Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generatie van een menselijke iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60925
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5,6, 4, 1,2,3
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

Summary

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een meercellige neurovasculaire eenheid die hersenhomeostase strak regugugaat. Door menselijke iPSCs en organ-on-chip technologieën te combineren, hebben we een gepersonaliseerde BBB-chip gegenereerd, geschikt voor ziektemodellering en CNS-voorspellingen voor medicijndoordring. Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de productie en werking van de BBB-chip.

Abstract

De bloedhersenbarrière (BBB) wordt gevormd door neurovasculaire eenheden (ASO's) die het centrale zenuwstelsel (CNS) beschermen tegen een reeks factoren in het bloed die de delicate hersenfunctie kunnen verstoren. Als zodanig vormt de BBB een groot obstakel voor de levering van therapeutica aan het CNS. Accumulerend bewijs suggereert dat de BBB een belangrijke rol speelt bij het ontstaan en de progressie van neurologische ziekten. Zo is er een enorme behoefte aan een BBB-model dat de penetratie van CNS-gerichte geneesmiddelen kan voorspellen en de rol van de BBB in gezondheid en ziekte kan verduidelijken.

We hebben onlangs organ-on-chip en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologieën gecombineerd om een BBB-chip te genereren die volledig gepersonaliseerd is voor mensen. Dit nieuwe platform toont cellulaire, moleculaire en fysiologische eigenschappen die geschikt zijn voor de voorspelling van drugs- en molecuultransport over de menselijke BBB. Bovendien hebben we met behulp van patiëntspecifieke BBB-chips modellen van neurologische ziekte gegenereerd en het potentieel voor gepersonaliseerde voorspellende geneeskundetoepassingen aangetoond. Hier is een gedetailleerd protocol dat aantoont hoe iPSC-afgeleide BBB-chips kunnen worden gegenereerd, te beginnen met differentiatie van iPSC-afgeleide microvasculaire endotheelcellen (iBC's) en resulterend in gemengde neurale culturen die neurale voorlopers bevatten, gedifferentieerde neuronen en astrocyten. Ook beschreven is een procedure voor het zaaien van cellen in de orgaanchip en het kweken van de BBB-chips onder gecontroleerde laminaire stroom. Ten slotte worden gedetailleerde beschrijvingen van BBB-chipanalyses verstrekt, waaronder paracellulaire doorlaatbaarheidstesten voor de beoordeling van de doorlaatbaarheid van geneesmiddelen en moleculen en immunocytochemische methoden voor het bepalen van de samenstelling van celtypen binnen de chip.

Introduction

De BBB is een zeer selectieve barrière die het CNS scheidt van het circulerende bloed. Het beschermt kritieke hersenfuncties tegen potentieel storende stoffen, factoren en xenobiotica, terwijl ook de instroom van voedingsstoffen en andere metabolieten die nodig zijn om de hersenen homeostase te behouden1. De BBB is een meercellige NVU waarin pericytes, astrocyte endfeet en neuronale processen rechtstreeks contact opnemen met hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMECs). Deze interacties stellen BMECs in staat om gespecialiseerde barrière-eigenschappen te vormen die worden ondersteund door strakke en aanhangende knooppunten2,3. De vorming van deze barrière beperkt de paracellulaire passage van moleculen, maar het bevat gepolariseerde transporters om actief moleculen in het CNS of terug in het bloed te transporteren1. Als gevolg van deze unieke barrière eigenschappen, de BBB vormt een groot obstakel voor de levering van biofarmaceutica in de hersenen, en er wordt geschat dat minder dan 5% van de FDA-goedgekeurde kleine moleculen kan de CNS4te bereiken.

Diermodellen zijn op grote schaal gebruikt om BBB penetrance en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij BBB ontwikkeling5te bestuderen. Terwijl diermodellen getrouw de complexe meercellige in vivo omgeving vertegenwoordigen, sluiten verschillen in expressie en activiteit van BBB-transporters en substraatspecificiteit tussen soorten vaak een nauwkeurige extrapolatie van dierlijke gegevens naar de mens uit6. Zo zijn op mensen gebaseerde modellen van cruciaal belang om de menselijke BBB te bestuderen en voor gebruik bij de ontwikkeling van geneesmiddelen die zijn ontworpen om het CNS te targeten. Deze behoefte wordt nog duidelijker met de toenemende dominantie van biologische, mensspecifieke geneesmiddelen op het gebied van farmaceutische ontwikkeling. Accumulerend bewijs suggereert dat een gecompromitteerde BBB wordt geassocieerd met een aantal ernstige CNS-aandoeningen, waaronder hersentumoren en neurologische aandoeningen7,8,9. Menselijke modellen getrouw als gevolg van deze ziekten hebben het potentieel om zowel 1) nieuwe trajecten die kunnen worden gericht voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te identificeren en 2) voorspellen CNS penetrantie, waardoor de tijd en middelen in preklinische studies en eventueel afnemende percentage mislukkingen in klinische studies.

In vitro modellen zijn op grote schaal geïmplementeerd om interacties tussen BMECs en andere cellen van de NVU te bestuderen en schermen uit te voeren voor potentiële BBB-doorlatende geneesmiddelen10. Om belangrijke aspecten van de menselijke BBB na te bootsen, moeten in vitro modellen fysiologisch relevante eigenschappen (d.w.z. lage paracellulaire permeabiliteit en fysiologisch relevante transendotheliale elektrische weerstand [TEER] over de endothelialmonolayer) weergeven. Bovendien moet het moleculaire profiel van een in vitro systeem de expressie van representatieve functionele transportsystemen omvatten. Typisch, in vitro modellen zijn samengesteld uit endotheliale cellen die co-gekweekt op een semipermeabel membraan met combinaties van andere NVU cellen om BBB eigenschappen te verbeteren11. Deze aanpak maakt een eenvoudige en relatief snelle beoordeling van barrièrefunctionaliteit en molecuuldoorlaatbaarheid mogelijk. Dergelijke op cellen gebaseerde BBB-modellen kunnen worden vastgesteld met dierlijke of menselijke celbronnen, waaronder cellen geïsoleerd van chirurgische excisions of vereeuwigde BMEC-lijnen.

