Summary
I detta protokoll beskriver vi procedurer för att kvalitativt och kvantitativt analysera utvecklingsfenotyper hos möss som är associerade med medfödda hjärtfel.
Abstract
Medfödda hjärtfel (CHD) är den vanligaste typen av missbildning hos människor, som påverkar upp till 1% av alla levande födda. De bakomliggande orsakerna till chd är dock fortfarande dåligt förstådda. Den utvecklande musen utgör en värdefull modell för studiet av CHD, eftersom hjärt utvecklingsprogram mellan möss och människor är mycket bevarade. Protokollet beskriver i detalj hur man producerar musembryon av önskat graviditetslängd, metoder för att isolera och bevara hjärtat för nedströmsbearbetning, kvantitativa metoder för att identifiera vanliga typer av CHD genom histologi (t.ex. Ventrikulärt septal defekter, förmaksflimmer septal defekter, patent ductus arteriosus), och kvantitativa histomorphometry metoder för att mäta vanliga muskulös packning fenotyper. Dessa metoder artikulera alla steg som deltar i provberedning, insamling och analys, så att forskarna kan korrekt och reproducerbart mäta CHD.
Introduction
ChDs är den vanligaste typen av missbildning hos människor och är den främsta orsaken till missbildningsrelaterade dödsfall1,2,3,4,5,6. Även om cirka 90% av nyfödda barn överlever CHD, är det ofta förknippas med betydande sjuklighet och medicinska ingrepp under åren, vilket innebär en tung börda för patienternas liv och hälso-och sjukvårdssystemet7,8,9,10. Utanför rent genetiska faktorer, orsakerna till CHD är dåligt förstådda4. Oidentifierade orsaker står för ~ 56-66% av alla CHD fall enligt American Heart Association och andra källor2,3,4,11. Välkända faktorer inkluderar genetiska mutationer, CNVs, de novo single nucleotide varianter och aneuploidy. Man misstänker att miljö- och kostfaktorer också är viktiga källor som bidrar till CHD, vilket föreslagits av epidemiologiska studier som kopplar samman moderns livsstil2,12, ekonomisk fattigdom och ras13, och genom forskning om kostfaktorer som folsyra11,14 och bioaktiv lipidretinsyra15,16. Att undersöka mekanismer och orsaker till CHD och andra kardiovaskulära defekter är viktigt att utveckla förebyggande strategier och nya terapeutiska alternativ1,4,17,18,19.
Den utvecklande musen är en hörnstensmodell för att studera CHD hos däggdjur. Men några av de metoder och analyser som används, såsom dissektioner bevara hjärtmorfologi, analys av utvecklingsstadier, och identifiering av CHD-associerade defekter, kan vara skrämmande för forskare som är nya för analys av murine hjärtan. Målet med de metoder som beskrivs i detta protokoll är att erbjuda kvalitativa och kvantitativa riktlinjer för dessa processer. Således, i detta protokoll förklarar vi hur man utför tidsbundna parningar för att producera embryon från önskat graviditetslängd, dissekera gravida kvinnor för intakt hjärtåterhämtning (inklusive tillhörande vävnader såsom utflödeskanalen), hjärtfixering och förberedelse för kryostat snittning, grundläggande histologi metoder, kvantitativa analyser av vanliga hjärtfel, och kvalitativ analys av hjärtmuskelpackning, en gemensam föregångare fenotyp till vissa typer av CHD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur som används i de experiment som refererades i detta dokument behandlades med hjälp av riktlinjerna för djurvård från Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Tidsbegränsad parning av C57BL6/J möss för embryoproduktion
- När möss har uppnått häckningsålder (6-8 veckor), sätta ihop dem i harem avelformat (dvs. två honor per en hane). Ställ upp dem för avel någon gång på eftermiddagen eller kvällen.
OBS: Möss häckar ofta inom 1 h efter att lamporna har stängts av i deras bostadsanläggning. Honorna bör dras tillbaka från avel vid ca 6-8 månader och hanar bör användas senast 12 månaders ålder. - Om du använder invägningsmetoden för att bestämma befruktning, avla möss i stora grupper, eftersom invägningsmetoden gör att tidstidaparning fortsätter i långsammare takt än metoder där endast copulationspluggar övervakas.
- Nästa morgon, kontrollera om copulation pluggar någon gång mellan 8:00 till 12 pm. Se till att detta görs vid rätt tidpunkter. Om plugganalysen utförs tidigare än 08:00 finns det en risk att kontakten är för djup i vaginalkanalen för att observeras. Om kontaktanalysen utförs senare än 12.00 finns det risk för att kontakten har fallit ut.
- Ta tag i honan vid basen av svansen och undersöka öppningen till vaginalkanalen med hjälp av en micropipette spets. En copulation plugg kommer att se ut som en slemhinnor barriär(figur 1A),vilket kan vara lite svårt att se i vissa fall. Crustiness är också en indikation på att en copulation plugg är eller var närvarande. Om det inte finns någon slemhinnor barriär (figur 1B) då honan sannolikt inte har parat eller copulation kontakten kunde redan ha fallit ut.
- Se på morgonen av copulation som e0.5.
OBS: Med C57BL6/J möss kan copulationpluggar vara svåra att identifiera. Därför, ibland mösspar även om ingen plugg observerades. Copulation leder inte alltid till befruktning. Detta är ofta mer sannolikt i C57BL6/J möss. Övervaka därför viktprogressionen för att bekräfta graviditet (se steg 1.4). Vägning ins kan hjälpa till att identifiera kvinnor som är gravida och bekräfta att pluggar ledde till befruktningen. Var försiktig när parning kvinnor för på varandra följande nätter. Om en viss hane observeras vara bra på att producera en copulation plugg, att hanen kan lita på att para sig i följd nätter med samma hona. - Tänk på att chanserna för graviditet är högre med möss som är beprövade uppfödare, eftersom de framgångsrikt har fötts upp tidigare. För att öka chanserna att ha beprövade uppfödare, de män som används bör inte vara för gammal.
- Efter kontaktanalysen väger du honorna. Denna vägning bör följas upp 7-10 dagar senare. Om viktökning överstiger 1,73 g, då musen är sannolikt gravid20. Om viktökning är lägre än 1,73 g, är det sannolikt inte relaterat till graviditet och musen bör återinföras till avelpopulationen.
OBS: C57BL6/J möss producerar små kullar (fem till sex embryon i genomsnitt). Väga in metoder för att bestämma graviditet är korrekta för de flesta. Med denna metod ger en 12,8% falsk positiv frekvens och kommer att utesluta 3% av kvinnor som faktiskt är gravida20. Om forskaren är orolig för att önskad graviditetstid senare, fortsätt till steg 1.5 - Valfritt: Den dag då dissekeringen kommer att äga rum, se till att graviditeten har utvecklats genom fysisk inspektion. Ta tag i honan vid basen av svansen och sträcka ut kroppen. Detta är lättast att göra genom att placera musen på handleden och försiktigt dra basen av svansen. Om honan är gravid, då det sannolikt kommer att finnas viktökning specifikt i den nedre bålen, och det kommer att visas som små klumpar.
OBS: Graviditet kan vara påtaglig så tidigt som e12.5 och kommer att vara påtaglig av e14,5 i de flesta fall. C57BL6/J möss har små ströstorlekar, därför kan honan vara gravid även om det inte finns några fysiska tecken.
2. Dissekering av kvinnor och embryon för hjärtåterhämtning
- Förbered följande lösningar före dissekeringens början.
- Lös upp etylendiamintetraacetinsyra (EDTA) till fosfatbuffrad saline (PBS) vid en koncentration på 0,5 mM.
OBS: När den har förberetts är det bättre att hålla lösningen på is och endast använda den vid 4 °C. Om kontaminering är ett problem, bör det autoklavas före användning. - Lös paraformaldehyd (PFA) i PBS vid en koncentration på 4 %.
OBS: När den har förberetts är det bättre att hålla lösningen på is och endast använda den vid 4 °C. Förvaras vid 4 °C eller kallare för långtidsförvaring. Koncentrationen av PFA-lösningen kan variera beroende på vävnadsprovernas nedströmstillämpningar. Denna procentsats används för hematoxylin och eosin färgning, immunohistochemistry, och immunofluorescerande färgning.
- Lös upp etylendiamintetraacetinsyra (EDTA) till fosfatbuffrad saline (PBS) vid en koncentration på 0,5 mM.
- När honan har nått önskat graviditetslängd skede, musen bör avlivas vid rätt tidpunkt på dagen enligt de godkända riktlinjerna för djuranvändning. Om tidstiderna är på halvdagen (t.ex. e15,5) bör de offras nära 12.00. Om tidstiderna är på hela dagar (t.ex. e15,0) bör de offras nära 12.00.
