रित करते हुए एक सामान्य आईसी-एफपीओ प्रयोग का वर्णन किया गया है।
प्रोटीन संरचना और प्रोटीन-लिगामेंट परिसरों को पूरी कोशिकाओं या कोशिका ओं में एक प्रोटेम-वाइड तरीके से अध्ययन करने के लिए कई बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित तकनीकविकसित की गई है। इन तकनीकों में ऑक्सीकरण (एसपीरॉक्स), थर्मल प्रोटेम प्रोफाइलिंग (टीपीपी), केमिकल क्रॉस-लिंकिंग (एक्सएल-एमएस), और हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) की दर से प्रोटीन की स्थिरता तक सीमित नहीं हैं। प्रत्येक तकनीक में एक-दूसरे की तुलना में अद्वितीय सीमाएं और फायदे होते हैं, जिनकी बड़े पैमाने पर12की समीक्षा की गई है। इनमें से प्रत्येक विधियों का उपयोग प्रोटीन संरचना को स्पष्ट करने और अंततः जटिल सेलुलर वातावरण के भीतर कार्य करने के लिए प्रोटेम वाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के लिए किया गया है। आईसी-एफपीओ एक एचआरपीएफ तकनीक है जो अमीनो एसिड की सॉल्वेंट उजागर साइड चेन को संशोधित करने के लिए हाइड्रोक्सिल कणों का उपयोग करती है, जो व्यवहार्य कोशिकाओं13के भीतर प्रोटीन संरचना और प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन की जांच करती है। आईसी-एफपीओ लाइव कोशिकाओं में प्रारंभिक एचआरपीएफ में सुधार है जिसने मिनट टाइमस्केल14पर कण उत्पन्न करने के लिए फेन्टन रसायन विज्ञान का उपयोग किया। इस अध्ययन में, बफर की पीएच या आयनिक ताकत को कम करने के जवाब में एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन में संरचनात्मक परिवर्तन सफलतापूर्वक प्रोटीन भर में अच्छे ऑक्सीकरण कवरेज के साथ विशेषता थी। फेंटन रसायन विज्ञान की तुलना में, आईसी-एफपीओ बहुत तेज है, माइक्रोसेकंड टाइमस्केल पर प्रोटीन को संशोधित करता है, इस प्रकार देशी प्रोटीन संरचना का अध्ययन करने में सक्षम होता है।
आईसी-एफपीओ के लिए एक महत्वपूर्ण परीक्षण एच2ओ2के संपर्क में आने के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता की पुष्टि करना है। 40 सेमी मिक्सिंग लाइन का उपयोग करके, कोशिकाओं को विकिरण से पहले लगभग 3 एस के लिए एच2ओ2 में इनक्यूबेटेड किया जाता है। इस बार इस सिलिका ट्यूबिंग की लंबाई बदलकर एडजस्ट किया जा सकता है। यह उल्लेखनीय है कि यद्यपि कोशिका व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए ट्राइपैन ब्लू का उपयोग एच2ओ2 ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं की अखंडता को निरंतर बनाता है, कोशिकाओं को एच2ओ2के साथ बातचीत करने वाले सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करने वाले तनाव में होने की संभावना हो सकती है। सौभाग्य से, प्रोटीन संश्लेषण की तुलना में कम ऊष्मायन समय तेज होता है जो मौजूद प्रोटीन एच2ओ2द्वारा प्रेरित नहीं होता है।
अगला महत्वपूर्ण कदम प्रवाह प्रणाली की उचित असेंबली की पुष्टि करना है । एक बार इकट्ठे होने के बाद, सुनिश्चित करें कि वांछित बफर के साथ सिस्टम को फ्लश करने के बाद कोई लीक मौजूद नहीं है। यदि लीक मौजूद हैं, तो सुनिश्चित करें कि सिलिका ट्यूबिंग को ठीक से काटा गया था और एक बार कड़ा करने के बाद उचित मुहर लगाने के लिए फेरूल के खिलाफ फ्लश किया जाता है। सभी भागहाथ-कड़ा हैं, इसलिए कोई उपकरण आवश्यक नहीं है। प्रत्येक आईसी-एफपीओ प्रयोग के दौरान, सुनिश्चित करें कि सेल सिरिंज में चुंबकीय उभारक