Onlangs werden protocollen om menselijke pluripotente cellen te onderscheiden in BMECs geïntroduceerd als een aantrekkelijke bron voor in vitro menselijke BBB-modellen12,13. Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide BMECs (iBMECs) zijn zeer schaalbaar, tonen cruciale morfologische en functionele kenmerken van de menselijke BBB aan en dragen de genetica van de patiënt. In de cultuur vormen iBMECs een monolayer die strakke verbindingsmarkeringen en displays uitdrukt in vivo-achtige strakke knooppuntcomplexen. Deze cellen drukken ook BBB-markers uit, waaronder de BBB glucosetransporter, glucosetransporter 1 (GLUT1). Belangrijk is, en in tegenstelling tot andere alternatieve celbronnen voor menselijke BMECs, iBMECs verwerven barrière eigenschappen met waarden zo hoog als die gemeten in vivo14, polariseren langs de basolaterale as, en uitdrukken functionele efflux pompen. Bovendien is het gebruik van iPSCs van verschillende onderwerpen beide 1) verwelkomt de mogelijkheid om aspecten van de BBB te testen in een gepersonaliseerde geneeskunde manier en 2) biedt een flexibele bron voor het genereren van extra celtypes van de NVU. Het genereren van deze cellen uit een isogene celbron om gepersonaliseerde BBB-chips te maken, zou ook helpen bij het begrijpen van inter individuele verschillen in medicijnreacties, wat een belangrijke oorzaak is voor resistentie of gecompromitteerde respons op behandeling die in klinische studies wordt waargenomen.

Het gebruik van iBMECs als monolagen in een schaal of op een semi doorlaatbare transwell insert is een krachtige aanpak voor BBB modellering. Deze systemen zijn meestal robuust, reproduceerbaar en kosteneffectief. Daarnaast zijn functionele analyses zoals TEER en doorlaatbaarheid relatief eenvoudig uit te voeren. Echter, tweedimensionale (2D) systemen niet aan de 3D-aard van in vivo weefsel recapituleren, en ze missen de fysiologische afschuif stress krachten die door circulerende bloed en bloedcellen. Dit beperkt het vermogen van het vasculaire endotheel in deze modellen om intrinsieke BBB-eigenschappen en -functies te ontwikkelen en te behouden.

Micro-engineered systemen bekleed door levende cellen zijn geïmplementeerd om verschillende orgaanfunctionaliteiten te modelleren in een concept genaamd organ-on-chips. Door in vivo-achtige meercellige architectuur, weefsel-weefselinterfaces, fysischchemische microomgevingen en vasculaire perfusie opnieuw te creëren, genereren deze micro-engineered platforms niveaus van weefsel- en orgaanfunctionaliteit die niet mogelijk zijn met conventionele 2D-kweeksystemen. Ze maken ook hoge resolutie, real-time beeldvorming en analyse van biochemische, genetische en metabole profielen mogelijk die vergelijkbaar zijn met levende cellen in de in vivo weefsel- en orgaancontext. Echter, een bijzondere uitdaging van de organ-on-chip is dat het ontwerp, fabricage, en de toepassing van deze micro-engineered chips vereist gespecialiseerde technische expertise die meestal ontbreekt in biologisch georiënteerde academische laboratoria.

We hebben onlangs iPSC en organ-on-chip technologieën gecombineerd om een gepersonaliseerd BBB chip model15,16te genereren. Om de beschreven technologische uitdagingen het hoofd te bieden, wordt de commercieel beschikbare Chip-S1 gebruikt samen met de cultuurmodule, een instrument dat is ontworpen om het onderhoud van de chips op een eenvoudige en robuuste manier te automatiseren (Emulate Inc.). De BBB-chip reconstrueert interacties tussen neurale en endotheelcellen en bereikt fysiologisch relevante TEER-waarden, die worden gemeten door op maat gemaakte orgaanchips met geïntegreerde gouden elektroden17. Bovendien vertoont de BBB-chip een lage paracellulaire permeabiliteit, reageert hij op ontstekingssignalen op orgaanniveau, drukt actieve efflux-pompen uit en vertoont het voorspellend transport van oplosbare biomarkers en biofarmaceutica. Met name BBB-chips gegenereerd van verschillende individuen vangt de verwachte functionele verschillen tussen gezonde individuen en patiënten met neurologische aandoeningen15.

Het onderstaande protocol beschrijft een betrouwbare, efficiënte en reproduceerbare methode voor de generatie van menselijke iPSC-gebaseerde BBB-chips onder dynamische stroomomstandigheden. Er wordt richtlijnen gegeven over het type tests en eindpuntanalyses die direct in de BBB-chip of van bemonsteringseffluent kunnen worden uitgevoerd. Zo toont het protocol het spectrum van technieken die kunnen worden toegepast voor de evaluatie van biologische en functionele eigenschappen en reacties in een voor de mens relevant model.

Een korte beschrijving van de iPSC-gebaseerde BBB chip is hier aanwezig. Menselijke iPSCs worden in eerste instantie gedifferentieerd en gepropageerd in weefselkweekkolven als vrij zwevende aggregaten van neurale voorlopers, ez-bollen genoemd. Het bovenste kanaal van de Chip-S116,18,19 is gezaaid met gescheiden EZ-bollen die de "hersenkant" van de chip vormen, omdat cellen zich onderscheiden over 7 dagen in een gemengde cultuur van neurale voorlopercellen (iNPC's), iAstrocyten en iNeurons. Menselijke iPSC's worden ook gedifferentieerd in weefselkweekplaten in iBMECs. Het onderste kanaal van de chip is gezaaid met iBMECs om de "bloedzijde" te vormen als ze zich ontwikkelen tot een endotheelbuis(figuur 1). De poreuze extracellulaire matrix (ECM)-gecoate membraan dat de boven-en onderkant kanalen scheidt 1) maakt de vorming van cel-cel-cel interacties tussen kanalen en 2) kan de gebruiker permeability testen en beeldcellen draaien in beide kanalen met behulp van een conventionele lichtmicroscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generatie van iPSC-afgeleide neurale voorlopercellen (iNPC's)

  1. Produceer EZ-bollen uit iPSC-kolonies zoals hieronder beschreven en zoals eerder gepubliceerd20,21,22.
    1. Cultuur iPSC kolonies aan samenvloeiing op keldermembraan matrijs 6 goedplaten (0.5 mg/plaat) in mTESR1 of andere commerciële media (zie Lijst van Materialen).
    2. IPSC-medium verwijderen en vervangen door 2 mL EZ-bolmedium [ESM; DMEM:F12 7:3 aangevuld met 100 ng/mL basis fibroblast groeifactor (bFGF), 100 ng/mL epidermale groeifactor, 5 μg/mL heparine en 2% B27 supplement].
    3. Schraap de bodem van elke confluentgoed met de achterkant van een steriele 1000 μL pipetttip of celschraper.
    4. Verzamel alle cellen en plaats in een ultra-lage bevestiging T25 kolf om de spontane vorming van vrij zwevende bollen mogelijk te maken. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
    5. Voer de bollen om de 2-3 dagen wanneer het medium geel wordt door de helft van het medium te vervangen door verse ESM. Hierdoor kunnen bollen in geconditioneerd medium blijven, wat zeer belangrijk is voor hun groei en onderhoud.
      1. Leun de kolf op een buizenrek en laat de bollen 1-2 min met de zwaartekracht naar de hoek van de kolf gaan.
      2. Eenmaal geregeld, aanzuigen de helft van de supernatant met een 5 mL of 10 mL serologische pipet en vervangen door verse, voorverwarmde ESM.
    6. Passage EZ-bollen wekelijks door bollen te hakken tot 200 μm diameters zoals eerder beschreven23,20,21. EZ-bollen kunnen worden onderhouden voor maximaal 25 passages en zijn ideaal bij gebruik tussen passages 8–25.
  2. Bereid eencellige suspensie van iNPC's voor:
    1. Om neurale differentiatie te induceren, distantieer je EZ-bol in enkele cellen.
    2. Verzamel bollen 3-4 dagen na het hakken van een T75-kolf en breng over in een conische conische van 15 mL, laat het dan 2 minuten staan of totdat alle bollen onderaan zijn neergestreken.
    3. Verwijder ESM langzaam met een pipet van 5 mL zonder de vaste bollen te verstoren. Voeg 1 mL dissociatieoplossing toe (zie Materiaaltabel)en broed gedurende 10 min bij 37 °C.
    4. Wervel de dissociatieoplossing en bollen na 5 min incubatie om ervoor te zorgen dat alle vaste bollen worden behandeld.
    5. Verwijder langzaam de dissociatieoplossing. Voeg 1 mL neuraal differentiatiemedium [NDM; DMEM: F12 met 2% B27 min vitamine A, 1% N2 supplement, en menselijke hersenen afgeleide neurotrofische factor (hBDNF, 20 ng/mL)].
    6. Triturate de bollen in enkele cellen door ppetteren met behulp van een 1 mL pipet gevolgd door 200 μL pipet, totdat alle bollen zijn gescheiden. Vermijd bellenvorming tijdens de trituratieprocedure.
    7. Tel gescheiden cellen met behulp van een hemocytometer en verdun cellen tot een uiteindelijke dichtheid van 1 x 106 cellen/mL. Het is mogelijk om de dichtheid te wijzigen, afhankelijk van de toepassing.
      OPMERKING: Hogere dichtheden (tot 6 x 106 cellen/mL) worden aanbevolen voor culturen op korte termijn tot 3 dagen, en lagere dichtheden worden aanbevolen voor toepassingen op lange termijn van maximaal 3 weken.
      OPMERKING: Cellen zijn nu klaar om zaad in het bovenste kanaal van de chip om de "hersenen kant" te vormen.

2. Differentiatie van iPSC's in iBMECs

  1. Passage iPSCs uit een enkele confluent goed van een 6 goed plaat op een 1:6 verhouding in een 6 goed kelder membraan matrix-gecoate plaat. Laat cellen zich 24 uur lang hechten. Verander dagelijks het iPSC-medium.
  2. Tel cellen dagelijks met behulp van een hemocytometer.
  3. Wanneer cellen een dichtheid van 1,5–3,0 x 105 cellen/put bereiken, vervangt u het iPSC-medium met 3 mL ongeconditioneerd medium zonder bFGF [DMEM:F12 1:1, met 10% knock-out serumvervanging (KOSR), 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,5% glutaminesupplement (Tabel met materialen) en 100 μ βM-mercaptoethanol]. Vervang medium dagelijks gedurende 6 dagen24.
  4. Vervang op dag 6 medium met endotheliale cel (EC) medium [human endothelial serum free medium (hESFM) aangevuld met 1% bloedplaatjesarm plasma-afgeleid runderserum, 20 ng/mL bFGF en 10 μM all-trans retinoïnezuur (RA)]. Laat medium voor 2 dagen.
  5. Verwijder EC medium en voeg 1 mL dissociatie oplossing per put. Incubeer bij 37 °C gedurende 35 min.
    OPMERKING: Hoewel dit wordt beschouwd als een lange incubatietijd in de hier gebruikte dissociatieoplossing, kunnen iROCCS's deze behandeling met cellevensvatbaarheid boven de 90% doorstaan.
  6. Maak de cellen los van de put door de celvering voorzichtig te beluchten en alle cellen in een conische buis van 15 mL te verzamelen.
    LET OP: Vermijd harde pipetters. Als cellen niet gemakkelijk loskomen, uitbroeden voor extra 5 min.
  7. Voeg 1 volume EG-medium toe aan de conische 15 mL om Accutase te inactiveren, centrifugeer en 200 x g voor 5 min, verwijder medium en vervang deze door 1 mL EC-medium (zonder bFGF en RA).
  8. Tel cellen met behulp van een hemocytometer en pas de celdichtheid aan op 14-20 x 106 cellen/mL.
    OPMERKING: Cellen zijn nu klaar om te worden gezaaid in het onderste kanaal van de chip om de "bloedkant" te vormen.

3. Microfabricage van de orgaanchip

  1. Gebruik een organchip voor het BBB-chipmodel en de productie ervan zoals eerder gedaan16,18,19. De hoge kanaalorgaanchip (zie Tabel met materialen)is vervaardigd uit een zeer flexibel polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer dat twee bovenliggende en parallelle microschaalkanalen bevat die worden gescheiden door een flexibel poreus membraan. De microkanaalmaten van de boven- en onderkant zijn respectievelijk 1 mm x 1 mm en 1,0 mm x 0,2 mm. De twee kanalen worden gescheiden door een 50 μm dik PDMS-gemaakt flexibel poreus membraan, met poriën met een diameter van 7 μm met een afstand van 40 μm. Het oppervlak van het poreuze membraan dat de kanalen scheidt is 0,171 cm2.

4. Chipvoorbereiding

  1. Orgaanchips worden voorverpakt geleverd in de chipdrager, waardoor de uitlijning van de chip tijdens het hanteren niet hoeft te worden verstoord of vervormd. Bovendien maakt de chipcarrier veilig verbinding met een draagbare module ("Pod") die fungeert als interface tussen de cultuurmodule en de chip.
    1. Spuit de verpakking van de chips met 70% ethanol en breng in de biosafety cabinet (BSC).
    2. Open de verpakking en leg de orgelchip in een steriele petrischaal. Behandel de chipdrager alleen aan de zijkanten om direct contact met de chip te voorkomen.
    3. Zorg ervoor dat het tabblad van de vervoerder naar rechts wordt gericht(figuur 2)en dat bij het gebruik van meerdere spaanders ze allemaal in dezelfde richting wordt uitgelijnd.
    4. Label elke chip op het tabblad drager (volledige voorbereiding en workflow van de chip wordt weergegeven in figuur 3).

5. Oppervlakteactivering en ECM-coating

  1. Voorbereiding van oppervlakteactiveringsoplossing
    1. Emuleren reagens 1 (ER-1), voorzien in een flacon met 5 mg, is lichtgevoelig. Bereid de verse ER-1 oplossing voor direct voor gebruik. ER-1 integriteit is cruciaal bij een succesvolle voorbereiding van de chips.
    2. Schakel het licht in de BSC uit bij het hanteren van ER-1.
      OPMERKING: ER-1 is een irriterend oog en moet worden behandeld in de BSC met de juiste handschoenen en oogbescherming.
    3. Laat de ER-1- en ER-2-reagentia voor gebruik op kamertemperatuur (RT) afmeten.
    4. Bescherm de oplossing tegen licht door een lege steriele conische buis van 15 mL met folie te verpakken.
    5. In de BSC, kort tik op de ER-1 flacon om het poeder te regelen op de bodem.
    6. Voeg 1 mL ER-2 buffer toe aan de flacon en breng de inhoud onmiddellijk over naar de bodem van de 15 mL verpakte conische buis. Niet pipetteeren om te mengen. De kleur van de oplossing overgebracht naar de conische buis zal rood zijn.
    7. Herhaal stap 5.1.6 3x. Bij de laatste ronde, dop de ER-1 flacon en omkeren om eventuele resterende poeder te verzamelen uit het deksel, dan de oplossing over te brengen naar de conische buis; dit brengt het totale volume op 4 mL van ER-1 oplossing.
    8. Voeg 6 mL ER-2 oplossing toe aan de 4 mL ER-1 oplossing in de 15 mL conische buis tot een eindconcentratie van 0,5 mg/mL. ER-1 moet volledig worden opgelost binnen de ER-2-oplossing.
  2. Oppervlakteactivering
    1. Gebruik makend van een P200 pipet en een steriele 200 μL gefilterde pipettip, neem 200 μL ER-1 mengsel in.
    2. Plaats de pipet in de onderste inlaat en duw 20 μL ER-1 mengsel door het onderste kanaal totdat het mengsel begint te stromen uit het onderste kanaal uitlaat.
    3. Voeg ongeveer 50 μL ER-1 mengsel toe en plaats het in de bovenste kanaalinlaat. Duw het mengsel door het bovenste kanaal totdat het begint te stromen uit het bovenste kanaal uitlaat.
    4. Verwijder alle overtollige ER-1 mengsel van het oppervlak van de chip door zachte aspiratie. Zorg ervoor dat het ER-1 mengsel alleen van het chipoppervlak wordt verwijderd en niet van de kanalen.
    5. Controleer of de kanalen vrij zijn van luchtbellen voor ultraviolette (UV) activering. Als luchtbellen worden gedetecteerd, verwijder bellen door het kanaal te wassen met ER-1 mengsel.
    6. Plaats de open schotel met de chips in de UV-lichtbak (geleverd door Emulate Inc.).
    7. Stel de schakelaar aan de achterkant van de UV-lichtbak in op de instelling "Consistent". Schakel de stroom in en start uv-activering. Laat de chips 20 min onder UV-licht staan.
      LET OP: Vermijd blootstelling van personeel aan UV-licht.
    8. Verwijder het ER-1 mengsel uit beide kanalen.
    9. Was elk kanaal met 200 μL ER-2-oplossing.
    10. Verwijder ER-2 uit beide kanalen.
    11. Was elk kanaal met 200 μL steriele koude Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
    12. Laat koude DPBS binnen de kanalen tot de volgende stap.
  3. Extracellulaire matrix (ECM) voorbereiding en coating
    1. Bereid de ECM-oplossing voor door de afzonderlijke ECM-componenten te combineren met koud DPBS, water of ander oplosmiddel tot de uiteindelijke werkconcentraties. De ECM-oplossing moet elke keer dat deze wordt gebruikt, vers worden bereid.
    2. Bestrijk zowel de boven- als onderkant kanalen van de chip met ECM, met samenstelling zoals bepaald door het celtype te worden gezaaid. Het ECM-mengsel moet tot het gebruik op ijs worden gehouden.
    3. Gebruik lamine (50 μg/mL) om de "hersenzijde" te coaten, en collageen IV en fibronectine gemengd bij een verhouding van 4:1 (320:80 μg/mL) om de "bloedzijde" te coaten zoals beschreven in punt 5.6.
  4. Voorbereiding van ECM aliquots
    1. Verdun 1 mg/mL laminine in koude DPBS tot een eindconcentratie van 50 μg/mL. Aliquot en opslaan bij -20 °C tot gebruik.
    2. Los collageen IV op in 0,1% azijnzuur tot een concentratie van 1 mg/mL. Incubeer de oplossing bij 2-8 °C 's nachts of bij RT gedurende 1-3 uur of tot deze volledig is opgelost.
    3. Bereid een mengsel van 1 mL collageen IV:fibronectine (320 μL collageen IV, 80 μL fibronectine, 600 μL steriele dubbel gedistilleerde H2O). Het mengsel kan worden opgeslagen bij -20 °C.
  5. Coating van de chips met ECM
    1. Volledig aanzuigen van de koude DPBS van beide kanalen. Stel een P200 pipet in om 100 μL collageen IV:fibronectine oplossing in te nemen.
    2. Introduceer de oplossing via de onderste kanaalinlaat totdat er een kleine druppel op het stopcontact ontstaat. Laat een kleine druppel op de inlaat na het verwijderen van de pipet tip.
    3. Introduceer de lamininoplossing via de bovenste kanaalinlaat totdat er een kleine druppel op de uitlaat ontstaat. Laat een kleine druppel op de inlaat na het verwijderen van de pipet tip.
    4. Kijk goed naar de kanalen om ervoor te zorgen dat er geen bubbels aanwezig zijn. Als er bellen aanwezig zijn, was het kanaal met de juiste ECM-oplossing totdat alle bellen zijn verwijderd.
    5. Herhaal stap 5.5.1–5.5.4 voor elke chip.
    6. Voeg 1,5 mL DPBS toe aan de dop van een conische buis van 15 mL. Plaats de DPBS-dop in de 150 mm kweekschaal met de spanen om extra vochtigheid te bieden en sluit de schotel af met parafilm. Voor de beste resultaten, incubeer de chips op 4 °C 's nachts.
      OPMERKING: Indien gewenst kunnen cellen dezelfde dag worden ingezaaid als spaanactivering en ECM-coating, hoewel 's nachts incubatie de voorkeur heeft. Chips kunnen na het toevoegen van de ECM en incubatiechips bij 37 °C klaar zijn voor het zaaien van 4 uur.