OBS: Befruktningen antas inträffa nära midnatt under natten mössen paras ihop. Det är dock svårt att bestämma den exakta tidpunkten för befruktningen. På grund av detta uppskattas tidpunkten, inte exakt. - Efter att ha fäst de fyra lemmarna ner, gör noggrant ett I-format snitt längs bålen, med början från runt urinröret upp mot bröstbenet.
- Livmodern kommer sannolikt att ligga strax ovanför bäckenregionen. Muslivmodern är Y-formad; därför kommer det sannolikt att vara mycket lång och lindad runt bålen. Ta bort den genom att försiktigt lyfta den. Gör detta med hjälp av sidorna av fina pincett i en skopa rörelse. De ytliga vävnaderna i livmodern kan gripas mycket noggrant av de fina pincettens spetsnär de först drar ut livmodern. Använd sax för att skära livmodern från kroppen.
OBS: Med tanke på den ovanliga Y-formade av livmodern, se till att hela livmodern tas bort. - Blötlägg livmodern i iskalla PBS. Nåla ena änden av livmodern ner och sträck ut den i en enda linje.
- Skär livmodern i sektioner, varje avsnitt som innehåller ett separat embryo. Skala försiktigt ut embryot med fina pincett. Detta är lättast att göra med ett par pincett i varje hand. Placera embryot omedelbart i en ny Petriskål fylld med PBS-EDTA-lösning vid 4 °C.
OBS: Normal PBS-lösning kan också användas, men EDTA förhindrar koagulation i proverna. - Arrangera embryona med Theiler Staging21. Eftersom iscensättning kan variera mellan embryon i en enda kull, steg varje enskilt embryo.
OBS: Detta kan också ge framsynthet i eventuella medfödda hjärtfel i embryona. Typiskt, symtom på en medfödd hjärtdefekt kan observeras i embryonala morfologi. Andra stora defekter som ofta förknippas med vissa hjärtproblem kan förekomma. - Hjärtat kan avlägsnas på olika sätt beroende på embryots ålder.
OBS: Om det är oklart om utflödeskanalen kommer att förbli intakt under avlägsnandet, antingen ta bort fler vävnader än enbart hjärtat (hålla utflödeskanalen intakt och minimera direktkontakt mellan hjärtat och pincetten) eller analysera hela embryot.- Med hjälp av en dissekering omfattning och två par fina pincett, placera embryot på ryggen och stabilisera tillgången till bröstet. Detta kan göras genom att antingen fästa armarna ner med pinps eller ta bort armarna och hålla bålen i position.
- Använd den skarpa punkten i ett andra par fina pincett för att göra ett snitt längs embryots bröstben och sträcka sig mellan nyckelbenen till naveln. Börja med att göra mycket fina och ytliga snitt samtidigt gradvis arbeta mot insidan av brösthålan. Hjärtat ska knappt bli synligt. Kontakta den inte med pincetten under dessa ytliga snitt.
- Skala bröstkorgen öppen med hjälp av det första paret pincett för att försiktigt pressa på embryots överkropp, något caudal till bröstkorgen. Hjärtat ska dyka upp eller bli uppenbart. Hjärtat kan kräva några milda lirka att komma ut. Använd sidan av pincett, se till att poängen med pincett aldrig kommer i kontakt med hjärtat. För att hålla arbetsytan och pincett rena, håll en luddfri torka i närheten.
- Försiktigt ta tag i lungblodkärlen med sidorna av pincett, se till att inte bryta vävnaden, och dra hjärtat ur brösthålan. Rengör hjärtat då.
ANMÄRKNING: För embryon e13.5 och yngre täcks hjärtat av hjärtsäcken. Detta måste tas bort för att nå hjärtat.
- Ta ett fotografi av hjärtat för senare referens med ett stereoscope.
- Skölj hjärtana i PBS-EDTA-lösningen i 1-2 min och placera dem sedan i 4% PFA-lösning i ca 45-60 min för att fixa dem. Om analys av hela embryot önskas, blöt över natten. Volymen av PFA-lösningen bör vara 5-6x volymen av vävnaden som fixeras.
OBS: Denna inkubationstid kan variera beroende på de senare studierna. Denna inkubationstid används för hematoxylin och eosin färgning, immunohistochemistry och immunofluorescerande färgning. - Tvätta 5-10 min med PBS-glycin 3x och placera tillbaka i PBS. Natriumazid eller penicillin/streptomycin kan också tillsättas för att minimera bakterietillväxt och bevara intakta vävnader. Hjärtana kan nu lagras på kort sikt vid 4 °C.
3. Vävnadsberedning
OBS: Vävnader kan antingen beredas med oct (optimal skärtemperatur) inbäddning eller paraffininbäddning. Det finns fördelar och nackdelar med någon av metoderna och målet med analysen bör beaktas vid beslut om vilken inbäddningsmetod som ska användas.
- OKT inbäddning
OBS: Denna metod kan vara att föredra framför formalin/paraffininbäddning eftersom kryosektioner bevarar antigenreaktivitet, fortfarande kan användas för hematoxylin och eosinfärgning och producera skivor snabbare.- Förbered en lösning av sackaros upplöst i PBS vid en koncentration på 30 % (w/v).
- Överför vävnaderna till ett nytt 15 mL koniskt rör eller 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller PBS-30% sackaros. Inledningsvis kommer vävnaden att flyta.
- Placera den vid 4 °C i kylen. Vävnaden kommer att vara redo för OCT inbäddning när den sjunker till botten av röret, vanligtvis i 24-40 h.
OBS: Muskelvävnader lider betydligt under frys / tina cykler och förlorar sin inhemska morfologi. Sackaros absorberas av vävnaden och fungerar som ett kryobevarande medel som möjliggör förbättrad bevarande av morfologi. Se till att det finns tillräckligt med lösning i röret för att de flytande vävnaderna ska övervakas tillräckligt. PBS-sackaros är lätt förorenad med bakterier, så kontrollera lösningen ofta för grumlighet, vilket indikerar antingen svamp eller bakteriell överväxt. För att minimera risken för kontaminering kan antingen penicillin/streptomycin eller natriumazid läggas till PBS-sackaroslösningen. - Ta bort hjärtan med en Pasteur pipett, se till att öppnandet av pipetten är tillräckligt bred för att inte riva vävnaden. Skär pipetten med sax om det behövs. Om du arbetar med hela embryon, använd pincett för att hämta provet.
OBS: Gör detta försiktigt. Även om pipettöppningen är tillräckligt bred för att hämta hjärtan, kan pipettens kanter fortfarande riva vävnaderna. Pincett kan dra in vävnadsprover om de används för aggressivt. - Kort låt vävnaden lufttorka på en luddfri torka. Placera provet i en OCT-form i önskat läge för skärning (dvs. sagittal, tvärgående, koronal). Tillsätt OCT förening tills provet är helt nedsänkt, se till att det inte finns några bubblor i kontakt med vävnaden.
- Placera formen på -20 °C över natten eller flera dagar och flytta sedan formen till -80 °C. Efter 24 h formen är redo för cryosectioning. Vävnader i det här formatet kan lagras på lång sikt.
- Paraffin Bäddning
- Med hjälp av etanol, torka vävnaderna i denna följd: 50% etanol i 10 min, 70% etanol i 10 min, 80% etanol i 10 min, 95% etanol i 10 min, 100% etanol i 10 min (gör detta 3x).
- Blötlägg vävnaderna i en serie etanol/xylenlösningar i denna följd: 2:1 etanol/xylenlösning i 10-15 min, 1:1 etanol/xylenlösning i 10-15 min, 1:2 etanol/xylenlösning för 10-15 min, 100% xylen i 10-15 min (gör detta 3x).
- För att ersätta xylen med paraffin, blötlägg vävnaderna i en vakuumugn (ställ mellan 54-58 °C) i denna följd: 2:1 xylen/paraffinlösning i 30 min, 1:1 xylen/paraffinlösning för 30 min, 1:2 xylen/paraffinlösning i 30 min, 100% paraffin för 1-2 h, 100% paraffin för 1-2 h eller över natten.
OBS: Uppvärmning av vävnaderna efter 60 °C under längre tidsperioder gör att paraffinpolymererna försämras och vävnaden blir spröd. - Använd färsk paraffin, bädda in vävnaderna i önskat läge.
4. Kryostat snittning för OCT inbäddade vävnader
- Vid kryostaten placerar du alla prover i minst 1 h om proverna tidigare förvarades i frysen -80 °C. De bör stanna där tills alla sektioner har samlats in.
- Se till att kryoton är inställd på rätt temperaturinställningar. Miljötemperaturen inne i kryostatkammaren bör vara vid ca -20 °C och kryostatens arm ska vara ca -24 °C.