गति में बने रहें। यह छोटा आंदोलन उन कोशिकाओं की संख्या को सीमित करता है जो सिरिंज के नीचे बसते हैं लेकिन कोशिकाओं को कतरनी करने के लिए पर्याप्त कठोर नहीं है। एक रन के बाद, सिरिंज में लगभग 50 माइक्रोन कोशिकाएं बची हैं। अगले प्रयोग तक ले जाने वाली कोशिकाओं की संख्या को सीमित करने के लिए हमेशा इसे एक रिंसिंग स्टेप के साथ पतला करना सुनिश्चित करें। यदि कई सेल उपचारों की तुलना की जा रही है तो नए सिरे से सेल सिरिंज का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। परीक्षण की जा रही कोशिकाओं के लिए एक उपयुक्त बफर का चयन करना भी महत्वपूर्ण है। कुछ बफ़र्स हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल को बुझाते हैं जिससे प्रोटीन पर कम संशोधन होते हैं। Xu एट अल से पता चला है कि कुछ आमतौर पर इस्तेमाल बफ़र्स हाइड्रोक्साइल कट्टरपंथी जीवनकाल11कम । डीपीबीएस और एचबीएसएस आईसी-एफपीओ प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले आम बफ़र्स हैं।
आईसी-एफपीओ के बाद, आवश्यक मापदंडों के आधार पर पाचन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करें। चूंकि एफपीओ अपरिवर्तनीय सहसंयोजक संशोधनों का उत्पादन करता है, इसलिए लेबलिंग कवरेज खोने के बिना पूरी तरह से पाचन और सफाई के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध है। हमेशा प्रोटीन एकाग्रता का परीक्षण और सामान्य करें ताकि समान पेप्टाइड सांद्रता को मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए लोड किया जा सके। अंत में, ध्यान रखें कि आईसी-एफपीओ के साथ मिलकर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन नहीं किया जा सकता है। यदि कोई एफपीओ संशोधन बातचीत के क्षेत्र को लक्षित करता है तो एंटीबॉडी की आत्मीयता कम हो जाएगी। FPOP संशोधनों की पहचान बढ़ाने में मदद करने के लिए, 2डी-क्रोमेटोग्राफिक पृथक्करण कदमों ने15का पता लगाया ऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड्स की संख्या को तीन गुना से अधिक दिखाया है ।
किसी भी FPOP प्रयोग की एक चुनौती संभावित ऑक्सीकरण उत्पादों के कारण डेटा विश्लेषण का जटिल स्तर है जो उत्पन्न हो सकता है। यह इन-सेल या इन विट्रो दोनों के लिए सच है लेकिन सेल लाइसेट्स का विश्लेषण करने की अतिरिक्त जटिलता के साथ काफी बढ़ जाता है। आईसी-एफपीओ के आगे अनुकूलन के साथ उच्च संशोधन कवरेज के साथ अधिक प्रोटीन उत्पन्न हो रहे हैं, इस प्रकार तेजी से विश्लेषण को और अधिक दुरूह बना रहे हैं। एक ही आईसी-एफपीओ प्रयोग से उत्पन्न डेटा की कतरनी मात्रा मैनुअल सत्यापन के उपयोग को सीमित करती है जिससे शोधकर्ताओं को सॉफ्टवेयर पर अधिक भरोसा करना पड़ता है। इसके कारण, रिनास एट अल ने प्रोटेम डिस्कवर (पीडी)16का उपयोग करके एचआरपीएफ के लिए एक क्वांटिटेशन रणनीति विकसित की। यह विधि एक स्प्रेडशीट में मात्रात्मक मंच के साथ संयुक्त पीडी पर एक बहु-खोज नोड कार्यप्रवाह का उपयोग करती है। आईसी-एफपीओ प्लेटफॉर्म पर आगे सुधार बढ़ ते हुए प्रजनन क्षमता और मात्रा सटीकता के साथ-साथ एफपीओ संशोधनों के साथ पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या बढ़ाने के लिए चल रहे हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एलएमजे के लिए एनएसएफ करियर अवार्ड (एमसीबी1701692) ने सपोर्ट किया।
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |