Summary
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en multicellulær neurovaskulær enhed stramt regulere hjernen homøostase. Ved at kombinere menneskelige iPSCs og organ-on-chip teknologier, har vi genereret en personlig BBB chip, egnet til sygdom modellering og CNS narkotika penetrability forudsigelser. En detaljeret protokol er beskrevet for produktion og drift af BBB-chippen.
Abstract
Blodhjernebarrieren (BBB) er dannet af neurovaskulære enheder (NVM), der beskytter centralnervesystemet (CNS) fra en række faktorer, der findes i blodet, der kan forstyrre sarte hjernefunktion. BBB er derfor en væsentlig hindring for leveringen af terapeutiske lægemidler til CNS. Akkumulere nde beviser tyder på, at BBB spiller en central rolle i starten og progression af neurologiske sygdomme. Således er der et enormt behov for en BBB model, der kan forudsige penetration af CNS-målrettede lægemidler samt belyse BBB's rolle i sundhed og sygdom.
Vi har for nylig kombineret organ-on-chip og induceret pluripotente stamceller (iPSC) teknologier til at generere en BBB chip fuldt personlig til mennesker. Denne nye platform viser cellulære, molekylære og fysiologiske egenskaber, der er egnede til forudsigelse af narkotika og molekyle transport på tværs af den menneskelige BBB. Desuden har vi ved hjælp af patientspecifikke BBB-chips genereret modeller af neurologiske sygdomme og vist potentialet for personlig prædiktiv medicinapplikationer. Forudsat her er en detaljeret protokol, der viser, hvordan man genererer iPSC-afledte BBB-chips, begyndende med differentiering af iPSC-afledte hjernemikrovaskulære endotelceller (iBMECs) og resulterer i blandede neurale kulturer, der indeholder neurale stamlitter, differentierede neuroner og astrocytter. Også beskrevet er en procedure for såning celler i organchip og dyrkning af BBB chips under kontrolleret laminar flow. Endelig gives detaljerede beskrivelser af BBB-spånanalyser, herunder permecellulære permeabilitetsanalyser til vurdering af lægemiddel- og molekylepermeabilitet samt immuncytokemiske metoder til bestemmelse af sammensætningen af celletyper i chippen.
Introduction
BBB er en meget selektiv barriere, der adskiller CNS fra det cirkulerende blod. Det beskytter kritiske hjernefunktioner fra potentielt forstyrrende stoffer, faktorer, og xenobiotika samtidig tillader tilstrømning en næringsstoffer og andre metabolitter, der kræves for at opretholde hjernen homøostase1. BBB er en multicellulær NVU, hvor pericytter, astrocyt endfeet, og neuronale processer direkte kontakt hjernen mikrovaskulære endotelceller (BMECs). Disse interaktioner gør det muligt for BMECs at danne specialiserede barriereegenskaber , der understøttes af tætte og klæbende vejkryds2,3. Dannelsen af denne barriere begrænser paracellulær passage af molekyler, men det indeholder polariserede transportører til aktivt at transportere molekyler ind i CNS eller tilbage i blodet1. På grund af disse unikke barriere egenskaber, BBB udgør en væsentlig hindring for levering af biofarmaceutiske lægemidler i hjernen, og det anslås, at mindre end 5% af FDA-godkendte små molekyler kan nå CNS4.
Dyremodeller har været meget anvendt til at studere BBB penetrance og de molekylære mekanismer, der er involveret i BBB udvikling5. Mens dyremodeller trofast repræsenterer det komplekse flercellede in vivo-miljø, udelukker forskelle i bbb-transportørers udtryk og aktivitet samt substratspecificitet på tværs af arter ofte nøjagtig ekstrapolering af dyredata til mennesker6. Således er menneskebaserede modeller afgørende for at studere den menneskelige BBB og til brug i udviklingen af lægemidler, der er designet til at målrette CNS. Dette behov bliver endnu tydeligere med den stigende dominans af biologiske, menneskespecifikke lægemidler på lægemiddeludviklingsområdet. Akkumulere beviser tyder på, at en kompromitteret BBB er forbundet med en række alvorlige CNS lidelser, herunder hjernetumorer og neurologiske sygdomme7,8,9. Menneskelige modeller, der trofast afspejler disse sygdomme, har potentiale til både 1) at identificere nye veje, der kunne målrettes mod udvikling af lægemidler og 2) forudsige CNS penetrance, hvilket reducerer tid og ressourcer i prækliniske undersøgelser og muligvis faldende fejlrate i kliniske forsøg.
In vitro-modeller er blevet bredt implementeret for at undersøge samspillet mellem BMECs og andre celler i NVU og gennemføre skærme for potentielle BBB-permeable lægemidler10. For at genskabe centrale aspekter af den menneskelige BBB skal in vitro-modeller ne udvise fysiologisk relevante egenskaber (dvs. lav paracellulær permeabilitet og fysiologisk relevant transendotelelektrisk resistens [TEER] på tværs af det endotelmonolag). Desuden skal in vitro-systemets molekylære profil omfatte udtryk for repræsentative funktionelle transportsystemer. Typisk er in vitro-modeller sammensat af endotelceller, der er co-kulturfremstillet på en semipermeable membran med kombinationer af andre NVU celler til at forbedre BBB egenskaber11. Denne fremgangsmåde giver mulighed for enkel og relativt hurtig vurdering af barrierefunktionalitet og molekylepermeabilitet. Sådanne cellebaserede BBB-modeller kan etableres med animalske eller menneskelige cellekilder, herunder celler isoleret fra kirurgiske excisions eller udødeliggjorte BMEC linjer.
For nylig blev protokoller til differentiere menneskelige pluripotente celler i BMECs indført som en attraktiv kilde til in vitro menneskelige BBB modeller12,13. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte BMECs (iBMECs) er meget skalerbare, demonstrere afgørende morfologiske og funktionelle egenskaber af den menneskelige BBB, og bære genetik af patienten. I kultur danner iBMECs et monolag, der udtrykker stramme krydsmarkører og viser in vivo-lignende stramme krydskomplekser. Disse celler udtrykker også BBB-markører, herunder BBB-glukosetransportøren, glukosetransportør1 (GLUT1). Vigtigt, og i modsætning til andre alternative cellekilder for humane BMECs, iBMECs erhverve barriere egenskaber med værdier så højt som dem, der måles i vivo14,polarisere langs basolateralakse, og udtrykke funktionelle efflux pumper. Desuden glæder brugen af iPSC'er fra forskellige begge 1) sig over muligheden for at teste aspekter af BBB på en personlig medicinmåde, og 2) giver en fleksibel kilde til generering af yderligere celletyper af NVU. Generering af disse celler fra en isogen celle kilde til at skabe personlige BBB chips ville også støtte i forståelsen af inter individuelle forskelle i lægemiddelrespons, som er en væsentlig årsag til resistens eller kompromitteret respons på behandling observeret i kliniske undersøgelser.
Brug af iBMECs som monolag i en skål eller på en semi gennemtrængelig transwell indsats repræsenterer en kraftfuld tilgang til BBB modellering. Disse systemer har tendens til at være robuste, reproducerbare og omkostningseffektive. Desuden er funktionelle analyser som TEER og permeabilitet relativt enkle at udføre. Men, to-dimensionelle (2D) systemer undlader at opsummere 3D karakter in vivo væv, og de mangler de fysiologiske forskydning stress kræfter, der leveres af cirkulerende blod og blodlegemer. Dette begrænser det vaskulære endotheliums evne i disse modeller til at udvikle og vedligeholde iboende BBB-egenskaber og -funktioner.
Microengineered systemer foret med levende celler er blevet gennemført til at modellere forskellige organ funktionaliteter i et koncept kaldet organ-on-chips. Ved at genskabe in vivo-lignende flercellede arkitektur, vævsvæv grænseflader, fysisk-kemiske mikromiljøer, og vaskulær perfusion, disse mikromanipulerede platforme generere niveauer af væv og organ funktionalitet ikke muligt med konventionelle 2D-kultursystemer. De muliggør også høj opløsning, realtidsbilleddannelse og analyse af biokemiske, genetiske og metaboliske profiler svarende til levende celler i in vivovæv og organkontekst. Men en særlig udfordring af orgel-on-chip er, at design, fabrikation, og anvendelse af disse mikroengineered chips kræver specialiseret ingeniørekspertise, der normalt mangler i biologisk orienterede akademiske laboratorier.
Vi har for nylig kombineret iPSC og organ-on-chip teknologier til at generere en personlig BBB chip model15,16. For at overvinde de beskrevne teknologiske udfordringer bruges den kommercielt tilgængelige Chip-S1 sammen med kulturmodulet, et instrument, der er designet til at automatisere vedligeholdelsen af chipsene på en enkel og robust måde (Emulate Inc.). BBB-chippen genskaber interaktioner mellem neurale og endotelceller og opnår fysiologisk relevante TEER-værdier, som måles ved specialfremstillede organchips med integrerede guldelektroder17. Derudover viser BBB-chippen lav paracellulær permeabilitet, reagerer på inflammatoriske signaler på organniveau, udtrykker aktive efflux-pumper og udviser prædiktiv transport af opløselige biomarkører og biofarmaceutiske produkter. Især, BBB chips genereret fra flere personer indfanger de forventede funktionelle forskelle mellem raske personer og patienter med neurologiske sygdomme15.
Nedenstående protokol beskriver en pålidelig, effektiv og reproducerbar metode til generering af humane iPSC-baserede BBB-chips under dynamiske flowforhold. Der gives vejledning om typen af analyser og slutpunktsanalyser, der kan udføres direkte i BBB-chippen eller fra prøvetagningsspildevand. Protokollen viser således spektret af teknikker, der kan anvendes til evaluering af biologiske og funktionelle egenskaber og reaktioner i en menneskerelevant model.
En kort beskrivelse af den iPSC-baserede BBB-chip findes her. Menneskelige iPSCs er oprindeligt differentieret og formeret i vævkultur kolber som fritflydende aggregater af neurale sår, betegnes EZ-kugler. Den øverste kanal af Chip-S116,18,19 er seedet med dissociated EZ-kugler, der danner "hjernen side" af chippen, som celler differentiere over 7 dage i en blandet kultur af neurale stamsygdomme celler (iNPCs), iAstrocytter, og iNeurons. Menneskelige iPSCs er også differentieret i vævskulturplader i iBMECs. Den nederste kanal af chippen er seedet med iBMECs at danne "blod side", som de udvikler sig til at danne en endotelrør (Figur 1). Den porøse ekstracellulære matrix (ECM)-belagt membran, der adskiller de øverste og nederste kanaler 1) tillader dannelsen af celle-til-celle interaktioner mellem kanaler og 2) giver brugeren mulighed for at køre permeabilitet assays og billedceller i begge kanaler ved hjælp af en konventionel lys mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generation af iPSC-afledte neurale stamceller celler (iNpS)
- Producere EZ-kugler fra iPSC kolonier som beskrevet nedenfor og som tidligere offentliggjort20,21,22.
- Kultur iPSC kolonier til sammenløb på kælderen membran matrix-belagt 6 brønd plader (0,5 mg / plade) i mTESR1 eller andre kommercielle medier (se Tabel over materialer).
- Fjern iPSC medium og erstatte med 2 ml EZ-sfære medium [ESM; DMEM:F12 7:3 suppleret med 100 ng/ml grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF), 100 ng/ml epidermal vækstfaktor, 5 μg/mL heparin og 2% B27 supplement].
- Skrab bunden af hver flydende brønd med bagsiden af en steril 1000 μL pipettespids eller celleskraber.
- Saml alle celler og sted i en ultra-lav vedhæftet fil T25 kolbe for at tillade spontan dannelse af fritflydende kugler. Inkuber natten over ved 37 °C.
- Fodre kuglerne hver 2-3 dage, når mediet bliver gult ved at erstatte halvdelen af mediet med frisk ESM. Dette giver mulighed for sfærer at forblive i konditioneret medium, hvilket er meget vigtigt for deres vækst og vedligeholdelse.
- Læn kolben på en rørrist, og lad kuglerne falde til ro i 1-2 min ned til kolbens hjørne.
- Når du er afgjort, aspirere halvdelen af supernatant med en 5 ml eller 10 ml serologisk pipette og erstatte med frisk, forvarmet ESM.
- Passage EZ-kugler ugentligt ved snitning kugler til 200 μm diametre som tidligere beskrevet23,20,21. EZ-kugler kan opretholdes i op til 25 passager og er ideelle, når de anvendes mellem passager 8-25.
- Forbered enkelt celle suspension af iPCCs:
- At fremkalde neural edifferentiering, dissociatEZ-sfære i enkelte celler.
- Saml kugler 3-4 dage efter snitning fra en T75 kolbe og overføre til en 15 ml konisk, så lad det stå i 2 min eller indtil alle kugler er afgjort i bunden.
- Fjern langsomt ESM med en 5 ml pipette uden at forstyrre de faste kugler. Der tilsættes 1 ml dissociationopløsning (se Materialetabel)og inkuberes i 10 min ved 37 °C.
- Swirl dissociation opløsning og kugler efter 5 min inkubation for at sikre, at eventuelle fast områder behandles.
- Fjern langsomt dissociationsopløsningen. Tilføj 1 ml neural differentieringsmedium [NDM; DMEM: F12 med 2% B27 minus vitamin A, 1% N2 supplement, og menneskelige hjerne-afledte neurotrofisk faktor (hBDNF, 20 ng/ml)].
- Det fastgør kuglerne til enkelte celler ved at pipettere ved hjælp af en 1 ml pipette efterfulgt af 200 μL pipette, indtil alle kugler er blevet adskilt. Undgå bobledannelse under triturationsproceduren.
- Tæl adskilte celler ved hjælp af et hæmocytometer og fortyndeceller til en endelig tæthed på 1 x 106 celler/ml. Det er muligt at ændre tætheden afhængigt af programmet.
BEMÆRK: Højere tætheder (op til 6 x 106 celler/ml) anbefales til kortvarige kulturer på op til 3 dage, og lavere tæthedanbefales til langsigtede anvendelser på op til 3 uger.
BEMÆRK: Celler er nu klar til at frø i den øverste kanal af chippen til at danne "hjernen side".
2. Differentiering af iPC'er i iBPC'er
- Passage iPSCs fra en enkelt flydende brønd af en 6 brønd plade på en 1:6 forholdet i en 6 godt kælder membran matrix-belagt plade. Lad cellerne klæbe i 24 timer. Skift iPSC-medie dagligt.
- Tælle celler dagligt ved hjælp af et hæmocytometer.
- Når cellerne når en tæthed på 1,5-3,0 x 105 celler/brønd, erstatter iPSC-mediet med 3 ml uiamineret medium uden bFGF (DMEM:F12 1:1, med 10% udskiftning af knockout serum (KOSR), 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,5% glutaminsupplement(Materialetabel)og 100 μM β-mercaptoethanol]. Udskift mediet dagligt i 6 dage24.
- På dag 6 skal mediet udskiftes med endotelcellemedium (EF) medium (human endotelserumfrit medium (hESFM) suppleret med 1% blodpladefattigt plasmabaseret kvægserum, 20 ng/ml bFGF og 10 μM alltrans retinsyre (RA)]. Lad mediet være i 2 dage.
- Fjern EF-mediet, og tilsættes 1 ml dissociationsopløsning pr. brønd. Inkuber ved 37 °C i 35 min.
BEMÆRK: Selv om dette betragtes som en lang inkubationstid i den dissociationsopløsning, der anvendes her, kan iBMECs udholde denne behandling med cellelevedygtighed på over 90 %. - Løsrive cellerne fra brønden ved forsigtigt at pibe cellen suspension og indsamle alle celler i en 15 ml konisk rør.
BEMÆRK: Undgå hård pipettering. Hvis cellerne ikke let løsner, skal der inkuberes yderligere 5 min. - Tilsæt 1 volumen EF-medium i 15 ml konisk at inaktivere Accutase, centrifugeres ved 200 x g i 5 min, fjern medium og erstattes med 1 ml EF-medium (uden bFGF og RA).
- Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer, og juster celletætheden til 14-20 x 106 celler/ml.
BEMÆRK: Celler er nu klar til at blive seedet ind i den nederste kanal af chippen til at danne "blod side".
3. Mikrofabrikation af orgelchippen
- Brug en orgelchip til BBB-chipmodellen og dens produktion som udført tidligere16,18,19. Den høje kanal orgel chip (se Tabel over materialer)er fremstillet af en meget fleksibel polydimethylsiloxan (PDMS) elastomer, der indeholder to overlejret og parallel mikro-skala kanaler adskilt af en fleksibel porøs membran. De øverste og nederste mikrokanalstørrelser er henholdsvis 1 mm x 1 mm og 1,0 mm x 0,2 mm. De to kanaler er adskilt af en 50 μm tyk PDMS-fremstillet fleksibel porøs membran, der indeholder 7 μm diameter porer med 40 μm afstand. Overfladearealet af den porøse membran, der adskiller kanalerne, er 0,171 cm2.
4. Chip forberedelse
- Orgelchips leveres færdigpakket i chipbæreren, hvilket eliminerer behovet for at forstyrre eller forvrænge spånjusteringen under håndteringen. Desuden forbinder chipbæreren sikkert til et bærbart modul ("Pod"), der fungerer som grænsefladen mellem kulturmodulet og chippen.
- Spray emballagen af chips med 70% ethanol og bringe ind i biosafety kabinet (BSC).
- Åbn emballagen og læg orgelchippen i en steril petriskål. Håndter kun chipbæreren ved siderne for at undgå direkte kontakt med chippen.
- Sørg for, at stolen på holderen vender mod højre(Figur 2),og juster dem alle i samme retning, når du bruger flere chips.
- Mærk hver chip på bærefanen (komplet spånforberedelse og arbejdsgang er vist i figur 3).
5. Overfladeaktivering og ECM-belægning
- Forberedelse af overfladeaktiveringsopløsning
- Emuler reagens 1 (ER-1), der leveres i et hætteglas indeholdende 5 mg, er lysfølsomt. Klargør frisk ER-1-opløsning umiddelbart før brug. ER-1 integritet er afgørende for en vellykket forberedelse af chips.
- Sluk lyset i BSC ved håndtering af ER-1.
BEMÆRK: ER-1 er et øjenirriterende og skal håndteres i BSC med passende handsker og øjenbeskyttelse. - Genagerne ER-1 og ER-2 må jævniseres til stuetemperatur (RT) før brug.
- Beskyt opløsningen mod lys ved at pakke et tomt sterilt 15 ml konisk rør med folie.
- I BSC skal du kort trykke på ER-1 hætteglasset for at sætte pulveret i bunden.
- Tilføj 1 ml ER-2 buffer til hætteglasset, og overfør straks indholdet til bunden af det 15 ml indpakkede koniske rør. Rørikke må blandes. Farven på den opløsning, der overføres til det koniske rør, vil være rød.
- Gentag trin 5.1.6 3x. På den sidste runde skal du lægge hætteglasset på og vende det for at indsamle eventuelt resterende pulver fra låget og derefter overføre opløsningen til det koniske rør. dette vil bringe den samlede volumen til 4 ml ER-1 løsning.
- Der tilsættes 6 ml ER-2 opløsning til 4 ml ER-1-opløsningen i det koniske rør på 15 ml til en endelig koncentration på 0,5 mg/ml. ER-1 skal opløses fuldstændigt i ER-2-opløsningen.
- Aktivering af overflade
- Ved hjælp af en P200 pipette og en steril 200 μL filtreret pipettespids, fylder 200 μL ER-1 blanding.
- Læg pipetten i bundindløbet, og tryk 20 μL ER-1-blandingen gennem den nederste kanal, indtil blandingen begynder at strømme ud af den nederste kanals udløb.
- Tilsæt ca. 50 μL ER-1-blanding, og placer den i den øverste kanalindløb. Skub blandingen gennem den øverste kanal, indtil den begynder at flyde ud af den øverste kanal stikkontakt.
- Fjern al overskydende ER-1-blanding fra chippens overflade med en blid aspiration. Sørg for, at ER-1 blandingen kun fjernes fra spånoverfladen og ikke fra kanalerne.
- Kontroller, at kanalerne er fri for luftbobler før ultraviolet (UV) aktivering. Hvis der registreres luftbobler, skal du fjerne boblerne ved at vaske kanalen med ER-1-blanding.
- Placer den åbne skål, der indeholder spånerne, i UV-lysboksen (leveret af Emuler Inc.).
- Indstil kontakten bag på UV-lysboksen til indstillingen "Konsekvent". Tænd for strømmen, og start UV-aktivering. Lad spånerne være under UV-lys i 20 minutter.
BEMÆRK: Undgå, at personalet udsættes for UV-lys. - Fjern ER-1 blandingen fra begge kanaler.
- Vask hver kanal med 200 μL ER-2 opløsning.
- Fjern ER-2 fra begge kanaler.
- Vask hver kanal med 200 μL steril kold Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS).
- Lad kold DPBS inde i kanalerne, indtil du fortsætter til næste trin.
- Ekstracellulær matrix (ECM) forberedelse og belægning
- Forbered ECM-opløsningen ved at kombinere de enkelte ECM-komponenter med koldt DPBS, vand eller andet opløsningsmiddel til de endelige arbejdskoncentrationer. ECM-opløsningen skal tilberedes frisk, hver gang den anvendes.
- Coat både top og bund kanaler af chippen med ECM, med sammensætning som bestemt af den celletype, der skal ses. ECM-blandingen skal holdes på is, indtil den er brugt.
- Brug laminin (50 μg/ml) til at belægge "hjernesiden", og kollagen IV og fibronectin blandes ved et 4:1-forhold (320:80 μg/ml) til at belægge "blodsiden" som beskrevet i afsnit 5.6.
- Forberedelse af ECM aliquots
- Fortyndes 1 mg/ml laminin i koldt DPBS til en endelig koncentration på 50 μg/ml. Aliquot og opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Kollagen IV opløses i 0,1% eddikesyre til en koncentration på 1 mg/ml. Inkuber opløsningen ved 2-8 °C natten over eller ved RT i 1-3 timer eller indtil den er helt opløst.
- Der fremstilles en 1 ml blanding af kollagen IV:fibronectin (320 μL kollagen IV, 80 μL fibronectin, 600 μL sterilt dobbeltdestilleret H2O). Blandingen kan opbevares ved -20 °C.
- Belægning af chips med ECM
- Fuldt aspirere den kolde DPBS fra begge kanaler. Indstil en P200 pipette til at tage op 100 μL kollagen IV: fibronectin opløsning.
- Indfør opløsningen gennem den nederste kanalindløb, indtil der dannes en lille dråbe på stikkontakten. Efterlad en lille dråbe på indløbet efter fjernelse af pipettespidsen.
