Summary
Blod-hjernebarrieren (BBB) er en flercellet nevrovaskulær enhet som regulerer hjernens homeostase tett. Ved å kombinere menneskelige iPSCer og organ-on-chip-teknologier, har vi generert en personlig BBB-chip, egnet for sykdomsmodellering og CNS-prognoser for legemiddelpenetrabilitet. En detaljert protokoll er beskrevet for generering og drift av BBB-chipen.
Abstract
Blodhjernebarrieren (BBB) dannes av nevrovaskulære enheter (NVUer) som beskytter sentralnervesystemet (CNS) fra en rekke faktorer som finnes i blodet som kan forstyrre delikat hjernefunksjon. Som sådan er BBB et stort hinder for levering av terapeutiske midler til CNS. Akkumulerende bevis tyder på at BBB spiller en nøkkelrolle i utbruddet og progresjonen av nevrologiske sykdommer. Dermed er det et enormt behov for en BBB-modell som kan forutsi penetrasjon av CNS-målrettede legemidler, samt belyse BBBs rolle i helse og sykdom.
Vi har nylig kombinert organ-on-chip og indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologier for å generere en BBB chip fullt personlig til mennesker. Denne nye plattformen viser cellulære, molekylære og fysiologiske egenskaper som er egnet for prediksjon av narkotika- og molekyltransport over hele den menneskelige BBB. Videre, ved hjelp av pasientspesifikke BBB-chips, har vi generert modeller av nevrologisk sykdom og demonstrert potensialet for personlige prediktive medisinapplikasjoner. Gitt her er en detaljert protokoll som viser hvordan å generere iPSC-avledede BBB chips, som begynner med differensiering av iPSC-avledet hjerne mikrovaskulære endotelceller (iBMECs) og resulterer i blandede nevrale kulturer som inneholder nevrale forfedre, differensierte nevroner og astrocytter. Også beskrevet er en prosedyre for seeding celler i orgelchip og kuling av BBB chips under kontrollert lamimer flyt. Til slutt er detaljerte beskrivelser av BBB-chipanalyser gitt, inkludert paracellulær permeabilitetsanalyser for vurdering av legemiddel og molekylpermeabilitet samt immuncytokjemiske metoder for å bestemme sammensetningen av celletyper i brikken.
Introduction
BBB er en svært selektiv barriere som skiller CNS fra det sirkulerende blodet. Det beskytter kritiske hjernefunksjoner mot potensielt forstyrrende stoffer, faktorer og xenobiotika samtidig som tilstrømningen av næringsstoffer og andre metabolitter som kreves for å opprettholde hjernens homeostase1. BBB er en flercellet NVU der pericytes, astrocyttende endeføtter og nevronale prosesser direkte kontakter hjernens mikrovaskulære endotelceller (BMECer). Disse interaksjonene tillater BMECs å danne spesialiserte barriereegenskaper som støttes av stramme og overholder veikryss2,3. Dannelsen av denne barrieren begrenser paracellulær passasje av molekyler, men den inneholder polariserte transportører for å aktivt transportere molekyler inn i CNS eller tilbake i blodet1. På grunn av disse unike barriereegenskapene utgjør BBB et stort hinder for levering av biofarmasi i hjernen, og det er anslått at mindre enn 5% av FDA-godkjente små molekyler kan nå CNS4.
Dyremodeller har blitt mye brukt til å studere BBB-penetans og de molekylære mekanismene som er involvert i BBB-utvikling5. Mens dyremodeller trofast representerer det komplekse flercellulære in vivo-miljøet, utelukker forskjeller i uttrykk og aktivitet av BBB-transportører samt substratspesifisitet på tvers av arter ofte nøyaktig ekstrapolering av dyredata til mennesker6. Dermed er menneskebaserte modeller avgjørende for å studere den menneskelige BBB og for bruk i utviklingen av legemidler designet for å målrette CNS. Dette behovet blir enda tydeligere med den økende dominansen av biologiske, menneskespesifikke legemidler i det farmasøytiske utviklingsfeltet. Akkumulerende bevis tyder på at en kompromittert BBB er forbundet med en rekke alvorlige CNS lidelser, inkludert hjernesvulster og nevrologiske sykdommer7,8,9. Menneskelige modeller som trofast reflekterer disse sykdommene har potensial til både 1) identifisere nye veier som kan målrettes for narkotikautvikling og 2) forutsi CNS penetan, og dermed redusere tid og ressurser i prekliniske studier og muligens redusere svikt i kliniske studier.
In vitro-modeller har blitt mye implementert for å studere interaksjoner mellom BMECs og andre celler i NVU og gjennomføre skjermer for potensielle BBB-permeable legemidler10. For å gjenskape viktige aspekter ved den menneskelige BBB, må in vitro-modellene vise fysiologisk relevante egenskaper (dvs. lav paracellulær permeabilitet og fysiologisk relevant transendothelial elektrisk motstand [TEER] på tvers av den endoteliske monolayer). I tillegg må den molekylære profilen til et in vitro-system inkludere uttrykk for representative funksjonelle transportsystemer. Vanligvis består in vitro-modeller av endotelceller som er co-cultured på en semipermeable membran med kombinasjoner av andre NVU-celler for å forbedre BBB egenskaper11. Denne tilnærmingen gir enkel og relativt rask vurdering av barrierefunksjonalitet og molekylgjennomtrengelighet. Slike cellebaserte BBB-modeller kan etableres med dyre- eller menneskecellekilder, inkludert celler isolert fra kirurgiske eksisjoner eller udødelige BMEC-linjer.