6. Zaaien van de "brain side" kanaal en het differentiëren van EZ bollen in gemengde neurale culturen

  1. Breng de schotel met de bereide chips naar de BSC. Was beide kanalen voorzichtig met 200 μL NDM.
  2. Vermijd contact met de poorten, zorgvuldig aanzuigen overtollige media druppels van het oppervlak van de chip. Geef celvering voorzichtig voordat u elke chip zaait om een homogene celvering te garanderen
  3. Zaaien van de iNPCs in het bovenste kanaal om de "brain side" te genereren
    1. Zaai de cellen (1 x 106 cellen/mL) in het bovenste kanaal van de chip. Voeg een P200-tip met 30-100 μL cellensvering toe aan de bovenste kanaalinlaat en laat de punt voorzichtig los uit de pipet. Neem een lege P200 pipet, druk de zuiger, steek in het bovenste kanaal uitlaat en zorgvuldig trek de enkele cellen schorsing door de chip.
    2. Bedek de schotel en breng over naar de microscoop om de zaaidichtheid en homogene verdeling van cellen in het bovenste kanaal te controleren. Verwijder voorzichtig de pipettip uit de spaaninlaat- en uitlaatpoorten.
    3. Zaaien dichtheid moet verschijnen als 20% dekking. Als de seedingdichtheid hoger of lager is dan verwacht of ongelijk, breng de chips terug naar de BSC, was het kanaal 2x met 200 μL vers medium en herhaal t.t. stap 6.3.1.
    4. Na bevestiging van de juiste celdichtheid plaatst u de chips onmiddellijk in de couveuse gedurende 2 uur bij 37 °C na het zaaien van elke partij chips. Was de cellen weg die niet hechten met verse NDM.
    5. Houd cellen onder statische omstandigheden op 37 °C met een dagelijkse NDM-vervanging gedurende ten minste 48 uur voordat de stroom wordt gestart. iBMECs kunnen worden gezaaid nadat iNPC's zijn gekoppeld of op een volgende dag na het zaaien van iNPC.

7. ICb's in het onderste kanaal zaaien om de "bloedzijde" te genereren

  1. Breng de schotel met de bereide chips naar de BSC. Was het onderste kanaal voorzichtig met 200 μL EC medium.
  2. Het vermijden van contact met de poorten, zorgvuldig aanzuigen druppels van overtollige EC medium van het oppervlak van de chip, ervoor te zorgen dat medium te verlaten in beide kanalen. Geef celvering voorzichtig voordat u elke chip zaait om een homogene celvering te garanderen.
  3. Stel met behulp van een P200 pipet 30-100 μL van de iBMEC-celvering (14-20 x 106 cellen/mL) op en plaats de punt in de onderste kanaalinlaat. Koppel de punt voorzichtig los van de pipet, waardoor de celhoudende punt in de inlaatpoort achterblijft.
  4. Druk de zuiger op een P200 pipet met een lege punt, steek in het onderste kanaal uitlaat, en zorgvuldig trek de enkele cel vering door het onderste kanaal door langzaam het vrijgeven van de pipet zuiger.
  5. Aanzuigen overtollige cel vering van het oppervlak van de chip. Vermijd direct contact met de inlaat- en uitlaatpoorten om ervoor te zorgen dat er geen celvering uit de kanalen wordt gezogen.
  6. Bedek de chip en breng deze over naar de microscoop om de zaaidichtheid te observeren. Het onderste kanaal moet worden gevuld met geen waarneembare hiaten tussen cellen wanneer waargenomen op 4x of 10x onder een microscoop (figuur 4).
  7. Als de seedingdichtheid lager is dan 90% dekking of ongelijk verdeeld is, pas dan de celdichtheid dienovereenkomstig aan en herhaal stappen 7.2–7.6 totdat de juiste dichtheid binnen het kanaal is bereikt. Na bevestiging van de juiste celdichtheid(figuur 4)worden zaadcellen in de resterende spaanders. Om cellen op het poreuze membraan te bevestigen, dat zich aan de bovenkant van het onderste kanaal bevindt, omkeren elke chip en rusten in een spaanwieg.
  8. Plaats een klein reservoir (15 mL conische buisdop met steriele DPBS) in de 150 mm schotel om vochtigheid voor de cellen te bieden. Incubeer chips bij 37 °C gedurende ongeveer 3 uur, of totdat cellen in het onderste kanaal zijn bevestigd. Zodra iBMECs hebben aangesloten (~ 3 h post-zaaien), flip de chips terug naar een rechte positie om celbevestiging aan het onderste gedeelte van het onderste kanaal mogelijk te maken.

8. Inleiding van de stroom

  1. Flow wordt meestal geïnitieerd 48 h post-seeding van iBMECs. Deze tijd is vereist voor de iBMECs om stevig vast te maken aan de chip.
  2. Om de laminaire stroom door de chip te behouden, is het belangrijk om de temperatuur van het medium te ontgassen en te equilibreren. Medium moet gedurende 1 uur worden voorverwarmd in een waterbad van 37 °C.
  3. Tot 50 mL opgewarmd medium kan worden ontgast door incubatie onder een vacuüm-aangedreven filtratiesysteem voor 15 min.
  4. Priming van draagbare modules
    1. Ontsmet de buitenkant van de draagbare module verpakking en trays met 70% ethanol, veeg, en overdracht aan de BSC. Open de verpakking en plaats de modules in de lade. Oriënteer ze met de reservoirs naar de achterkant van de lade.
    2. Pipetteer 3 mL voorgeequilibreerde, warme media voor elk inlaatreservoir. Voeg ec-kweekmedium toe aan het inlaatreservoir van het onderste kanaal en NDM aan het bovenste kanaalinlaatreservoir van het bovenste kanaal(figuur 5).
    3. Pipetteer 300 μL voorgeëigquilibreerde, warme media naar elk uitlaatreservoir, direct over elke uitlaatpoort (figuur 5).
    4. Plaats maximaal zes draagbare modules op elke lade. Breng trays naar de couveuse en schuif volledig in de kweekmodule met de ladehendel naar buiten gericht.
    5. Selecteer en voer de "Prime" cyclus uit op de cultuurmodule. Sluit de couveusedeur en laat de kweekmodule de draagbare modules priemgetaln (duurt ~1 min). De primingcyclus is voltooid wanneer de statusbalk "Klaar" staat. Haal de lade uit de kweekmodule en breng deze naar de BSC.
    6. Controleer of de draagbare modules met succes zijn geprimed door de onderkant van elke draagbare module in de BSC te inspecteren. Zoek naar de aanwezigheid van kleine druppeltjes in alle vier de poorten.
      1. Als een draagbare module geen druppeltjes weergeeft, voert u de priemcyclus op deze modules opnieuw uit. Als er media op de lade druppelden (dit kan vaker voorkomen door de uitlaatpoorten), schone lade met 70% ethanol.
  5. Aansluiting van chips op draagbare modules, regulering en initiatie van stroom
    1. Was beide kanalen van elke chip voorzichtig met een warm, geëquilibreerd celspecifiek kweekmedium om eventuele bellen in het kanaal te verwijderen en kleine druppeltjes media (volgens de media in het kanaal) op de bovenkant van elke inlaat- en outletpoort te plaatsen.
    2. Plaats chips met dragers in de draagbare modules en plaats maximaal zes op elke lade. Voeg trays in de cultuurmodule. Programmeer de juiste voorwaarden voor de orgaanchipcultuur (stroomsnelheid en stretch) op de cultuurmodule.
    3. De geprogrammeerde voorwaarden starten zodra de cyclus "Reguleren" is voltooid.
      OPMERKING: De stroomsnelheden voor elk kanaal kunnen onafhankelijk worden geregeld en kunnen worden ingesteld op snelheden die variëren van 0-1.000 μL/h. De BBB-chip wordt meestal gekweekt bij 30 μL/h. Bij stromende media zoals EC media of ESM bij respectievelijk 30 μL/h en 1000 μL/h zijn de schuifkrachten 0,01 dyn/cm2 en 0,33 dyn/cm2.
    4. Voer de "Reguleren" cyclus, die duurt ongeveer 2 uur, waarna de cultuur module zal beginnen stroom op de vooraf ingestelde orgaan chip cultuur voorwaarden.