- Præsenter lamininopløsningen gennem den øverste kanalindløb, indtil der dannes en lille dråbe på stikkontakten. Efterlad en lille dråbe på indløbet efter fjernelse af pipettespidsen.
- Kig nøje på kanalerne for at sikre, at der ikke er bobler til stede. Hvis der er bobler til stede, skal kanalen vaskes med den relevante ECM-opløsning, indtil alle bobler fjernes.
- Gentag trin 5.5.1-5.5.4 for hver chip.
- Tilføj 1,5 ml DPBS til hætten på et 15 ml konisk rør. Placer DPBS hætten i 150 mm kulturskålen med chips for at give ekstra fugtighed og forsegle skålen med parafilm. For de bedste resultater, inkubere chips på 4 °C natten over.
BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan celler ses samme dag som spånaktivering og ECM-belægning, selvom inkubation natten over foretrækkes. Chips kan være klar til såning 4 h efter tilsætning af ECM og inkubering chips på 37 °C.
6. Såning af "hjerne side" kanal og differentiere EZ kugler i blandede neurale kulturer
- Medbring skålen, der indeholder de forberedte spåner, til BSC. Vask forsigtigt begge kanaler med 200 μL NDM.
- Undgå kontakt med havnene, omhyggeligt aspirere overskydende medier dråber fra overfladen af chippen. Ryst forsigtigt celleaffjedring, før du sår hver chip for at sikre en homogen celleaffjedring
- Seeding iINPCs i den øverste kanal til at generere "hjernen side"
- Frø cellerne (1 x 106 celler/ml) i den øverste kanal af chippen. Tilsæt en P200-spids, der indeholder 30-100 μL celler, affjedring til den øverste kanalindløb, og slip forsigtigt spidsen fra pipetten. Tag en tom P200 pipette, tryk stemplet, indsæt i den øverste kanal stikkontakt og forsigtigt trække de enkelte celler suspension gennem chippen.
- Dæk skålen og overfør til mikroskopet for at kontrollere såningtætheden og den homogene fordeling af celler i den øverste kanal. Fjern forsigtigt pipettespidsen fra spånind- og udløbsportene.
- Seedning tæthed bør fremstå som 20% dækning. Hvis såningstætheden er højere eller lavere end forventet eller ujævn, skal du returnere spånerne til BSC, vaske kanalen 2x med 200 μL frisk medium og gentage trin 6.3.1.
- Efter at have bekræftet den korrekte celletæthed skal spånerne straks anbringes i rugemaskinen i 2 timer ved 37 °C efter at have sat hvert parti chips. Vask de celler, der ikke er fastgjort, væk med frisk NDM.
- Opbevar cellerne under statiske forhold ved 37 °C med en daglig NDM-erstatning i mindst 48 timer, før strømmen påbegyndes. iBMECs kan være seedet efter iNPCs har knyttet eller på en efterfølgende dag efter iNPC seeding.
7. Seedning iBMECs i den nederste kanal til at generere "blod side"
- Medbring skålen, der indeholder de forberedte spåner, til BSC. Vask forsigtigt den nederste kanal med 200 μL EF-medium.
- Undgå kontakt med havnene, omhyggeligt aspirere dråber af overskydende EF-medium fra overfladen af chippen, og sørg for at forlade medium i begge kanaler. Ryst forsigtigt celleaffjedringen, før du sår hver chip for at sikre en homogen celleaffjedring.
- Ved hjælp af en P200 pipette skal der tegnes 30-100 μL af iBMEC-celleaffjedringen (14-20 x 106 celler/ml) og placere spidsen i den nederste kanals indløb. Fjern forsigtigt spidsen fra pipetten, så den celleholdige spids i indløbsporten efterlades.
- Tryk stemplet på en P200 pipette med en tom spids, indsæt i den nederste kanal stikkontakt, og træk forsigtigt enkeltcelleaffjedringen gennem den nederste kanal ved langsomt at slippe pipettestemplet.
- Aspirere overskydende celle suspension fra overfladen af chippen. Undgå direkte kontakt med indløbs- og udløbsportne for at sikre, at der ikke indsuges celleaffjedring ud af kanalerne.
- Dæk chippen og overfør den til mikroskopet for at observere såningstætheden. Den nederste kanal bør være fyldt uden observerbare mellemrum mellem cellerne, når den observeres ved 4x eller 10x under et mikroskop (Figur 4).
- Hvis såning tæthed er under 90% dækning eller er ujævnt fordelt, justere celletæthed i overensstemmelse hermed og gentage trin 7.2-7.6, indtil den korrekte tæthed er opnået inden for kanalen. Efter at have bekræftet den korrekte celletæthed (Figur 4) er der frøceller i de resterende spåner. For at fastgøre celler på den porøse membran, som er placeret på toppen af den nederste kanal, skal du vende hver chip og hvile i en chipholder.
- Anbring et lille reservoir (15 ml konisk rørhætte indeholdende steril DPBS) inde i 150 mm skålen for at give fugt til cellerne. Inkuberes ved 37 °C i ca. 3 timer, eller indtil cellerne i den nederste kanal er fastgjort. Når iBMECs har vedhæftet (~ 3 h efter såning), vende chips tilbage til en opretstående position for at tillade celle vedhæftet fil til den nederste del af den nederste kanal.
8. Indledning af flow
- Flow er typisk indledt 48 h efter såning af iBMECs. Denne gang er nødvendig for iBMECs at fastgøre fast til chippen.
- For at opretholde laminar flow gennem chippen, er det vigtigt at afgasog ligevægt temperaturen af mediet. Mediet skal være forvarmet i et vandbad på 37 °C i 1 time.
- Op til 50 ml opvarmet medium kan afgasses ved inkubation under et vakuumdrevet filtreringssystem i 15 min.
- Priming af bærbare moduler
- Desinficere ydersiden af den bærbare modul emballage og bakker med 70% ethanol, tør, og overførsel til BSC. Åbn pakken, og læg modulerne i bakken. Orienter dem med reservoirerne mod bagsiden af bakken.
- Pipette 3 ml pre-equilibrated, varme medier til hver indløb reservoir. Tilføj EF-kulturmediet til indløbsbeholderen på den nederste kanal og NDM til den øverste kanals indløbsreservoir på den øverste kanal (figur 5).
- Pipette 300 μL præ-equilibrated, varme medier til hver udtagbeholder, direkte over hver udløbsport (Figur 5).
- Placer op til seks bærbare moduler på hver bakke. Bring bakker til rugemaskine og skub helt ind i kulturmodulet med bakkehåndtaget vendt udad.
- Vælg og kør cyklussen "Prime" på kulturmodulet. Luk rugemaskinedøren og lad kulturmodulet prime de bærbare moduler (tager ~ 1 min). Priming-cyklussen fuldføres, når statuslinjen hedder "Klar". Tag bakken ud af kulturmodulet, og bring den til BSC.
- Kontroller, at de bærbare moduler blev primet ved at inspicere undersiden af hvert bærbart modul i BSC. Kig efter tilstedeværelsen af små dråber på alle fire porte.
- Hvis et bærbart modul ikke viser dråber, skal du køre prime-cyklussen på disse moduler igen. Hvis der dryppes medier på bakken (dette kan forekomme oftere af udløbsportene), skal du rengøre bakken med 70 % ethanol.
- Tilslutning af chips til bærbare moduler, regulering og indledning af flow
- Vask forsigtigt begge kanaler af hver chip med varme, equilibrated celle-specifikke kulturmedium for at fjerne eventuelle bobler i kanalen og placere små dråber af medier (ifølge medierne i kanalen) på toppen af hver indløb og udløbsport.
- Sæt chips med holdere i de bærbare moduler, og placer op til seks på hver bakke. Sæt bakker ind i kulturmodulet. Programmer de relevante organchipkulturbetingelser (strømningshastighed og stræk) på kulturmodulet.
- Programmerede betingelser vil starte, så snart "Regulate" cyklus er færdig.
BEMÆRK: Strømningshastigheder for hver kanal kan styres uafhængigt og kan indstilles til hastigheder, der spænder fra 0-1.000 μL/h. BBB-chippen dyrkes typisk ved 30 μL/h. Ved flydende medier såsom EF-medier eller ESM ved 30 μL/h og 1000 μL/h er forskydningskræfterne henholdsvis 0,01 dyn/cm2 og 0,33 dyn/cm2. - Kør "Regulate" cyklus, som tager ca 2 h, hvorefter kulturmodulet vil begynde at flyde på de forudindstillede organ chip kultur betingelser.
9. Vurdering af paracellulære permeabilitetsvurdering af blod til hjerne
- NS Er klar plenget med 10 μg/ml dextran-FITC (4 kDa). Denne opløsning vil blive brugt som input til "blod side" kanal.
- Fyld den nederste kanal reservoirer af de bærbare moduler med NDM suppleret med dextran-FITC. Fyld den øverste kanal reservoirer med NDM uden sporstof.
- Gennemfuse begge, de øverste og nederste kanaler med en strømningshastighed på 30 μL/h i mindst 4 timer, indtil der akkumuleres tilstrækkeligt medie til vurdering af fluorescens hos en pladelæser (typisk 100 μL).
- Indsamle medieprøver fra input og output reservoirer af de øverste og nederste kanaler. Beskyt prøverne mod lys.
- NStering fortyndes med 10 μg/ml dextran-FITC 1:1 ved hjælp af NDM uden sporstof til at generere en kalibreringskurve på 10-12 punkter.
- Tag 100 μL af hver prøve, herunder kalibreringskurven, ind i en sort 96 brøndplade og aflæs fluorescens ved hjælp af en pladelæser (485 nm excitation, 530 nm emission).
- Brug de målte værdier til at beregneP-appværdier på følgende måde:
- Tag daglige målinger for at vurdere barriereegenskaberne og bekræfte, at BBB-chippen stadig er funktionel.
10. Immuncytokemi
- Bring chips til en kemisk røg hætte. Ved hjælp af en P200 pipette skal du fastgøre celler ved at perfunderes begge kanaler med 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i DPBS og inkubere i 10 min. på RT.
- Efter fikseringen gennemfusehver kanal med 200 μL DPBS og inkuberi i 5 min. Gentag DPBS vaske 2x.
- Bloker og permeabiliserceller på chippen ved at perfunderes primær blokeringsopløsning (PBS, suppleret med 5% normalt æselserum og 0,1% Triton X-100). Inkuber på RT i 1 time.
- Fortyndes primære antistoffer i primær blokeringsopløsning og inkuber natten over ved 4 °C. BMECs markører er GLUT-1 (1:100 fortynding), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) og VE-cadherin (1:200). Neurale markører er βIII-tubulin (01:1000; Tuj1α), S100β (1:500), nestin (1:1000) og GFAP (1:1000).
- Vask chips 3x med kold DPBS.
- Fortyndes sekundære antistoffer i sekundær blokeringsopløsning (DPBS med 5% normalt æselserum uden Triton-X).
- Gennemfuse den sekundære antistofopløsning gennem begge kanaler. Typisk fortyndes fluorescerende sekundære antistoffer 1:1000. Inkuber i 1 time ved RT beskyttet mod lys.
- Vask chips 3x med DPBS.
- Pletcellekerner ved at perfunderes chip med 100 μL DAPI-opløsning. Inkuber på RT i 5 min.
- Vask chips 3x med DPBS.
- Chippen er klar til billeddannelse ved hjælp af enten et opretstående eller et omvendt fluorescerende mikroskop. PDMS-gennemsigtigheden tillader billeddannelse i den intakte organchip. Forstørrelser over 10x kan kræve lange arbejdsafstand mål på grund af tykkelsen af organchippen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6A,B,C repræsenterer en BBB-chip, der er seedet med EZ-kugler på "hjernesiden" og iBMECs på "blodsiden"- bundlinjen. iBMECs var seedet først og fik lov til at vedhæfte natten over, hvorefter EZ-kugler var seedet. Chips blev derefter dyrket under statiske forhold med daglige medier udskiftning i syv dage. BBB-chippen blev derefter fastgjort ved hjælp af 4% PFA på RT i 10 min og vasket 3x med DPBS. Immuncytokemi blev udført på BBB-chippen ved hjælp af 1) nestin som markør for neurale stamceller, 2) S100β eller GFAP som markører for astrocytter, og 3) βIII-tubulin som markør for neuroner. GLUT-1 og Pecam-1 blev brugt som markør for BMECs. Imaging blev udført på 20x ved hjælp af en konfokal mikroskop og billeder blev behandlet ved hjælp af Fiji for ImageJ software.
Figur 6D repræsenterer en paracellulær permeabilitetsanalyse, der blev udført på organchips befolket med iBMECs og EZ-sfærer, iBMECs alene (uden EZ-sfærer) eller EZ-sfærer alene (uden iBMECs). Efter en "Regulate"-cyklus blev der tilsat et 4 kDa Dextran-FITC-sporstof til reservoiret på "blodsiden" til en endelig koncentration på 10 μg/ml, og spånerne blev gennemsmeltet ved 30 μL/h natten over. Dernæst blev medier indsamlet fra indløbog udløbsreservoirer på både top- og bundkanalerne. 100 μL af hver prøve blev indsamlet og undersøgt for fluorescens ved hjælp af en pladelæser.
Det er vigtigt, at der blev brugt en 1:1-kalibreringskurve til at omdanne fluorescensværdier til koncentrationsværdier for Dextran FITC. Værdierne blev derefter brugt til at beregne permeabilitet(P-app). Disse resultater viser, at iBMECs danner funktionelle barriereegenskaber, som strammes yderligere, når iBMECs er co-kulturrede med EZ-sfærer. Chips dyrket med EZ-kugler kun, undlader at danne en barriere. En lignende fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge transporten af ethvert molekyle på tværs af BBB-chippen, afhængigt af en tilgængelig målemetode (f.eks. fluorescens, ELISA eller massespektrofotometri).
Figur 1: Skemaaf den iPSC-baserede BBB-chip. Før såning på chippen, iPSCs er differentieret i kultur plader i (i) EZ-kugler (neurale stamceller, iNPC'er), som dyrkes i suspension som kugler, og i (ii) hjernen mikrovaskulære endotelceller (iBMECs). EZ-kugler er adskilt i enkelte celler, seedet på den øverste kanal af organchip, hvor de yderligere differentiere i blandede neurale kulturer til at danne "hjernen side". iBMECs er seedet i den nederste kanal af organchippen til at danne et blodkar-lignende struktur på "blod side". Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk af den øverste visning af chippen i chipbæreren, med mærkede porte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Rutediagram over den iPSC-baserede BBB-chipforberedelse og arbejdsgang. Præ-differentiering af både neurale og endotelceller fra iPSCs er påkrævet før indledningen af arbejdsgangen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Seedning af iBMECs i den nederste kanal. Brightfield billeder af iBMECs seedet i den nederste kanal (A) umiddelbart efter såning eller (B) 24 h post-seeding, efter celler har fastgjort. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skematisk af den tilsluttede chip og bærbare modul med mærket indløb og udløb medier reservoirer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Repræsentative resultater. Immuncytokemi på den iPSC-baserede BBB-chip 7 dage efter såning. EZ-kugler differentieret i en blandet neuralcellepopulation i den øverste "hjerneside" kanal, herunder (A) S100β + (grøn) astrocytter, Nestin + (rød) neurale stamcelleceller samt (B) GFAP + (rød) astrocytter og βIII-tubulin + (rød) neuroner. Skalastænger = 200 μm. (C) iBMECs, der er seedet i bunden af "blodsiden"-kanalen, udtrykte GLUT-1 og (grøn) PECAM-1 (CD31, red). Skalabjælke = 200 μm. (D) Evaluering af BBB-spånpermeabilitet blev udført ved at tilføje dextran-FITC (4 kDa) i reservoiret på den nederste kanal. Resultaterne viser, at orgelchips, der er seedet med iBMECs og EZ-sfærer, udviser en stram barriere sammenlignet med orgelchips, der er seedet med iBMECs alene (*p < 0,05). Organchips, der er seedet med EZ-kugler alene, viser ingen barriereegenskaber (***p < 0,001; envejs ANOVA med Tukey's test med flere sammenligninger). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinationen af organ-on-chip-teknologi og iPSC-afledte celler i NVU lover nøjagtig modellering af den menneskelige BBB. Her giver vi en detaljeret protokol for enkel og robust anvendelse af den nyligt offentliggjorte iPSC-baserede BBB chip16. En oversigt over og timing af seeding paradigme er vist i figur 3. At opnå og vedligeholde barrierefunktioner, der er egnede til BBB-modellering, er det afgørende at generere et homogent iBMEC-monolag og bevare dets integritet. Det første skridt i retning af dannelsen af et funktionelt monolag omfatter kemisk aktivering af den ikke-polære PDMS overflade, der tillader fastgørelse af ECM-proteiner. Overfladeaktiveringsreagenserne nedbrydes hurtigt ved rekonstitution, hvilket i sidste ende kan resultere i suboptimal fastgørelse af celler. Det er derfor vigtigt at holde reagenserne friske og beskyttet mod lys gennem hele processen.