Nylig ble protokoller for å differensiere menneskelige pluripotente celler i BMECer introdusert som en attraktiv kilde for in vitro menneskelige BBB-modeller12,13. Indusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledede BMECs (iBMECs) er svært skalerbare, viser avgjørende morfologiske og funksjonelle egenskaper ved den menneskelige BBB, og bærer genetikken til pasienten. I kulturen danner iBMECs et monolayer som uttrykker stramme koblingsmarkører og viser i vivo-lignende tette koblingskomplekser. Disse cellene uttrykker også BBB-markører, inkludert BBB glukosetransportør, glukosetransportør 1 (GLUT1). Viktigere, og i motsetning til andre alternative cellekilder for menneskelige BMECer, iBMECs skaffe barriere egenskaper med verdier så høyt som de målt in vivo14, polarisere langs basolateral eakse, og uttrykke funksjonelle efflux pumper. Videre ønsker bruk av iPSCer fra ulike begge 1) muligheten til å teste aspekter av BBB på en personlig medisin måte og 2) gir en fleksibel kilde for å generere flere celletyper av NVU. Generere disse cellene fra en isogen cellekilde for å lage personlige BBB chips ville også hjelpe i å forstå mellom individuelle forskjeller i narkotikaresponser, som er en viktig årsak til motstand eller kompromittert respons på behandling observert i kliniske studier.
Bruk av iBMECs som monolayers i en tallerken eller på en semi gjennomtrengelig transwell innsats representerer en kraftig tilnærming for BBB modellering. Disse systemene har en tendens til å være robuste, reproduserbare og kostnadseffektive. I tillegg er funksjonelle analyser som TEER og permeabilitet relativt enkle å utføre. Todimensjonale (2D) systemer klarer imidlertid ikke å rekapitulere 3D-naturen til in vivo-vev, og de mangler de fysiologiske skjærstresskreftene som tilbys av sirkulerende blod og blodceller. Dette begrenser evnen til vaskulær endotel i disse modellene for å utvikle og opprettholde iboende BBB egenskaper og funksjoner.
Mikrokonstruerte systemer foret av levende celler har blitt implementert for å modellere ulike organfunksjoner i et konsept som kalles organ-on-chips. Ved å gjenskape in vivo-lignende flercellet arkitektur, vevsgrensesnitt, fysikokjemiske mikromiljøer og vaskulær perfusjon, genererer disse mikrokonstruerte plattformene nivåer av vev og organfunksjonalitet som ikke er mulig med konvensjonelle 2D kultursystemer. De muliggjør også høyoppløselig, sanntidsavbildning og analyse av biokjemiske, genetiske og metabolske profiler som ligner på levende celler i in vivo vev og organkontekst. En spesiell utfordring av organ-on-chip er imidlertid at design, fabrikasjon og anvendelse av disse mikrokonstruerte chips krever spesialisert ingeniørkompetanse som vanligvis mangler i biologisk orienterte akademiske laboratorier.
Vi har nylig kombinert iPSC og organ-on-chip teknologier for å generere en personlig BBB chip modell15,16. For å overvinne de teknologiske utfordringene som er beskrevet, brukes den kommersielt tilgjengelige Chip-S1 sammen med kulturmodulen, et instrument designet for å automatisere vedlikeholdet av sjetongene på en enkel og robust måte (Emuler Inc.). BBB-brikken gjenskaper interaksjoner mellom nevrale og endotelceller og oppnår fysiologisk relevante TEER-verdier, som måles ved skreddersydde organbrikker med integrerte gullelektroder17. I tillegg viser BBB-brikken lav paracellulær permeabilitet, reagerer på inflammatoriske signaler på orgelnivå, uttrykker aktive efflux pumper, og viser prediktiv transport av løselige biomarkører og biofarmasi. Spesielt fanger BBB-chips generert fra flere personer de forventede funksjonelle forskjellene mellom friske individer og pasienter med nevrologiske sykdommer15.
Protokollen som er beskrevet nedenfor beskriver en pålitelig, effektiv og reproduserbar metode for generering av humane iPSC-baserte BBB-brikker under dynamiske strømningsforhold. Veiledning gis om typen analyser og endepunktsanalyser som kan utføres direkte i BBB-chipen eller fra prøvetaking av avløpsvann. Dermed demonstrerer protokollen spekteret av teknikker som kan brukes for evaluering av biologiske og funksjonelle egenskaper og svar i en menneskelig relevant modell.
En kort beskrivelse av iPSC-baserte BBB-chip er gitt her. Menneskelige iPSCer er i utgangspunktet differensiert og forplantes i vevkulturflasker som frittflytende aggregater av nevrale forfedre, kalt EZ-sfærer. Den øverste kanalen av Chip-S116,18,19 er seeded med dissosierte EZ-kuler som danner "hjernen side" av chip, som celler skiller over 7 dager inn i en blandet kultur av nevrale stamceller (iNPCer), iAstrocytes, og iNeurons. Menneskelige iPSCer er også differensiert i vevkulturplater til iBMECs. Den nederste kanalen av brikken er seeded med iBMECs å danne "blod siden" som de utvikler seg for å danne en endotelrør (Figur 1). Den porøse ekstracellulære matrisen (ECM)-belagt membran som skiller topp- og bunnkanalene 1) tillater dannelsen av celle-til-celle-interaksjoner mellom kanaler og 2) gjør det mulig for brukeren å kjøre permeabilitetsanalyser og bildeceller i begge kanalene ved hjelp av et konvensjonelt lysmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generasjon av iPSC-avledede nevrale stamceller (iNPCer)
- Produser EZ-kuler fra iPSC kolonier som beskrevet nedenfor og som tidligere publisert20,21,22.
- Kultur iPSC kolonier for å samtidigpåvirke kjellermembran matrisebelagte 6 brønnplater (0,5 mg/plate) i mTESR1 eller andre kommersielle medier (se Materialtabell).
- Fjern iPSC medium og erstatt med 2 ml EZ-sfæremedium [ESM; DMEM:F12 7:3 supplert med 100 ng/ml grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), 100 ng / ml epidermal vekstfaktor, 5 μg / ml heparin, og 2% B27 supplement].