9. Bloed-op-hersenen paracellulaire permeability beoordeling

  1. Bereid NDM voor aangevuld met 10 μg/mL dextran-FITC (4 kDa). Deze oplossing zal worden gebruikt als de input voor de "bloed kant" kanaal.
  2. Vul de onderste kanaalreservoirs van de draagbare modules met NDM aangevuld met dextran-FITC. Vul de bovenste kanaalreservoirs met NDM zonder tracer.
  3. Bezielen beide, de boven- en onderkant kanalen met een stroomsnelheid van 30 μL/h gedurende ten minste 4 uur totdat er voldoende media zich ophopen voor de beoordeling van fluorescentie in een plaatlezer (meestal 100 μL).
  4. Verzamel mediamonsters uit de invoer- en uitgangsreservoirs van de boven- en onderkantkanalen. Bescherm de monsters tegen licht.
  5. Serieel verdunde de NDM aangevuld met 10 μg/mL dextran-FITC 1:1 met NDM zonder tracer om een 10-12 puntkalibratiecurve te genereren.
  6. Neem 100 μL van elk monster, inclusief de kalibratiecurve, in een zwarte 96-putplaat en lees fluorescentie met behulp van een plaatlezer (485 nm excitatie, 530 nm emissie).
  7. Gebruik de gemeten waarden omP-app-waarden als volgt te berekenen:

Equation 1

  1. Doe dagelijks metingen om de barrière-eigenschappen te beoordelen en te bevestigen dat de BBB-chip nog steeds functioneel is.

10. Immunocytochemie

  1. Breng chips naar een chemische rookkap. Fixmet behulp van een P200 pipet, bevestig cellen door beide kanalen te doornemen met 200 μL van 4% paraformaldehyde (PFA) in DPBS en incubeer gedurende 10 min bij RT.
  2. Na de fixatie, perfuse elk kanaal met 200 μL DPBS en incubeer gedurende 5 min. Herhaal DPBS wassen 2x.
  3. Blokkeer en permeabilize cellen op de chip door middel van primaire blokkeringsoplossing (PBS, aangevuld met 5% normaal ezelsserum en 0,1% Triton X-100). Incubate bij RT voor 1 uur.
  4. Verdun primaire antilichamen in primaire blokkeeroplossing en broed 's nachts bij 4 °C. BMECs-markeringen zijn GLUT-1 (1:100 verdunning), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) en VE-cadherin (1:200). Neurale markers zijn βIII-tubulin (1:1000; Tuj1α), S100β (1:500), nestin (1:1000) en GFAP (1:1000).
  5. Was de chips 3x met koude DPBS.
  6. Verwater secundaire antilichamen in secundaire blokkeeroplossing (DPBS met 5% normaal ezelserum zonder Triton-X).
  7. Bezielen de secundaire antilichaam oplossing via beide kanalen. Typisch, fluorescerende secundaire antilichamen worden verdund 1:1000. Incubeer gedurende 1 uur bij RT beschermd tegen licht.
  8. Was de chips 3x met DPBS.
  9. Vlekcelkernen door middel van chip met 100 μL DAPI-oplossing. Incubeer bij RT voor 5 min.
  10. Was de chips 3x met DPBS.
  11. De chip is klaar voor beeldvorming met behulp van een rechtopstaande of omgekeerde fluorescerende microscoop. De PDMS-transparantie maakt beeldvorming in de intacte orgaanchip mogelijk. Vergrotingen boven 10x kunnen lange werkafstandsdoelstellingen vereisen vanwege de dikte van de orgaanchip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 6A, B,C vertegenwoordigt een BBB-chip die is ingezaaid met EZ-bollen op het "brain side" bovenkanaal en iBMECs op het onderste kanaal "bloedzijde". iBc's werden eerst gezaaid en mochten 's nachts worden bevestigd, waarna EZ-bollen werden gezaaid. Chips werden vervolgens gekweekt onder statische omstandigheden met dagelijkse media vervanging voor zeven dagen. De BBB chip werd vervolgens vastgesteld met behulp van 4% PFA op RT voor 10 min en gewassen 3x met DPBS. Immunocytochemie werd uitgevoerd op de BBB-chip met behulp van 1) nestin als een marker voor neurale voorloper cellen, 2) S100β of GFAP als markers voor astrocyten, en 3) βIII-tubulin als een marker voor neuronen. GLUT-1 en Pecam-1 werden gebruikt als marker voor BMECs. Imaging werd uitgevoerd op 20x met behulp van een confocale microscoop en beelden werden verwerkt met behulp van Fiji voor ImageJ software.

Figuur 6D vertegenwoordigt een paracellulaire permeability-test die werd uitgevoerd op orgaanchips gevuld met iBMECs en EZ-sferen, iBMECs alleen (zonder EZ-sferen), of EZ-sferen alleen (zonder iBMECs). Na een "Regulate"-cyclus werd een 4 kDa Dextran-FITC tracer toegevoegd aan het reservoir van de "bloedzijde" aan een eindconcentratie van 10 μg/mL, en chips werden 's nachts met 30 μL/h geperfundeerd. Vervolgens werden media verzameld uit inlaat- en outletreservoirs van zowel de boven- als de onderkanalen. 100 μL van elk monster werd verzameld en onderzocht op fluorescentie met behulp van een plaatlezer.