Under UV-aktivering (punkt 5.2) skal reagenserne fordeles jævnt inden for hver kanal for at opnå ensartet ECM-belægning og homogen cellefastgørelse. ECM-sammensætninger og koncentrationer, der er fastsat i denne protokol, blev optimeret til de specifikke typer celler(dvs. iBMECs og EZ-sfære-afledte neurale stamceller). Ændring af cellesammensætning er muligt, men kan kræve differentierede ECM-betingelser, hvilket vil kræve optimering. Efter ECM belægning, er det afgørende for frø iBMECs korrekt. Høj cellesåningtæthed (>14 x 106 celler/ml) er afgørende for at opnå et komplet monolag. Hvis det ikke lykkes at opnå fuld cellesammenløb, anbefales det yderligere at øge tætheden af cellesuspensionen op til 20 x 106 celler/ml under såning.
Laminar flow blev tidligere foreslået at forbedre iBMEC modning15 og er uundværlig for at opfylde de fordele, som den mikrofluidiske platform. Men mikrobobler, der strømmer gennem kanalerne af chippen kan fysisk stress og løsrive hjemmehørende celler, hvilket kan føre til ødelæggelse af BBB chip integritet. For at undgå mikrobobledannelse under laminarflow er det afgørende at ligevægte mediet, før perfusion påbegyndes. Ligevægt kræver forvarmning og afgasning af mediet før brug.
Genereringen af personlige chips er muliggjort ved hjælp af både humane iPSC-afledte iBMECs og iNPCs. Mens differentieringen af iBMECs er kort og ret simpel24,22, differentiering af iPSCs i neurale celler21,25 er mere udfordrende. Men, de neurale celler, der bor i "hjernen side" af chippen kan erstattes af enhver neuralcelletype, såsom primære neurale celler eller iPSC-afledte motoriske neuroner16. På samme måde som "bona fide" endotelceller, iBMECs vise plasticitet i genekspression som reaktion på forskellige neurale co-kulturer. Denne fleksibilitet kan således resultere i fremtidig udvikling af forskellige NVM'er på chippen. Yderligere fleksibilitet i systemet kan opnås ved at justere celle såning timing og orden. iBMECs kan ses før eller efter neurale celler, hvilket gør det muligt at frø iBMECs umiddelbart efter såning og fastgørelse af neurale celler, eller efter EZ-kugler har differentieret i mere modne neurale kulturer i chip miljøet. Dette er af særlig betydning, i betragtning af den umodne karakter af iPSC-afledte neurale celler. I betragtning af at EZ-kugler er tidlige neurale sår, længere differentiering perioder kan også resultere i en øget procentdel af astrocytter og neuroner.
En komponent, der mangler i protokollen er perivaskulære pericytter, som giver en afgørende komponent i den fysiologiske NVU. Nylige fremskridt inden for iPSCs differentiering i pericytlignende celler26,27 vil gøre det muligt at indføre denne ekstra celletype, hvilket giver en forbedret kopi af BBB og samtidig bevare sin personlige karakter.
IBMECs har tidligere vist sig at demonstrere forskellige egenskaber , der er afgørende for BBB modellering, herunder udtryk for cellulære markører, etablering af TEER og funktionel aktivitet af efflux pumper28,24,5. Molekylære analyser har imidlertid vist, at disse celler også udtrykker flere epitelmarkører15. Fremskridt inden for iBMEC-generation med forbedret funktion og endotelmarkørudtryk er for nylig blevet beskrevet29,30. Efter paradigme præsenteret her, kan disse potentielt forbedrede celler nemt indarbejdes i BBB chip model til fremtidige anvendelser. Den fleksible, men robuste platform, der er beskrevet her, kan fremme både sygdomsmodellering og udvikling og vurdering af nye CNS-lægemidler.
Mens denne protokol bygger på et specifikt kommercielt tilgængeligt produkt, tilbyder yderligere kommercielle virksomheder forskellige mikrofysiologiske platforme, som kan give alternative fordele31. Desuden er protokoller for "in house" fremstilling af mikrofluidic Organ chips også tilgængelige32 og kan tilbyde mere modularitet, herunder integration af TEER elektroder17, som mangler fra den platform, der anvendes her.
Organ-on-chips blev indført som en alternativ tilgang til at forbedre den fysiologiske kontekst af de nuværende cellekulturer33. Men anvendelsen af denne teknologi kræver specialiserede tekniske færdigheder, som ofte mangler i biologisk orienterede laboratorier. En kommercielt tilgængelig chip platform, som den, der anvendes her, giver mindre modularitet og øget robusthed og reproducerbarhed, som kan anvendes af en bredere vifte af brugere. Endvidere er anvendelsen af laminarflow på en mikrofluidisk chip afhængig af påføring af sprøjte- eller peristaltiske pumper, som indfører et andet kompleksitetsniveau. Denne hindring er nu lettere at overvinde med anvendelsen af kulturmodulet, hvilket letter samtidig perfusion af flere chips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Cedars-Sinai ejer en minoritetsaktieinteresse i Emuler, det selskab, der producerer undersøgelsens mikrofluidiske orgelchips. En officer i Cedars-Sinai sidder også i Emulerings bestyrelse. Emulere gav ingen økonomisk støtte til denne forskning. Cedars-Sinai og Emuler emulere har patenter indgivet i forbindelse med dette arbejde.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Soshana Svendsen for kritisk redigering. Dette arbejde blev støttet af Israel Science Foundation grant 1621/18, Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST), Israel 3-15647, California Institute for Regenerativ Medicine grant ID DISC1-08800, Sherman Family Foundation, NIH-NINDS tilskud 1UG3NS105703, og ALS Association tilskud 18-SI-389. AH blev finansieret af Wallenberg Foundation (tilskudnummer 2015.0178).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
References
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
- Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
- El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
- Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
- Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
- Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
- Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
- Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
- Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
- Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
- Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
- Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
- Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
- Huh, D., et al.
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