- Skrap bunnen av hver konfluent godt med baksiden av en steril 1000 μL pipette spiss eller celle skraper.
- Samle alle celler og plasser i en ultra-lav vedlegg T25 kolbe for å tillate spontan dannelse av frittflytende sfærer. Inkuber over natten ved 37 °C.
- Mate kulene hver 2-3 dager når mediet blir gult ved å erstatte halvparten av mediet med frisk ESM. Dette gjør det mulig for kuler å forbli i betinget medium, noe som er svært viktig for deres vekst og vedlikehold.
- Len kolben på et rørstativ og la kulene slå seg ned ved tyngdekraften i 1–2 min ned til hjørnet av kolben.
- Når avgjort, aspirer halvparten av supernatant med en 5 ml eller 10 ml serologisk pipette og erstatte med frisk, pre-oppvarmet ESM.
- Passasje EZ-kuler ukentlig ved hakking kuler til 200 μm diametre som tidligere beskrevet23,20,21. EZ-kuler kan opprettholdes i opptil 25 passasjer og er ideelle når de brukes mellom passasjer 8-25.
- Forbered enkeltcellesuspensjon av iNPCer:
- For å indusere neural differensiering, dissosiere EZ-sfære i enkeltceller.
- Samle kuler 3-4 dager etter hakking fra en T75 kolbe og overføre til en 15 ml konisk, så la det stå i 2 min eller til alle sfærer er avgjort nederst.
- Fjern ESM langsomt med en 5 ml pipette uten å forstyrre de avgjorte kulene. Tilsett 1 ml dissosiasjonsoppløsning (se Materialtabell) og inkubator i 10 min ved 37 °C.
- Virvle dissosiasjonsløsningen og kulene etter 5 min inkubasjon for å sikre at eventuelle avgjorte sfærer behandles.
- Fjern dissosiasjonsoppløsningen langsomt. Tilsett 1 ml neural differensieringsmedium [NDM; DMEM: F12 med 2% B27 minus vitamin A, 1% N2 supplement, og menneskelig hjerneavledet nevrotrofisk faktor (hBDNF, 20 ng / ml)].
- Triturate kulene i enkeltceller ved pipettering ved hjelp av en 1 ml pipette etterfulgt av 200 μL pipette, til alle kuler har dissosiert. Unngå bobledannelse under trerengingsprosedyren.
- Tell dissosierte celler ved hjelp av et hemocytometer og fortynn celler til en endelig tetthet på 1 x 106 celler / ml. Det er mulig å endre tettheten avhengig av programmet.
MERK: Høyere tettheter (opptil 6 x 106 celler/ml) anbefales for kortsiktige kulturer på opptil 3 dager, og lavere tettheter anbefales for langsiktige anvendelser på opptil 3 uker.
MERK: Cellene er nå klare til å frø inn i den øverste kanalen av chip for å danne "hjernesiden".
2. Differensiering av iPSCer til iBMECs
- Passasje iPSCer fra en enkelt konfluent brønn av en 6 brønnplate på en 1:6 ratio i en 6 brønn kjeller membran matrisebelagt plate. La cellene feste seg i 24 timer. Endre iPSC-medium daglig.
- Telle celler daglig ved hjelp av et hemocytometer.
- Når cellene når en tetthet på 1,5–3,0 x 105 celler/brønn, erstatter iPSC medium med 3 ml ubetinget medium uten bFGF [DMEM:F12 1:1, med 10 % knockout serumerstatning (KOSR), 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 0,5 % glutaminsupplement (Materialtabell)og 100 μM β-merkaptoetanol]. Skift ut medium daglig i 6 dager24.
- På dag 6, erstatte medium med endotelcelle (EC) medium [human endotelserum fritt medium (hESFM) supplert med 1% blodplate-dårlig plasma-avledet storfe serum, 20 ng / ml bFGF, og 10 μM all-trans retinoic acid (RA)]. La medium stå i 2 dager.
- Fjern EC-medium og tilsett 1 ml oppløsningsoppløsning per brønn. Inkubat ved 37 °C i 35 min.
MERK: Selv om dette regnes som en lang inkubasjonstid i dissosiasjonsløsningen som brukes her, kan iBMECer tåle denne behandlingen med cellelevedyktighet høyere enn 90%. - Løsne cellene fra brønnen ved å forsiktig pipettere cellesuspensjonen og samle alle celler i et 15 ml konisk rør.
MERK: Unngå hard pipettering. Hvis cellene ikke løsner lett, inkuberiet i ytterligere 5 min. - Tilsett 1 volum av EC-medium i 15 ml konisk for å inaktivere Accutase, sentrifuge ved 200 x g i 5 min, fjern medium og erstatt med 1 ml EC-medium (uten bFGF og RA).
- Telle celler ved hjelp av et hemocytometer og juster celletettheten til 14–20 x 106 celler/ml.
MERK: Cellene er nå klare til å bli seeded inn i den nederste kanalen av brikken for å danne "blodsiden".
3. Mikrofabrikasjon av organbrikken
- Bruk en organchip for BBB-chipmodellen og produksjonen som gjort tidligere16,18,19. Den høye kanalorgelbrikken (se Materialtabell)er fabrikkert fra en svært fleksibel polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer som inneholder to overliggende og parallelle mikroskalakanaler atskilt med en fleksibel porøs membran. Topp- og bunnstørrelsene på mikrokanal er henholdsvis 1 mm x 1 mm og 1,0 mm x 0,2 mm. De to kanalene er adskilt av en 50 μm tykk PDMS-laget fleksibel porøs membran, som inneholder 7 μm diameter porer med 40 μm avstand. Overflatearealet av porøs membran som skiller kanalene er 0,171 cm2.
4. Chip forberedelse
- Organchips leveres forhåndspakket i chipbæreren, noe som eliminerer behovet for å forstyrre eller forvrenge sjetongjusteringen under håndtering. I tillegg kobler chipcarrieren sikkert til en bærbar modul ("Pod") som fungerer som grensesnittet mellom kulturmodulen og chipen.
- Spray emballasjen til brikkene med 70% etanol og bring inn i biosikkerhetskabinettet (BSC).
- Åpne emballasjen og legg ut orgelbrikken i en steril Petri-tallerken. Håndter chipbæreren kun ved sidene for å unngå direkte kontakt med brikken.
- Kontroller at fanen på transportøren vender mot høyre (figur 2),og juster dem alle i samme retning når du bruker flere sjetonger.
- Merk hver brikke på transportørfanen (komplett brikkeforberedelse og arbeidsflyt vises i figur 3).
5. Overflateaktivering og ECM-belegg
- Klargjøring av overflateaktiveringsløsning
- Emulerreagen 1 (ER-1), som leveres i et hetteglass som inneholder 5 mg, er lysfølsom. Forbered frisk ER-1-løsning umiddelbart før bruk. ER-1 integritet er avgjørende i vellykket utarbeidelse av chips.
- Slå av lyset i BSC ved håndtering av ER-1.
MERK: ER-1 er et øyeirriterende og må håndteres i BSC med riktige hansker og øyebeskyttelse. - La ER-1- og ER-2-reagensene likegyldiggjøre til romtemperatur (RT) før bruk.
- Beskytt oppløsningen mot lys ved å pakke inn et tomt sterilt 15 ml konisk rør med folie.
- I BSC, kort trykk på ER-1 hetteglasset for å bosette pulveret nederst.
- Tilsett 1 ml ER-2 buffer til hetteglasset, og overfør umiddelbart innholdet til bunnen av det 15 ml innpakkede konisk røret. Ikke pipette å blande. Fargen på løsningen som overføres til det koniske røret vil være rød.
- Gjenta trinn 5.1.6 3x. På den siste runden, cap ER-1 hetteglasset og inverterfor å samle eventuelle gjenværende pulver fra lokket, og deretter overføre løsningen til det koniske røret; dette vil bringe det totale volumet til 4 ml ER-1-løsning.
- Tilsett 6 ml ER-2-oppløsning til 4 ml ER-1-oppløsning i 15 ml konisk rør til en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/ml. ER-1 skal oppløses fullstendig i ER-2-oppløsningen.
- Overflateaktivering
- Bruk av en P200 pipette og en steril 200 μL filtrert pipettespiss, ta opp 200 μL ER-1-blandingen.
- Plasser pipetten i bunninntaket og skyv 20 μL ER-1-blandingen gjennom den nederste kanalen til blandingen begynner å strømme ut av det nederste kanaluttaket.
- Tilsett ca. 50 μL ER-1-blandingen og legg den i den øverste kanalinnløpet. Skyv blandingen gjennom den øverste kanalen til den starter strømmen ut av toppkanaluttaket.
- Fjern all overflødig ER-1-blanding fra overflaten av brikken ved skånsom aspirasjon. Kontroller at ER-1-blandingen bare fjernes fra chipoverflaten og ikke fra kanalene.
- Kontroller at kanalene er fri for luftbobler før ultrafiolett (UV)-aktivering. Hvis luftbobler oppdages, fjerner du bobler ved å vaske kanalen med ER-1-blandingen.
- Plasser den åpne parabolen som inneholder flisene i UV-lysboksen (levert av Emulate Inc.).
- Sett bryteren på baksiden av UV-lysboksen til "Konsekvent"-innstillingen. Slå på strømmen og start UV-aktivering. La sjetongene stå under UV-lys i 20 min.
MERK: Unngå eksponering av personell for UV-lys. - Fjern ER-1-blandingen fra begge kanalene.
- Vask hver kanal med 200 μL ER-2-oppløsning.
- Fjern ER-2 fra begge kanalene.
- Vask hver kanal med 200 μL steril kald Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS).
- La kald DPBS inne i kanalene til du går videre til neste trinn.
- Ekstracellulær matrise (ECM) forberedelse og belegg
- Forbered ECM-løsningen ved å kombinere de enkelte ECM-komponentene med kald DPBS, vann eller annet løsningsmiddel til de endelige arbeidskonsentrasjonene. ECM-løsningen skal tilberedes friskhver gang den brukes.
- Coat både topp og bunn kanaler av chip med ECM, med sammensetning som bestemmes av celletypen å bli seeded. ECM-blandingen må opprettholdes på is til bruk.
- Bruk laminin (50 μg/ml) til å belegge "hjernesiden", og kollagen IV og fibronectin blandet med et 4:1-forhold (320:80 μg/ml) for å belegge "blodsiden" som beskrevet i pkt. 5.6.
- Forberedelse av ECM aliquots
- Fortynn 1 mg/ml laminin i kaldt DPBS til en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml. Aliquot og oppbevar esus ved -20 °C til bruk.
- Oppløs kollagen IV i 0,1 % eddiksyre til en konsentrasjon på 1 mg/ml. Inkuber oppløsningen ved 2–8 °C over natten eller ved RT i 1-3 timer eller til den er fullstendig oppløst.
- Forbered en 1 ml blanding av kollagen IV:fibronectin (320 μL kollagen IV, 80 μL fibronectin, 600 μL sterilt dobbeltdestillert H2O). Blandingen kan lagres ved -20 °C.
- Belegg chips med ECM
- Fullt aspirer den kalde DPBS fra begge kanaler. Sett en P200 pipette til å ta opp 100 μL kollagen IV:fibronectin oppløsning.
- Introduser løsningen gjennom innløpet til en liten dråpe dannes på uttaket. La det være en liten dråpe på innløpet etter at pipettespissen er fjernet.
- Introduser lamininløsningen gjennom den øverste kanalinntaket til en liten dråpe dannes på uttaket. La det være en liten dråpe på innløpet etter at pipettespissen er fjernet.
- Se nøye på kanalene for å sikre at ingen bobler er til stede. Hvis bobler er til stede, vask kanalen med riktig ECM-løsning til alle bobler er fjernet.
- Gjenta trinn 5.5.1–5.5.4 for hver brikke.
- Tilsett 1,5 ml DPBS på lokket på et 15 ml konisk rør. Plasser DPBS-hetten i 150 mm kulturfatet med chips for å gi ekstra fuktighet og forsegle parabolen med parafilm. For best resultat, inkuber sjetongene ved 4 °C over natten.
MERK: Hvis ønskelig, celler kan sees samme dag som chip aktivering og ECM belegg, selv om overnatting inkubasjon er foretrukket. Chips kan være klar for seeding 4 h etter å ha lagt til ECM og inkubere chips på 37 °C.
6. Seeding "hjerneside" kanal og differensiere EZ sfærer i blandede nevrale kulturer
- Ta med parabolen som inneholder de tilberedte sjetongene til BSC. Vask begge kanalene forsiktig med 200 μL NDM.
- Unngå kontakt med portene, forsiktig aspirere overflødige mediedråper fra overflaten av brikken. Forsiktig agitercellesuspensjon før du ser hver chip for å sikre en homogen cellesuspensjon
- Seeding iNPCs inn i den øverste kanalen for å generere "hjernesiden"
- Frø cellene (1 x 106 celler / ml) inn i den øverste kanalen av brikken. Tilsett en P200-spiss som inneholder 30–100 μL celler suspensjon til den øverste kanalinnløpet og slipp forsiktig spissen fra pipetten. Ta en tom P200 pipette, trykk stempelet, sett inn i toppkanaluttaket og trekk forsiktig enkeltcellene soppheng gjennom brikken.
- Dekk parabolen og overfør til mikroskopet for å sjekke frøtettheten og homogen fordeling av celler i den øverste kanalen. Fjern pipettespissen forsiktig fra brikkeinntaket og utløpsportene.
- Seeding tetthet bør vises som 20% dekning. Hvis seeding tetthet en høyere eller lavere enn forventet eller ujevn, returnere sjetongene til BSC, vask kanalen 2x med 200 μL friskt medium, og gjenta trinn 6.3.1.
- Etter å ha bekreftet riktig celletetthet, plasser flisene umiddelbart i inkubatoren i 2 timer ved 37 °C etter seeding hver batch av chips. Vask bort cellene som ikke festes med frisk NDM.
- Hold celler under statiske forhold ved 37 °C med daglig NDM-erstatning i minst 48 timer før du initierer strømning. iBMECs kan seedes etter at iNPCer har festet eller på en påfølgende dag etter iNPC seeding.
7. Seeding iBMECs inn i den nederste kanalen for å generere "blodsiden"
- Ta med parabolen som inneholder de tilberedte sjetongene til BSC. Vask den nederste kanalen forsiktig med 200 μL EC-medium.
- Unngå kontakt med portene, forsiktig aspirerdråper av overflødig EC medium fra overflaten av brikken, og sørg for å forlate medium i begge kanaler. Forsiktig agitercellesuspensjon før du ser hver chip for å sikre en homogen cellesuspensjon.
- Bruk en P200 pipette, trekk opp 30–100 μL av iBMEC cellesuspensjon (14–20 x 106 celler/ml) og plasser spissen i innløpet til den nederste kanalen. Koble spissen forsiktig fra pipetten, og la den celleholdige spissen stå i innløpsporten.
- Trykk stempelet på en P200 pipette med en tom spiss, sett inn i bunnkanaluttaket, og trekk forsiktig enkeltcellesuspensjonen gjennom den nederste kanalen ved å slippe pipettstempelet langsomt.
- Aspirer overflødig cellesuspensjon fra overflaten av brikken. Unngå direkte kontakt med innløps- og utløpsportene for å sikre at ingen cellesuspensjon er aspirert ut av kanalene.
- Dekk brikken og overfør den til mikroskopet for å observere såingstetthet. Den nederste kanalen skal fylles uten observerbare hull mellom celler når den observeres ved 4x eller 10x under et mikroskop (Figur 4).
- Hvis seeding tetthet er under 90% dekning eller er ujevnt fordelt, justere celletetthet tilsvarende og gjenta trinn 7.2-7.6 til riktig tetthet er oppnådd i kanalen. Etter å ha bekreftet riktig celletetthet (figur 4),frøceller i de resterende sjetongene. For å feste celler på porøs membran, som ligger på toppen av den nederste kanalen, inverterhver chip og hvile i en chip vugge.
- Plasser et lite reservoar (15 ml konisk rørhette som inneholder steril dpbs) inne i 150 mm parabolen for å gi fuktighet for cellene. Inkubatorchips ved 37 °C i ca. 3 timer, eller til celler i den nederste kanalen er festet. Når iBMECs har festet (~ 3 h etter seeding), snu sjetongene tilbake til en oppreist posisjon for å tillate cellevedlegg til den nederste delen av den nederste kanalen.
8. Initiering av flyt
- Flow startes vanligvis 48 timer etter seeding av iBMECer. Denne gangen er nødvendig for iBMECs å feste fast til brikken.
- For å opprettholde lamimer gjennom brikken, er det viktig å degas og likevekttemperaturen i mediet. Medium må være pre-oppvarmet i en 37 °C vannbad i 1 time.
- Opptil 50 ml oppvarmet medium kan avgasses ved inkubasjon under et vakuumdrevet filtreringssystem i 15 min.
- Priming av bærbare moduler
- Sanitiser utsiden av den bærbare modulemballasjen og skuffene med 70% etanol, tørk og overføring til BSC. Åpne pakken og plasser modulene i skuffen. Orienter dem med reservoarene mot baksiden av skuffen.
- Pipette 3 ml pre-quilibrated, varme medier til hvert innløpsreservoar. Legg til EC kulturmedium til innløpsreservoaret på bunnkanalen og NDM til den øverste kanalinnløpsreservoaret på den øverste kanalen (figur 5).
- Pipette 300 μL pre-quilibrated, varme medier til hvert utløpsreservoar, rett over hver utløpsport (figur 5).
- Plasser opptil seks bærbare moduler på hver skuff. Ta skuffer til inkubatoren og skyv helt inn i kulturmodulen med bretthåndtaket vendt utover.
- Velg og kjør "Prime"-syklusen på kulturmodulen. Lukk inkubatordøren og la kulturmodulen prime de bærbare modulene (tar ~ 1 min). Grunnføringssyklusen er fullført når statuslinjen leser "Klar". Fjern skuffen fra kulturmodulen og ta den med til BSC.
- Kontroller at de bærbare modulene ble primet ved å inspisere undersiden av hver bærbare modul i BSC. Se etter tilstedeværelsen av små dråper på alle fire porter.
- Hvis en bærbar modul ikke viser dråper, kjører du prime syklusen på disse modulene på nytt. Hvis noen medier dryppet på skuffen (dette kan forekomme oftere av utløpsportene), rengjør brettet med 70% etanol.
- Tilkobling av brikker til bærbare moduler, regulering og initiering av flyt
- Vask forsiktig begge kanalene på hver chip med varmt, likevektisert cellespesifikt kulturmedium for å fjerne eventuelle bobler i kanalen og plassere små dråper med medier (i henhold til media i kanalen) på toppen av hvert innløps- og utløpsport.
- Sett brikker med bærere inn i de bærbare modulene og plasser opptil seks på hver skuff. Sett skuffene inn i kulturmodulen. Programmer de riktige organchip kulturforhold (strømningshastighet og strekk) på kulturmodulen.
- Programmerte forhold vil starte så snart "Regulere" syklusen er fullført.
MERK: Strømningshastighetene for hver kanal kan styres uavhengig og kan settes til hastigheter som varierer fra 0–1000 μL/t. BBB-brikken er vanligvis dyrket ved 30 μL/t. Når du strømmer medier som EC-medier eller ESM ved henholdsvis 30 μL/time og 1000 μL/t, er skjærkreftene henholdsvis 0,01 dyn/cm2 og 0,33 dyn/cm2. - Kjør "Regulere" syklus, som tar ca 2 timer, hvoretter kulturmodulen vil begynne flyten på de forhåndsinnstilte organchip kulturforhold.
9. Blod-til-hjerne paracellulær permeabilitet vurdering
- Klargjør NDM supplert med 10 μg/ml dextran-FITC (4 kDa). Denne løsningen vil bli brukt som inngang for "blodsiden" -kanalen.
- Fyll bunnkanalreservoarene til de bærbare modulene med NDM supplert med dextran-FITC. Fyll toppkanalreservoarene med NDM uten luftrør.
- Perfuse begge, de øverste og nederste kanalene med en strømningshastighet på 30 μL / t i minst 4 timer til nok media akkumuleres for vurdering av fluorescens i en plateleser (vanligvis 100 μL).
- Samle inn medieprøver fra inngangs- og utgangsreservoarene til topp- og bunnkanalene. Beskytt prøvene mot lys.
- Fortynn NDM supplert med 10 μg/ml dextran-FITC 1:1 ved hjelp av NDM uten tracer for å generere en kalibreringskurve på 10–12 punkter.
- Ta 100 μL av hver prøve, inkludert kalibreringskurven, inn i en svart 96 brønnplate og les fluorescens ved hjelp av en plateleser (485 nm eksitasjon, 530 nm-utslipp).
- Bruk de målte verdiene til å beregneP-appverdier på følgende måte:
- Ta daglige målinger for å vurdere barriereegenskapene og bekrefte at BBB-brikken fortsatt er funksjonell.
10. Immuncytokjemi
- Ta med chips til en kjemisk røykhette. Bruk en P200 pipette til å fikse celler ved å lese begge kanalene med 200 μL med 4 % paraformaldehyd (PFA) i DPBS og inkuberi1 i 10 min ved RT.
- Etter fikseringen, perfuse hver kanal med 200 μL DPBS og inkubator i 5 min. Gjenta DPBS vask2x.
- Blokker og permeabilize celler på chip ved å lese primær blokkering løsning (PBS, supplert med 5% normal esel serum og 0,1% Triton X-100). Inkuber på RT i 1 t.
- Fortynn primære antistoffer i primær blokkeringsoppløsning og inkuber over natten ved 4 °C. BMECs markører er GLUT-1 (1:100 fortynning), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) og VE-kadherin (01:200). Nevrale markører er βIII-tubulin (1:1000; Tuj1α), S100β (1:500), nestin (1:1000) og GFAP (1:1000).
- Vask chips 3x med kald DPBS.
- Fortynn sekundære antistoffer i sekundær blokkeringsoppløsning (DPBS med 5 % normalt eselserum uten Triton-X).
- Tilsett den sekundære antistoffløsningen gjennom begge kanalene. Vanligvis fortynnes fluorescerende sekundære antistoffer 1:1000. Inkuber i 1 t ved RT beskyttet mot lys.
- Vask sjetongene 3x med DPBS.
- Flekkcellekjerner ved å lese chip med 100 μL DAPI-oppløsning. Inkuber ved RT i 5 min.
- Vask sjetongene 3x med DPBS.
- Brikken er klar for bildebehandling ved hjelp av enten en oppreist eller et omvendt fluorescerende mikroskop. PDMS-gjennomsiktigheten tillater bildebehandling i den intakte organbrikken. Forstørrelser over 10x kan kreve lange arbeidsavstandsmål på grunn av tykkelsen på organbrikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6A,B,C representerer en BBB chip seeded med EZ-kuler på "hjernesiden" toppkanal og iBMECs på "blodsiden"" bunnkanal. iBMECs ble seeded først og lov til å feste over natten, hvoretter EZ-sfærer ble seeded. Chips ble deretter kultivert under statiske forhold med daglig medieerstatning i syv dager. BBB-brikken ble deretter fikset ved hjelp av 4% PFA ved RT i 10 min og vasket 3x med DPBS. Immuncytokjemi ble utført på BBB-chipen ved hjelp av 1) nestin som markør for nevrale stamceller, 2) S100β eller GFAP som markører for astrocytter og 3) βIII-tubulin som markør for nevroner. GLUT-1 og Pecam-1 ble brukt som markør for BMECs. Imaging ble utført på 20x ved hjelp av en confocal mikroskop og bilder ble behandlet ved hjelp av Fiji for ImageJ programvare.
Figur 6D representerer en paracellulær permeabilitetsanalyse som ble utført på organchips befolket med iBMECs og EZ-sfærer, iBMECs alene (uten EZ-sfærer), eller EZ-sfærer alene (uten iBMECs). Etter en "Regulere" syklus, en 4 kDa Dextran-FITC tracer ble lagt til reservoaret på "blodsiden" til en endelig konsentrasjon på 10 μg / ml, og chips ble perfundert ved 30 μL / t over natten. Deretter ble media samlet inn fra innløps- og utløpsreservoarer av både topp- og bunnkanaler. 100 μL av hver prøve ble samlet inn og undersøkt for fluorescens ved hjelp av en plateleser.
Viktigere, en 1:1 kalibreringkurve ble brukt til å forvandle fluorescensverdier til konsentrasjonsverdier av Dextran FITC. Verdier ble deretter brukt til å beregne permeabilitet(P-app). Disse resultatene viser at iBMECs danner funksjonelle barriereegenskaper, som strammes ytterligere når iBMECer er co-kultivert med EZ-sfærer. Chips kultivert med EZ-sfærer bare, ikke klarer å danne en barriere. En lignende tilnærming kan brukes til å undersøke transport av etmolekyl over BBB-chipen, avhengig av en tilgjengelig målemetode (f.eks. fluorescens, ELISA eller massespektrofotometri).
Figur 1: Skjematisk av iPSC-baserte BBB-chip. Før seeding på brikken, iPSCs er differensiert i kulturplater i (i) EZ-sfærer (nevrale stamceller, iNPCer), som dyrkes i suspensjon som kuler, og inn i (ii) hjernen mikrovaskulærendotelceller (iBMECs). EZ-kuler er dissosiert i enkeltceller, seeded på den øverste kanalen av orgelbrikken, hvor de ytterligere differensierer til blandede nevrale kulturer for å danne "hjernesiden". iBMECs er seeded i den nederste kanalen av orgelbrikken for å danne en blodkarlignende struktur på "blodsiden". Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk av den øverste visningen av brikken i chip bæreren, med merkede porter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flytskjema for iPSC-basert BBB-chipforberedelse og arbeidsflyt. Pre-differensiering av både nevrale og endotelceller fra iPSCer er nødvendig før initiering av arbeidsflyten. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Seeding av iBMECer i den nederste kanalen. Brightfield bilder av iBMECs seeded i den nederste kanalen (A) umiddelbart etter seeding eller (B) 24 h post-seeding, etter at cellene har festet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Skjematisk av den tilkoblede brikken og den bærbare modulen med merkede innløps- og utløpsmediereservoarer. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representative resultater. Immuncytokjemi på iPSC-baserte BBB-chip 7 dager etter seeding. EZ-kuler differensiert til en blandet nevrale cellepopulasjon i den øverste "hjernesiden" kanal, inkludert (A) S100β + (grønn) astrocytter, Nestin + (rød) nevrale stamceller samt (B) GFAP + (rød) astrocytter og βIII-tubulin + (rød) nevroner. Skala stenger = 200 μm. (C) iBMECs seeded i bunnen "blodside" kanal uttryktglut-1 og (grønn) PECAM-1 (CD31, rød). Skalabar = 200 μm. (D) Evaluering av BBB-chippermeabilitet ble utført ved å legge dextran-FITC (4 kDa) inn i reservoaret på den nederste kanalen. Resultatene viser at organbrikker seeded med iBMECs og EZ-kuler viser en stram barriere sammenlignet med organchips seeded med iBMECs alene (* p < 0,05). Organchips seeded med EZ-kuler alene viser ingen barriereegenskaper (*** p < 0,001; enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligninger test). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinasjonen av organ-on-chip-teknologi og iPSC-avledede celler i NVU holder løfte om nøyaktig modellering av det menneskelige BBB. Her gir vi en detaljert protokoll for enkel og robust anvendelse av den nylig publiserte iPSC-baserte BBB-chip16. En oversikt og tidspunkt for frøing paradigme er vist i figur 3. For å oppnå og vedlikeholde barrierefunksjoner som er egnet for BBB-modellering, er det avgjørende å generere en homogen iBMEC monolayer og beholde integriteten. Det første trinnet mot generering av et funksjonelt monolayer inkluderer kjemisk aktivering av den ikke-polare PDMS-overflaten som gjør det mulig å feste ECM-proteiner. Overflateaktiveringsreagensene brytes raskt ned ved rekonstituering, noe som til slutt kan føre til suboptimal tensing av celler. Det er derfor viktig å holde reagensene friske og beskyttet mot lys gjennom hele prosessen.
Under UV-aktivering (avsnitt 5.2) må reagenser fordeles jevnt i hver kanal for å oppnå konsistent ECM-belegg og homogencellevedlegg. ECM komposisjoner og konsentrasjoner som er gitt i denne protokollen ble optimalisert til de spesifikke typer celler(dvs. iBMECs og EZ-sfære-avledede nevrale stamceller). Endring av cellesammensetning er mulig, men kan kreve differensial ECM-forhold, noe som vil kreve optimalisering. Etter ECM-belegg er det avgjørende å frø iBMECs riktig. Høy cellesåingstetthet (>14 x 106 celler/ml) er avgjørende for å få et komplett monolayer. Hvis du ikke oppnår full cellesamflyt, anbefales det å ytterligere øke tettheten av cellesuspensjonen opptil 20 x 106 celler/ml under seeding.
Laminar flyt ble tidligere foreslått å forbedre iBMEC modning15 og er uunnværlig for å oppfylle fordelene som tilbys av mikrofluidic plattformen. Mikrobobler som strømmer gjennom rørene på brikken kan imidlertid fysisk stresse og løsne hjemmehørende celler, noe som kan føre til ødeleggelse av BBB-chipintegriteten. For å unngå mikrobobledannelse under laminarstrømning, er det avgjørende å likegyldighet mediet før perfusjon startes. Likevekt krever pre-oppvarming og avgassing av mediet før bruk.
Genereringen av personlige sjetonger er gjort mulig ved hjelp av både menneskelige iPSC-avledede iBC-er og iNPCer. Mens differensiering av iBMECs er kort og ganske enkel24,22, differensiering av iPSCer i nevrale celler21,25 er mer utfordrende. Imidlertid kan nevrale celler som bor i "hjernesiden" av brikken erstattes av en hvilken som helst nevrale celletype, for eksempel primære nevrale celler eller iPSC-avledede motornevroner16. På samme måte som "bona fide" endotelceller, viser iBMECs plastisitet i genuttrykk som svar på forskjellige nevrale co-kulturer. Dermed kan denne fleksibiliteten føre til fremtidig utvikling av ulike NVUer på brikken. Ekstra fleksibilitet i systemet kan oppnås ved å justere cellesåingstidspunktet og -rekkefølgen. iBMECs kan seedes før eller etter nevrale celler, noe som gjør det mulig å frø iBMECs umiddelbart etter seeding og vedlegg av nevrale celler, eller etter EZ-kuler har differensiert til mer modne nevrale kulturer i chip miljøet. Dette er av særlig betydning, gitt den umodne naturen til iPSC-avledede nevrale celler. Gitt at EZ-kuler er tidlige nevrale forfedre, kan lengre differensieringsperioder også føre til økt prosentandel av astrocytter og nevroner.
En komponent som mangler fra protokollen er perivaskulære pericytes, som gir en avgjørende komponent i den fysiologiske NVU. Nylige fremskritt i iPSCs differensiering i pericyte-lignende celler26,27 vil tillate innføring av denne ekstra celletypen, og dermed gi en forbedret kopi av BBB samtidig som den bevaresin personlige natur.
IBMECs har tidligere vist seg å demonstrere ulike egenskaper som er avgjørende for BBB-modellering, inkludert uttrykk for mobilmarkører, etablering av TEER og funksjonell aktivitet av efflux pumper28,24,5. Molekylære analyser har imidlertid vist at disse cellene også uttrykker flere epitelmarkører15. Fremskritt i iBMEC generasjon som viser forbedret funksjon og endotelmarkør uttrykk har nylig blitt beskrevet29,30. Etter paradigmet som presenteres her, kan disse potensielt forbedrede cellene enkelt innlemmes i BBB-chipmodellen for fremtidige applikasjoner. Den fleksible, men robuste plattformen som er beskrevet her, kan legge til rette for både sykdomsmodellering og utvikling og vurdering av nye CNS-legemidler.
Selv om denne protokollen er avhengig av et bestemt kommersielt tilgjengelig produkt, tilbyr flere kommersielle selskaper ulike mikrofysiologiske plattformer, som kan tilby alternative fordeler31. I tillegg er protokoller for "internt" produksjon av mikrofluidiske organbrikker også tilgjengelig32 og kan tilby mer modularitet, inkludert integrering av TEER-elektroder17, som mangler fra plattformen som brukes her.
Organ-on-chips ble introdusert som en alternativ tilnærming for å forbedre den fysiologiske konteksten av nåværende cellekulturer33. Anvendelsen av denne teknologien krever imidlertid spesialiserte ingeniørferdigheter, som ofte mangler i biologisk orienterte laboratorier. En kommersielt tilgjengelig chip plattform, slik som den som er ansatt her, gir mindre modularitet og økt robusthet og reproduserbarhet, som kan brukes av et bredere spekter av brukere. Videre er anvendelsen av lamimerstrømning på en mikrofluidisk chip avhengig av bruk av sprøyte eller peristaltiske pumper, noe som introduserer et annet nivå av kompleksitet. Dette hinderet er nå lettere å overvinne med anvendelsen av kulturmodulen, noe som letter samtidig perfusjon av flere chips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Cedars-Sinai eier en minoritetsaksjeinteresse i Emulate, selskapet som produserer studiens mikrofluidiske organchips. En offiser i Cedars-Sinai sitter også i Emules styre. Emulering ga ingen økonomisk støtte til denne forskningen. Cedars-Sinai og Emuler har patenter arkivert knyttet til dette arbeidet.
Acknowledgments
Vi vil takke Dr. Soshana Svendsen for kritisk redigering. Dette arbeidet ble støttet av Israel Science Foundation stipend 1621/18, Ministry of Science and Technology (MOST), Israel 3-15647, California Institute for Regenerative Medicine grant Disc1-08800, Sherman Family Foundation, NIH-NINDS stipend 1UG3NS105703, og ALS Association stipend 18-SI-389. AH ble finansiert av Wallenberg Foundation (stipendnummer 2015.0178).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
References
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
- Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
- El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
- Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
- Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
- Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
- Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
- Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
- Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
- Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
- Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
- Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
- Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