Belangrijk is dat een 1:1 kalibratiecurve werd gebruikt om fluorescentiewaarden om te zetten in concentratiewaarden van Dextran FITC. Waarden werden vervolgens gebruikt om doorlaatbaarheid te berekenen(P-app). Deze resultaten tonen aan dat iBMECs functionele barrière-eigenschappen vormen, die verder worden aangescherpt wanneer iBMECs co-cultuur met EZ-sferen zijn. Chips gekweekt met EZ-sferen alleen, niet om een barrière te vormen. Een soortgelijke benadering kan worden gebruikt om het transport van elk molecuul over de BBB-chip te onderzoeken, afhankelijk van een beschikbare meetmethode (bijvoorbeeld fluorescentie, ELISA of massaspectrofotometrie).

Figure 1
Figuur 1: Schematisch van de op iPSC gebaseerde BBB-chip. Voorafgaand aan het zaaien op de chip, iPSCs zijn gedifferentieerd in kweekplaten in (i) EZ-bollen (neurale voorloper cellen, iNPCs), die worden geteeld in suspensie als bollen, en in (ii) hersenen microvasculaire endotheelcellen (iBMECs). EZ-bollen worden gescheiden in enkele cellen, gezaaid op het bovenste kanaal van de orgaanchip, waar ze zich verder onderscheiden in gemengde neurale culturen om de "hersenkant" te vormen. iBMECs worden gezaaid in het onderste kanaal van de orgaanchip om een bloedvatachtige structuur aan de "bloedzijde" te vormen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch van de bovenste weergave van de chip in de chipcarrier, met gelabelde poorten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Flowchart van de op iPSC gebaseerde BBB-chipvoorbereiding en -workflow. Pre-differentiatie van zowel neurale als endotheliale cellen van iPSCs is vereist voor de initiatie van de workflow. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Zaaien van iBMECs in het onderste kanaal. Brightfield beelden van iBMECs gezaaid in het onderste kanaal(A) onmiddellijk na het zaaien of (B) 24 uur post-zaaien, nadat cellen hebben bevestigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Schematisch van de aangesloten chip en draagbare module met gelabelde inlaat- en outletmediareservoirs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Representatieve resultaten. Immunocytochemie op de op iPSC gebaseerde BBB-chip 7 dagen na het zaaien. EZ-bollen onderscheiden zich in een gemengde neurale celpopulatie in het bovenste "hersenzijde"-kanaal, waaronder (A) S100β+ (groene) astrocyten, Nestin+ (rode) neurale voorlopercellen en (B) GFAP+ (rode) astrocyten en βIII-tubulin+ (rode) neuronen. Schaalrepen = 200 μm. (C) iBMECs gezaaid in het onderste "bloedzijde" kanaal uitgedrukt GLUT-1 en (groen) PECAM-1 (CD31, red). Schaalbalk = 200 μm. (D) De evaluatie van de doorlaatbaarheid van de BBB-chip werd uitgevoerd door dextran-FITC (4 kDa) toe te voegen aan het reservoir van het onderste kanaal. De resultaten tonen aan dat orgaanchips die zijn zaaid met iBMECs en EZ-bollen een strakke barrière vertonen in vergelijking met orgaanchips die alleen met iBMECs zijn gezaaid (*p < 0,05). Orgaanchips die alleen met EZ-bollen zijn ingezaaid, vertonen geen barrière-eigenschappen (***p < 0,001; one-way ANOVA met tukey's meervoudige vergelijkingentest). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De combinatie van organ-on-chip technologie en iPSC-afgeleide cellen in de NVU belooft een nauwkeurige modellering van de menselijke BBB. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige en robuuste toepassing van de onlangs gepubliceerde iPSC-gebaseerde BBB-chip16. Een overzicht en timing van het zaaiparadigma is te zien in figuur 3. Het verkrijgen en behouden van barrièrefuncties die geschikt zijn voor BBB-modellering, het genereren van een homogene iBMEC-monolayer en het behoud van de integriteit ervan zijn van cruciaal belang. De eerste stap naar de generatie van een functionele monolayer omvat chemische activering van het niet-polaire PDMS-oppervlak dat het mogelijk maakt ecm-eiwitten te bevestigen. De oppervlakteactiveringsreagentia degraderen snel bij reconstitutie, wat uiteindelijk kan resulteren in suboptimale bevestiging van cellen. Het is daarom belangrijk om de reagentia gedurende het hele proces vers en beschermd te houden tegen licht.

Tijdens de UV-activering (punt 5.2) moeten reagentia gelijkmatig binnen elk kanaal worden verdeeld om consistente ECM-coating en homogene celbevestiging te bereiken. ECM-samenstellingen en concentraties die in dit protocol worden geleverd, zijn geoptimaliseerd voor de specifieke soorten cellen (d.w.z., iBMECs en ez-sphere-afgeleide neurale voorlopercellen). Het wijzigen van de celsamenstelling is mogelijk, maar vereist mogelijk differentiële ECM-omstandigheden, die optimalisatie vereisen. Na ECM-coating is het cruciaal om iBMECs goed te zaaien. Hoge celzaaidichtheid (>14 x 106 cellen/mL) is essentieel voor het verkrijgen van een volledige monolayer. Als het niet lukt om volledige celsamenvloeiing te bereiken, wordt geadviseerd om de dichtheid van de celvering verder te verhogen tot 20 x 106 cellen/mL tijdens het zaaien.

Laminaire stroom werd eerder voorgesteld om iBMEC rijping15 te verbeteren en is onmisbaar voor het vervullen van de voordelen die door het microfluidic platform. Microbubbles die door de kanalen van de chip stromen, kunnen echter fysiek bestressen en vaste cellen losmaken, wat kan leiden tot vernietiging van de BBB-chipintegriteit. Om microbelvorming tijdens laminaire stroom te voorkomen, is het van cruciaal belang om het medium te equilibreren voordat perfusie wordt gestart. Equilibratie vereist voorverwarmen en ontgassen van het medium voorafgaand aan gebruik.