Obs: Denna temperatur kan variera beroende på hur blocket reagerar på skivning. Om inkonsekvent skivning är ett problem kan temperaturen i miljön sänkas. - Ta bort OCT blocket från sin form genom att dra i kanterna på den öppna sidan av formen för att lossa den och sedan nypa blocket i den stängda änden, där formen smalnar.
- För att montera OCT-blocket placerar du rumstemperaturen OCT på chucken, från mitten och arbetar till kanten. Hela chucken behöver inte täckas.
- Placera OCT-blocket (se steg 3.1) på formen. Kanten av blocket som var mot den stängda sidan av formen bör vara vänd uppåt på chucken. Låt ULT på chucken frysa tills den är ogenomskinlig vit, ca 5-10 min.
- Placera chucken på armen i ytterligare 5-10 min för blocket att komma till armen temperatur. För att få en parallell skiva, justera armen tills kanten av blocket är parallell med scenen och det finns ett jämnt avstånd mellan scenen och den nedre kanten av blocket är samma som scenen och den övre kanten av blocket.
- Sätt i bladet och justera avståndet för blocket från bladet för att ta sektioner.
- Ta skivor med en tjocklek av 10 μm. Håll skivningen tills intressepunkten nås antingen manuellt eller med trimfunktionen.
- För att samla skivor, använd en liten platt pensel och en detaljborste. När formen börjar skäras, använd den platta borsten för att försiktigt dra skivan mot stativet. Vid skärning genom provet måste rörelsen vara kontinuerlig och utan paus, även om hastigheten kan bero på provets fasthet.
- Medan du skär, använd den platta borsten för att försiktigt styra skivan när den görs. Skivan behöver inte vara i jämnhöjd med scenen på denna punkt, så låt den bölja att inte orsaka tårar eller drar och påverka histologi.
OBS: Vid skivning av hela embryon kan denna del vara särskilt svår, särskilt när du byter vävnadstyper. Se till att skivorna är gjorda utan pauser och att borsten inte drar på skivorna för aggressivt. När vävnadstyper förändras kan skivan gå sönder, så att hålla temperaturen kall är nyckeln. Om brytning är ett problem, minska temperaturen eller öka tjockleken på provet. - Pausa blockets rörelse när provet är helt genomsett, men segmentet är inte fritt från blocket ännu. Utan att flytta den platta borsten från skivan, använd detaljborsten för att klappa skivan ner för att göra den platt och frysa mot scenen.
- Håll skivan där för ~ 10 s innan du tar bort detaljpenseln och avslutar segmentet. Använd de två penselrna för att försiktigt platta till skivan mot scenen, förhindra rullande och håll den mot scenen för ~20-30 s.
- Vänd skivan och platta mot scenen igen. Flytta en elektrostatiskt laddad bild tillräckligt nära för att segmentet ska lockas och fäst bilden utan att behöva röra bilden till scenen. Märk bilderna med en penna.
- Förvara rutschkanorna i en lufttät låda för att skydda vävnaderna från isuppbyggnad under förvaring. För korttidsförvaring bör glidbanor förvaras vid -20 °C innan färgning. För långtidsförvaring hålla dem på -80 °C.
5. Mikrotome snittning för paraffin inbäddade vävnader
- Placera blocken på isen före snittningen för att kyla proverna. När svalna, paraffin skivor lättare och kan producera tunnare skivor.
- Förbered ett 40-45 °C vattenbad med ultrarent vatten.
- Lägg bladet i hållaren i mikrotomen. Se till att den är säker och ställ sedan in frigångsvinkeln. Se till att frigångsvinkeln är korrekt. Detta kan kontrolleras enligt tillverkarens anvisningar.
- Placera paraffinblocket i mikrotomen. Se till att den är korrekt orienterad så att bladet skär rakt över blocket.
- Se till att bladet är korrekt orienterat med blocket genom att göra ett par skivor. Gör detta noggrant så att justeringar kan göras.
- Trimma blocket tills intressepunkten har uppnåtts.
- Gör skivor på önskad tjocklek. Ta hänsyn till att de första segmenten sannolikt kommer att kasseras.
- Plocka upp sektionerna och flytta dem till vattenbadet med hjälp av pincett. Detta bör göra sektionerna platta ut. Använd pincetten för att justera dem efter behov.
- Flytta en elektrostatiskt laddad bild tillräckligt nära för att segmentet ska lockas och fäst snett. Märk bilderna med en penna.
- Placera alla insamlade bilder i ett bildställ. Låt rutschkanorna torka över natten vid 37 °C.
6. Deparaffinisering av vävnader
- Tvätta rutschkanorna i följande sekvens: 3 min i xylen (2x), 3 min i en etanollösning på 1:1 xylen/100%, 3 min i 100% etanol (2x), 3 min i 95% etanol, 3 min i 70% etanol, 3 min i 50% etanol.
7. Hematoxylin och eosin färgning
- Förbered bilderna för färgning.
- Om du använder OCT beredda vävnader, blöt i destillerat vatten i ~ 4 min tills OCT är upplöst och låt torka.
- Om du använder paraffin inbäddade vävnader, måste de deparaffiniseras. Se steg 6.1.
- Placera rutschkanan i filtrerad 0,1% hematoxylin i 10 min. Placera rutschkanan i destillerat vatten, ändra vattnet 1x omedelbart och sedan igen efter 3 min.
- Placera bilden i 0,5% eosin för 10 s eller dopp a 12x. Doppa rutschkanan i destillerat vatten tills eosin inte längre strimmor, ca 2-3 dips.
- Torka ut bilden genom att blötlägga i 50% etanol för 10 s, 75% etanol för 10 s, 95% etanol för 30 s, och 100% etanol i 1 min. Doppa i xylen tills xylen kommer ut smidigt, ~ 5-7 dips.
- Låt xylen avdunsta och montera med ett snabbtorkande monteringsmedium som har ett brytningsindex nära glas.
8. Kvalitativ analys av vanliga hjärtfel
- Ta bilder av alla prover med hjälp av ett inverterat eller stereomikroskop och dess respektive kamera. Ta makroskopiska och mikroskopiska bilder, beroende på vilka typer av defekter som analyseras. Makroskopiska bilder kan tas med någon förstoring under 10x. Mikroskopiska bilder bör tas vid 40x förstoring eller högre. Bilderna tagna i detta dokument togs med 5x förstoring med hjälp av ett stereomikroskop och en 40x luft mål (lins NA på 0,55) med hjälp av en inverterad mikroskop.
Makroskopiska bilder är en bra utgångspunkt eftersom de ger en vy till hela hjärtat (bild 3). När mönster identifieras kan specifika områden fokuseras på och undersökas ytterligare. - Rada upp alla bilder sida vid sida på en datorskärm. Har alla bilder av kontrollprover på ena sidan av skärmen och alla bilder av experimentella prover på andra sidan skärmen. Det är bäst att analysera en behandlingsgrupp i taget.
- Leta efter skillnader i fenotyper mellan behandlingsgrupper, med början vid viktiga områden där vanliga hjärtfel äger rum. Detta varierar beroende på om bilderna är makroskopiska, som skildrar brutto anatomi i hjärtat, eller mikroskopiska, som skildrar mikroskopisk anatomi hjärtvävnad.
- Börja söka efter vanliga makroskopiska hjärtfel, såsom Ventrikulärt septaldefekter (figur 2A),förmaksflimmer septaldefekter (figur 2B),och patentductus arteriosus (figur 2C). Alla dessa defekter är lättast att se i den tvärgående syn på hjärtat.
- För att identifiera septal defekter, överväga att titta på flera skivor, eftersom de kan observeras i ett plan av vävnaden och inte en annan.
OBS: Ibland en defekt är inte bristen på ett septum, men ett hål i septum. Därför ägna stor uppmärksamhet åt att inte missta en tår för en septal defekt. Letar du efter konsekvenser mellan närliggande skivor i en viss region kan bekräfta om detta är faktiskt en defekt eller en tår från skivning. - För att identifiera defekter i utflödeskanalen, såsom patentductus arteriosus, använd flera skivor för att följa de stora blodkärlen när de lämnar hjärtat. Skapa en bild av de stora blodkärlen i förhållande till varandra. Ett exempel finns i figur 2C.
OBS: Vissa oegentligheter kan bero på ett embryoutvecklingsstadium (t.ex. stänger patentet ductus arteriosus postnatally, strax efter födseln; ventrikulärt septum stänger inte helt förrän ~ e14,5). Några andra vanliga makroskopiska hjärtfel som inte ingår i siffrorna inkluderar långlivade truncus atereriosus, som kan upptäckas lättast på e16.5 och senare; dubbel utlopp höger ventrikel (DORV), som kan detekteras i skivor där hjärtat kommer in i utflödesområdet; och en övergripande aorta22. En vanlig mikroskopisk hjärtdefekt inkluderar minskad muskelpackning (figur 4).
9. Kvantitativ analys av hjärtmuskelpackning med hematoxylin och eosinfärgade vävnader
- Med hjälp av makroskopiska vyn av de färgade vävnadsproverna (figur 4A)identifierar du ett område av intresse för bild vid en förstoring på 40 x (figur 4B). För detta papper användes väggen i den vänstra ventrikeln. Spara bilden i önskat format. För det här dokumentet sparades bilder som TIF-filer.
- Öppna bilden i ImageJ-programvara.
- Ställ in bilden på 8-bitars. Detta gör att bilden kan använda tröskelverktyget i nästa steg23,24. Det gör du genom att välja "Bild | Typ | 8-bitars".
- Ange tröskeln för fotot. Syftet med det här steget är att bara markera de pixlar som representerar bakgrunden, med undantag för pixlarna som representerar vävnaderna23,24.
OBS: Denna yta kommer att subtraheras senare. En korrekt tröskel väljer de pixlar som forskaren vill utesluta från muskelvävnadsyta. Därför bör slutresultatet inkludera vävnaden i gråskala och bakgrunden kommer att väljas.- Klicka på "ImageJ | Bild | Justera | Tröskel". Flytta det övre fältet för att göra tröskeljusteringar. Stäng tröskeljusteringsfönstret utan att göra några andra ändringar när de önskade avsnitten har valts21.
- Använd verktyget Polygon-val för att välja det utrymme som vävnaden upptar. Se noga till att konturerna spårar vävnadsgränserna, eftersom lösa spårningar kommer att ge falska mätningar.
- Justera mätinställningarna på ImageJ så att programvaran bara mäter det område med pixlar som har valts med hjälp av tröskelverktyget i steg 9,423. "ImageJ | Analysera | Ange mått | Område och begränsa till tröskel ". Välj endast område och begränsa till tröskelvärde.
- Mät området för de markerade pixlarna. "ImageJ | Analysera | Mät". Det här värdet representerar området för det negativa utrymmet.
- Mät området i hela intresseområdet. Det här är det område som har valts med hjälp av verktyget Polygon-val. "Bild J | Analysera | Ange mått | Område". Markera endast område och avmarkera gräns till tröskelvärde. Mät sedan och välj "Bild J | Analysera | Mät".
- Beräkna området den faktiska muskelvävnaden upptar inom den region av intresse. Subtrahera området för det negativa utrymmet från området i hela intresseområdet. Detta värde är området för muskelvävnaden.
- Beräkna muskelkompakteringsindex (MCI). Dela muskelvävnadens område efter området i intresseområdet.
Ju större MCI-värde, desto mer komprimerad är muskeln. Dessa MCI-värden kan sedan användas för statistisk analys för att testa för betydande förändringar i muskelpackning mellan behandlingsgrupper (figur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muskelkompakteringsindexet jämfördes mellan hjärtan som utvecklades under två olika miljöer, en kontroll och en experimentell grupp. Dessa protokoll användes för att analysera packning av muskelvävnad kvantitativt, vilket möjliggjorde statistisk analys. Muskelpackning visade sig vara signifikant reducerad i de experimentella hjärtana i förhållande till de embryon som utvecklats under icke-experimentella förhållanden.
Embryon kasserades om observationstidpunkten verkade felaktig. Även hämmad tillväxt av embryon kan vara ett resultat av behandlingen av experimentet, och det finns en rad utvecklingsframsteg, var avel utspridda tillräckligt för att säkerställa tidpunkten för embryoutveckling. Iscensättning av embryongjordes med Theiler Staging21. Prover ansågs vara dåligt skivad om skivorna inte återspeglade konsekvens eller om de hade uppenbara tårar eller veck. Färgning gav tillräckligt med kontrast för att urskilja vävnadskanterna, men var inte så mörk att cellfunktioner inte kunde särskiljas. Bilder avbildades sedan med ett inverterat mikroskop med ett 40x-mål. MCI-värden beräknades med ImageJ-programvara och Microsoft Excel. Dessa MCI-värden analyserades med hjälp av ett T-test.
Figur 1: Plug assay resulterar i C57BL6/J möss. (A) En mus med en lätt identifierbar copulation plugg. (B)En mus utan copulation plugg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Vanliga hjärtfel. Scheman för den sanna förväntade morfologi av en medfödd hjärtdefekt. (A)Tvärgående bild av en ventrikulärt septal defekt. (B)Tvärgående syn på en förmaksföld septal defekt. (C)Patentductus arteriosus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Hematoxylin och eosinfläck av e15,5 hjärtan. (A)Ett färgat hjärta som utvecklats under normala förhållanden. Skala bar = 750 μm. (B) Ett färgat hjärta som utvecklats under experimentella förhållanden. Skala bar = 750 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvantitativ analys av muskelpackning mellan hjärtan som utvecklats under normala moderns kost och hjärtan som utvecklats under essentiella fettsyror bristfälliga moderns kost. (A)Hematoxylin och eosin färgade hjärtan vid en makroskopiska (5x) vy. Skalstänger = 1 000 μm. (B) Hematoxylin och eosinfärgade hjärtan vid mikroskopisk vy (40x). Skalstänger = 75 μm. (C) Resulterande data för mätningav muskelkompakteringsindex. Värdena analyserades med hjälp av ett T-test (n = 4 per behandlingsgrupp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll utforskar de tekniker som ingår i analysen av hjärtutveckling i embryonala hjärtan. Vissa begränsningar av denna metod är den nödvändiga fysiska fingerfärdighet för de förberedande teknikerna, vilket kan kräva övning, och skicklighet med mikroskop avbildning. Om de skivor som erhålls vid kryostaten är rörigt, kommer hematoxylin och eosin färgning inte vara tydlig, eller om bilderna som tas vid mikroskopet har dålig belysning, då den metod som används med ImageJ kommer inte att fungera. En begränsning av tröskelfunktionen i ImageJ-programvaran är att den väljer pixlar som finns på ena änden av ett tröskelvärde som är beroende av pixelvärdet. Därför inkluderas eller utesluts alla pixlar som finns på fel sida av tröskelvärdet felaktigt i beräkningen. I slutändan kommer felsökning att vara nödvändigt för att anta protokollen för användning i en studie.
I händelse av att hjärtat utvinning är för svårt, överväga att hoppa till steg 2,8. Dessutom, överväga att ta bort mer än bara hjärta och lungor från brösthålan. Målet blir då större och lättare att manipulera, och direkt kontakt mellan hjärtat och de fina pincetten minimeras. Vid kryostatsnittning kommer de experimentella proverna alltid att jämföras direkt med kontrollprover. Detta ger utrymme för användarfel så länge felet är konsekvent i alla exempel. För att minimera användarfel och undvika falska resultat, se till att jämförbara avsnitt erhålls från båda behandlingsgrupperna. Om till exempel fler än en person producerar sektioner kontrollerar du att en individ producerar ett jämnt antal avsnitt för kontroller och alla behandlingsgrupper, och inte bara en undergrupp. Slutligen, när du tröskelvärden på ImageJ, används tröskelverktyget för att tillåta maximal frihet att välja pixlar som representerar vävnad och pixlar som inte gör det. Om det behövs justerar du bildernas kontrast för att ytterligare intensifiera bakgrundspixelvärdet från vävnadens pixelvärde. Även om det finns felsökningsalternativ kräver teknikerna fortfarande en hög grad av skicklighet. Att utföra det här protokollet ger dock åtkomst till data som vanligtvis inte mäts i andra studier av hjärtutvecklingsforskning. Således kan använda funktioner i detta protokoll ge ett betydande bidrag till en vetenskaplig undersökning.
Identifiera effekterna av experimentella behandlingar i kardiologi forskning ofta undersöks genom morfologi bedömning. Detta är särskilt fallet i utvecklingsbiologi, där moderkakan gör det svårt för fysiologiska funktioner att utveckla hjärtan som skall mätas. Därför förändrar morfologisk analys som gör insikt i hjärtats funktion dramatiskt utvecklingens utvecklingsmässiga biologiforskning. Även om de flesta papper analysera tjockleken på hjärtmuskeln för att bestämma styrkan i hjärtat, direkt mätning av muskelpackning kan ge ytterligare insikt i fysiologiutveckla däggdjur hjärta25,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden att rapportera.
Acknowledgments
Aguirre Lab stöds av National Heart, Lung och Blood Institute of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer K01HL135464 och av American Heart Association under tilldelningnummer 19IPLOI34660342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D.
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al.
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E.
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).
- Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).
- Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).
- Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J.
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