De generatie gepersonaliseerde chips wordt mogelijk gemaakt met behulp van zowel menselijke iPSC-afgeleide iBMECs als iNPC's. Terwijl de differentiatie van iBMECs is kort en vrij eenvoudig24,22, differentiatie van iPSCs in neurale cellen21,25 is uitdagender. Echter, de neurale cellen die zich in de "hersenen kant" van de chip kan worden vervangen door een neurale cel type, zoals primaire neurale cellen of iPSC-afgeleide motorneuronen16. Net als bij "bonafide" endotheelcellen vertonen iBMECs plasticiteit in genexpressie in reactie op verschillende neurale coculturen. Deze flexibiliteit kan dus leiden tot toekomstige ontwikkeling van verschillende NVU's op de chip. Extra flexibiliteit van het systeem kan worden verkregen door het aanpassen van de cel zaaien timing en volgorde. iBC's kunnen worden gezaaid voor of na de neurale cellen, waardoor het mogelijk is om iCBCs onmiddellijk na zaaien en bevestiging van neurale cellen te zaaien, of nadat EZ-bollen zijn gedifferentieerd in meer volwassen neurale culturen in de chipomgeving. Dit is van bijzonder belang, gezien de onrijpe aard van iPSC-afgeleide neurale cellen. Gezien het feit dat EZ-sferen vroege neurale voorlopers zijn, kunnen langere differentiatieperioden ook resulteren in een verhoogd percentage astrocyten en neuronen.

Een component die ontbreekt in het protocol is perivasculaire pericytes, die een cruciale component in de fysiologische NVU. Recente vooruitgang in iPSC's differentiatie in pericyte-achtige cellen26,27 zal de invoering van dit extra celtype mogelijk te maken, waardoor een verbeterde replica van de BBB met behoud van de persoonlijke aard.

IBMECs is eerder aangetoond dat verschillende eigenschappen die van cruciaal belang zijn voor BBB modellering met inbegrip van expressie van cellulaire markers, de oprichting van TEER en functionele activiteit van efflux pompen28,24,5demonstreren. Moleculaire analyses hebben echter aangetoond dat deze cellen ook verschillende epitheelmarkersuitdrukken 15. Vooruitgang in iBMEC generatie met verbeterde functie en endotheliale marker expressie zijn onlangs beschreven29,30. Naar aanleiding van het paradigma hier gepresenteerd, kunnen deze potentieel verbeterde cellen gemakkelijk worden opgenomen in de BBB chip model voor toekomstige toepassingen. Het flexibele maar robuuste platform dat hier wordt beschreven, kan zowel ziektemodellering als de ontwikkeling en beoordeling van nieuwe CNS-geneesmiddelen vergemakkelijken.

Hoewel dit protocol is gebaseerd op een specifiek commercieel verkrijgbaar product, bieden aanvullende commerciële bedrijven diverse microfysiologische platforms aan, die alternatieve voordelen kunnen bieden31. Bovendien, protocollen voor "in house" productie van microfluïsche Organ chips zijn ook beschikbaar32 en kan meer modulariteit bieden, waaronder de integratie van TEER elektroden17, die ontbreekt in het platform hier gebruikt.

Organ-on-chips werden geïntroduceerd als een alternatieve aanpak om de fysiologische context van de huidige celculturen te verbeteren33. Echter, de toepassing van deze technologie vereist gespecialiseerde technische vaardigheden, die vaak ontbreken in biologisch georiënteerde laboratoria. Een commercieel beschikbaar chipplatform, zoals het hier te gebruiken, biedt minder modulariteit en verhoogde robuustheid en reproduceerbaarheid, die door een breder scala aan gebruikers kan worden toegepast. Verder is de toepassing van laminaire stroom op een microfluïdische chip afhankelijk van de toepassing van spuit of peristaltische pompen, die een ander niveau van complexiteit introduceert. Dit obstakel is nu gemakkelijker te overwinnen met de toepassing van de cultuurmodule, die de gelijktijdige perfusie van meerdere chips vergemakkelijkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Cedars-Sinai bezit een minderheidsbelang in Emulate, het bedrijf dat de microfluïdische organchips van de studie produceert. Een officier van Cedars-Sinai is ook lid van de Raad van Bestuur van Emulate. Emulate bood geen financiële steun aan dit onderzoek. Cedars-Sinai en Emulate hebben patenten ingediend in verband met dit werk.

Acknowledgments

We willen Dr. Soshana Svendsen bedanken voor de kritische montage. Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation subsidie 1621/18, het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST), Israël 3-15647, het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde subsidie ID DISC1-08800, de Sherman Family Foundation, NIH-NINDS subsidie 1UG3NS105703, en De ALS Association subsidie 18-SI-389. AH werd gefinancierd door Stichting Wallenberg (subsidienummer 2015.0178).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase EMD Millipore SCR005 Dissociation solution
B27 Gibco 12587010
Bfgf Peprotech 100-18B
Chip-S1 Emulate Inc Chip-S1 Organ-Chip
Collagen IV Sigma C5533
DAPI Invitrogen D3571
Dextran-FITC Sigma 46944
DMEM: F12 Thermo Fisher Scientific 31330038
Donkey serum Sigma D9663
Emulate Reagent 1 (ER-1) Emulate Inc ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2) Emulate Inc ER-2
Fibronectin Sigma F1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334
GLUT-1 Invitrogen MA5-11315
Glutamax Life Technologies 35050038 Glutamine supplement
hBDNF Peprotech 450-02
KOSR Thermo Fisher Scientific 10828028
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 354234 Basement membrane matrix
mTeSR1 StemCell Technologies, Inc. 85851
NEAA Biological industries 01-340-1B
Nestin Millipore MAB353
NutriStem Biological industries 05-100-1A Alternate media
PECAM-1 Thermo Fisher Scientific 10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) Biomedical Technologies J64483AB
Retinoic acid (RA) Sigma R2625
S100β Abcam ab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SCGP00525
Triton X-100 Sigma X100
ZO-1 Monoclonal Antibody Invitrogen 33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α) Sigma T8660
β-mercaptoethanol Life Technologies 31350010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
  2. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  3. Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
  4. El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
  5. Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  6. Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
  7. Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
  8. Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
  9. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
  10. Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
  11. Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
  12. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  13. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
  14. Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
  15. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  16. Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
  17. Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  18. Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
  19. Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
  20. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
  21. Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
  22. Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
  23. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  24. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  25. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
  26. Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
  27. Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
  28. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
  29. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
  30. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  31. Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
  32. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
  33. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).

Tags

Ontwikkelingsbiologie nummer 157 bloedhersenbarrière BBB microfluïde organ-on-chip OoC neurovasculaire eenheid NVU iPSC iPS cellen astrocyten gepersonaliseerde geneeskunde precisiegeneeskunde
Generatie van een menselijke iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagadeesan, S., Workman, M. J.,… More

Jagadeesan, S., Workman, M. J., Herland, A., Svendsen, C. N., Vatine, G. D. Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip. J. Vis. Exp. (157), e60925, doi:10.3791/60925 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter