Summary
Dans ce protocole, nous décrivons des procédures pour analyser qualitativement et quantitativement des phénotypes développementaux chez les souris associées aux défauts congénitaux de coeur.
Abstract
Les malformations cardiaques congénitales (CHD) sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme, affectant jusqu’à 1 % de toutes les naissances vivantes. Cependant, les causes sous-jacentes de la coronaropathie sont encore mal comprises. La souris en développement constitue un modèle précieux pour l’étude de la coronaropathie, parce que les programmes de développement cardiaque entre les souris et les humains sont fortement conservés. Le protocole décrit en détail comment produire des embryons de souris du stade gestationnel souhaité, méthodes d’isolement et de préservation du cœur pour le traitement en aval, méthodes quantitatives pour identifier les types courants de CORONA par histologie (p. ex., septale ventriculaire défauts, défauts septaux auriculaires, brevets ductus arteriosus), et méthodes quantitatives d’histomorphométrie pour mesurer les phénotypes musculaires communs de compaction. Ces méthodes articulent toutes les étapes impliquées dans la préparation, la collecte et l’analyse de l’échantillon, permettant aux scientifiques de mesurer correctement et de façon reproductible la coronaropathie.
Introduction
Les CHD sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme et sont la principale cause de décès liés aux malformations congénitales1,2,3,4,5,6. Bien qu’environ 90 % des nouveau-nés survivent à la coronaropathie, il est souvent associé à une morbidité et à des interventions médicales importantes au fil des ans, imposant un lourd fardeau à la vie des patients et au système de santé7,8,9,10. En dehors des facteurs purement génétiques, les causes de la coronaropathie sont malcomprises 4. Les causes non identifiées représentent 56-66% de tous les cas de CORONA selon l’American Heart Association et d’autres sources2,3,4,11. Les facteurs bien connus comprennent les mutations génétiques, les VNC, les variantes de nucléotide unique de novo et l’aneuploidy. On soupçonne que les facteurs environnementaux et diététiques sont également des sources importantes contribuant à la CORONA, comme le suggèrent des études épidémiologiques liant le mode de vie maternel2,12, la privation économique, et la race13, et par la recherche sur des facteurs alimentaires tels que l’acide folique11,14 et l’acide rétinoïque des lipides bioactifs15,16. Il est important d’étudier les mécanismes et les causes de la coronaropathie et d’autres défauts cardiovasculaires pour élaborer des stratégies préventives et de nouvelles options thérapeutiques1,4,17,18,19.
La souris en développement est un modèle de pierre angulaire pour l’étude du CHD chez les mammifères. Cependant, certaines des méthodes et des analyses utilisées, telles que les dissections préservant la morphologie cardiaque, l’analyse des stades de développement et l’identification des défauts associés au CHD, peuvent être intimidantes pour les scientifiques qui sont nouveaux à l’analyse des cœurs murins. L’objectif des méthodes décrites dans ce protocole est d’offrir des lignes directrices qualitatives et quantitatives pour ces processus. Ainsi, dans ce protocole, nous expliquons comment effectuer des accouplements chronométrés pour produire des embryons du stade gestationnel désiré, disséquent les femelles enceintes pour le rétablissement intact du cœur (y compris les tissus associés tels que le tractus), la fixation du cœur et la préparation pour section cryostat, méthodes d’histologie de base, analyses quantitatives des défauts cardiaques communs, et analyse qualitative du compaction de muscle cardiaque, un phénotype précurseur commun à certains types de CHD.
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Protocol
Tous les animaux utilisés dans les expériences mentionnées dans le présent document ont été traités à l’aide des lignes directrices sur les soins aux animaux du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan (IACUC).
1. Accouplement chronométré des souris C57BL6/J pour la production d’embryons
- Une fois que les souris ont atteint l’âge de reproduction (6-8 semaines), les assembler en format de reproduction de harem (c.-à-d. deux femelles par un mâle). Installez-les pour l’élevage dans l’après-midi ou le soir.
REMARQUE : Les souris se reproduisent souvent à moins de 1 h après que les lumières ont été éteintes à l’intérieur de leur installation d’habitation. Les femelles devraient être retirées de la reproduction à environ 6-8 mois et les mâles devraient être utilisés au plus tard 12 mois. - Si l’on utilise la méthode de pesée pour déterminer la fécondation, élevez des souris en grands groupes, parce que la méthode de pesée provoque l’accouplement chronométré de procéder à un rythme plus lent que les méthodes dans lesquelles seuls les bouchons de copulation sont surveillés.
- Le lendemain matin, vérifiez s’il y a des bouchons de copulation entre 8 h et 12 h. Assurez-vous que cela se fait aux bons moments. Si l’essai de prise est effectué plus tôt que 8 h, il y a un risque que la prise soit trop profonde dans le canal vaginal pour être observée. Si l’essai de prise est effectué plus tard que 12 PM, il y a un risque que la prise soit tombée.
- Prenez la femelle par la base de la queue et étudiez l’ouverture du canal vaginal avec l’utilisation d’une pointe de micropipette. Une prise de copulation ressemblera à une barrière muqueuse (figure 1A), qui pourrait être un peu difficile à voir dans certains cas. Crustiness est également une indication qu’un bouchon de copulation est ou était présent. S’il n’y a pas de barrière muqueuse(figure 1B), la femelle ne s’est probablement pas accouplée ou la prise de copulation aurait déjà pu tomber.
- Se référer au matin de la copulation comme e0.5.
REMARQUE : Avec les souris C57BL6/J, les bouchons de copulation peuvent être difficiles à identifier. Par conséquent, parfois les souris accouplées même si aucune prise n’a été observée. La copulation ne conduit pas toujours à la conception. Ceci est souvent plus probable chez les souris C57BL6/J. Par conséquent, surveiller la progression du poids pour confirmer la grossesse (voir l’étape 1.4). Les pesées peuvent aider à identifier les femelles qui sont enceintes et confirmer que les bouchons ont conduit à la conception. Faites preuve de prudence lorsque vous accouplez les femelles pendant des nuits consécutives. Si un mâle particulier est observé pour être bon à produire un bouchon de copulation, que le mâle peut faire confiance pour s’accoupler pour des nuits consécutives avec la même femelle. - Gardez à l’esprit que les chances de grossesse sont plus élevées avec des souris qui sont des éleveurs prouvés, car ils ont été élevés avec succès avant. Pour augmenter les chances d’avoir des éleveurs éprouvés, les mâles utilisés ne devraient pas être trop vieux.
- Après l’essai de prise, peser les femelles. Cette pesée devrait être suivie 7-10 jours plus tard. Si le gain de poids dépasse 1,73 g, alors la souris est probablement enceinte20. Si le gain de poids est inférieur à 1,73 g, il est probablement sans rapport avec la grossesse et la souris devrait être réintroduite à la population reproductrice.
REMARQUE : Les souris C57BL6/J produisent de petites portées (cinq à six embryons en moyenne). Peser dans les méthodes pour déterminer la grossesse sont précis pour la majorité. L’utilisation de cette méthode fournit un taux de 12,8% faux positif et exclura 3% des femmes qui sont réellement enceintes20. Si le chercheur s’inquiète du fait que le temps gestationnel souhaité est plus tard, passez à l’étape 1.5 - Facultatif : Le jour où la dissection aura lieu, assurez-vous que la grossesse a progressé par inspection physique. Attrapez la femelle à la base de la queue et étirez le corps. C’est plus facile à faire en plaçant la souris sur le poignet et en tirant doucement la base de la queue. Si la femelle est enceinte, alors il y aura probablement un gain de poids spécifiquement dans le torse inférieur, et il apparaîtra comme de petites bosses.
REMARQUE : La grossesse peut être palpable dès e12.5 et sera palpable par e14.5 dans la plupart des cas. Les souris C57BL6/J ont de petites tailles de litière, donc la femelle pourrait être enceinte même s’il n’y a pas de signes physiques.
2. Dissection des femelles et des embryons pour le rétablissement cardiaque
- Avant le début de la dissection, préparez les solutions suivantes à température ambiante.
- Dissoudre l’acide éthylènediaminettraacetic (EDTA) en saline tampon de phosphate (PBS) à une concentration de 0,5 mM.
REMARQUE : Une fois préparé, il est préférable de garder la solution sur la glace et de ne l’utiliser qu’à 4 oC. Si la contamination est préoccupante, elle doit être autoclavée avant l’utilisation. - Dissoudre le paraformaldéhyde (PFA) en PBS à une concentration de 4 %.
REMARQUE : Une fois préparé, il est préférable de garder la solution sur la glace et de ne l’utiliser qu’à 4 oC. Conserver à 4 oC ou plus froid pour un stockage à long terme. La concentration de la solution PFA peut varier en fonction des applications en aval des échantillons de tissus. Ce pourcentage est employé pour la coloration d’hématoxyline et d’éosine, l’immunohistochimie, et la coloration immunofluorescente.
- Dissoudre l’acide éthylènediaminettraacetic (EDTA) en saline tampon de phosphate (PBS) à une concentration de 0,5 mM.
- Une fois que la femelle a atteint le stade gestationnel souhaité, la souris doit être euthanasié au bon moment de la journée selon les lignes directrices approuvées de l’utilisation des animaux. Si les horaires sont à la mi-journée (p. ex., p. ex., par exemple, ils doivent être sacrifiés vers 12 h. Si les horaires sont les jours entiers (p. ex., p. 15,0), ils doivent être sacrifiés vers 12 heures du matin.
REMARQUE : On suppose que la conception se produit vers minuit pendant la nuit où les souris sont jumelées. Cependant, il est difficile de déterminer l’heure exacte de la conception. Pour cette raison, le calendrier est estimé, pas exact. - Après avoir épinglé les quatre membres vers le bas, faire soigneusement une incision en forme d’I le long du torse, à partir de autour de l’urètre vers le sternum.
- L’utérus sera probablement situé juste au-dessus de la région pelvienne. L’utérus de souris est en forme de Y; par conséquent, il sera probablement très long et enroulé autour du torse. Retirez-le en le soulevant doucement. Faites-le en utilisant les côtés des forceps fins dans un mouvement de ramassage. Les tissus superficiels de l’utérus peuvent être saisis très soigneusement par les pointes des forceps fins lors de la première utérus. Utilisez des ciseaux pour couper l’utérus du corps.
REMARQUE : En gardant à l’esprit l’inhabituel en forme de Y de l’utérus, assurez-vous que l’utérus entier est enlevé. - Faire tremper l’utérus dans un PBS glacé. Épinglez une extrémité de l’utérus vers le bas et étirez-le en une seule ligne.
- Couper l’utérus en sections, chaque section contenant un embryon séparé. Peler délicatement l’embryon avec de fines forceps. C’est plus facile à faire avec une paire de forceps dans chaque main. Une fois enlevé, placez l’embryon immédiatement dans un nouveau plat Petri rempli de solution PBS-EDTA à 4 oC.
REMARQUE : Une solution PBS normale peut également être utilisée, mais l’EDTA empêche la coagulation dans les échantillons. - Stage les embryons à l’aide de Theiler Staging21. Parce que la mise en scène peut varier d’un embryon à l’autre dans une seule portée, étape de chaque embryon individuel.
REMARQUE : Cela peut également fournir une prévoyance dans les malformations cardiaques congénitales possibles chez les embryons. Typiquement, les symptômes d’une malformation cardiaque congénitale peuvent être observés dans la morphologie embryonnaire. D’autres défauts majeurs souvent associés à certaines affections cardiaques peuvent être présents. - Le cœur peut être enlevé de diverses façons selon l’âge de l’embryon.
REMARQUE : S’il n’est pas clair si le tractus restera intact pendant l’enlèvement, soit enlevez plus de tissus que le seul cœur (en gardant le tractus intact et en minimisant le contact direct entre le cœur et les forceps) ou analysez l’embryon entier.- À l’aide d’une portée de dissection et de deux paires de forceps fins, placez l’embryon sur son dos et stabilisez l’accès à la poitrine. Cela peut être fait soit en épinglant les bras vers le bas avec les forceps ou en enlevant les bras et en tenant le torse en position.
- Utilisez le point pointu d’une deuxième paire de forceps fins pour faire une incision le long du sternum de l’embryon et étendre entre les clavicules au nombril. Commencez par faire des incisions très fines et superficielles tout en travaillant progressivement vers l’intérieur de la cavité thoracique. Le cœur devrait à peine devenir visible. Ne le contactez pas avec les forceps pendant ces incisions superficielles.
- Peler la cage thoracique ouverte à l’aide de la première paire de forceps pour presser doucement sur le torse de l’embryon, légèrement caudal à la cage thoracique. Le cœur devrait sortir ou devenir apparent. Le cœur pourrait avoir besoin d’un câlin doux pour sortir. Utilisez le côté des forceps, en veillant à ce que le point des forceps n’entre jamais en contact avec le cœur. Pour garder l’espace de travail et les forceps propres, gardez une lingette sans peluche à proximité.
- Saisissez doucement les vaisseaux sanguins pulmonaires avec les côtés des forceps, en veillant à ne pas couper le tissu, et tirez le cœur de la cavité thoracique. Ensuite, nettoyez le cœur.
REMARQUE : Pour les embryons e13.5 et plus jeunes, le cœur est couvert par le péricarde. Cela doit être enlevé afin d’atteindre le cœur.
- À l’aide d’un stéréoscope, prenez une photo du cœur pour une référence ultérieure.
- Rincer les cœurs dans la solution PBS-EDTA pendant 1-2 min, puis les placer dans la solution PFA de 4% pour environ 45-60 min pour les fixer. Si l’analyse de l’embryon entier est souhaitée, tremper toute la nuit. Le volume de la solution PFA devrait être de 5-6x le volume du tissu fixé.
REMARQUE : Ce temps d’incubation peut varier selon les études ultérieures. Ce temps d’incubation est utilisé pour la coloration d’hématoxyline et d’éosine, l’immunohistochimie, et la coloration immunofluorescente. - Laver 5-10 min avec PBS-glycine 3x et remettre dans PBS. L’azide de sodium ou la pénicilline/streptomycine peut également être ajouté pour minimiser la croissance bactérienne et préserver les tissus intacts. Les cœurs peuvent maintenant être entreposés à court terme à 4 oC.
3. Préparation des tissus
REMARQUE : Les tissus peuvent être préparés à l’aide d’un octogénaire (température de coupe optimale) ou d’intégration de paraffine. Il y a des avantages et des inconvénients à l’une ou l’autre méthode et l’objectif de l’analyse devrait être pris en considération au moment de décider quelle méthode d’intégration devrait être utilisée.
- Intégration OCT
REMARQUE : Cette méthode peut être préférable à l’intégration formaline/paraffine parce que les cryosections préservent la réactivité d’antigène, peuvent encore être employées pour la coloration d’hématoxyline et d’éosine, et produisent des tranches plus rapidement.- Préparer une solution de saccharose dissous dans PBS à une concentration de 30% (w/v).
- Transférer les tissus dans un nouveau tube conique de 15 ml ou un tube de microcentrifuge de 1,5 mL contenant du saccharose PBS-30%. Initialement, le tissu flottera.
- Placez-le à 4 oC au réfrigérateur. Le tissu sera prêt pour l’intégration OCT quand il coule au fond du tube, généralement en 24-40 h.
REMARQUE : Les tissus musculaires souffrent de façon significative pendant les cycles de gel/dégel et perdent leur morphologie indigène. Sucrose est absorbé par le tissu et agit comme un agent cryoconservateurs qui permet une meilleure préservation de la morphologie. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de solution dans le tube pour que le flottement des tissus soit suffisamment surveillé. PBS-sucrose est facilement contaminé par des bactéries, alors vérifiez la solution fréquemment pour la nébulosité, ce qui indique soit la prolifération fongiques ou bactériennes. Pour minimiser le risque de contamination, la pénicilline/streptomycine ou l’azide de sodium peuvent être ajoutés à la solution PBS-sucrose. - Enlevez les cœurs avec une pipette Pasteur, assurez-vous que l’ouverture de la pipette est assez large pour ne pas déchirer le tissu. Couper la pipette avec des ciseaux si nécessaire. Si vous travaillez avec des embryons entiers, utilisez des forceps pour récupérer l’échantillon.
REMARQUE: Faites-le doucement. Même si l’ouverture de la pipette est assez large pour récupérer les cœurs, les bords de la pipette peuvent encore déchirer les tissus. Les forceps peuvent ensevoirer des échantillons de tissus s’ils sont utilisés de façon trop agressive. - Laissez brièvement le tissu sécher à l’air sur une lingette sans peluche. Placer l’échantillon dans un moule OCT dans la position désirée pour la coupe (c.-à-d. sagittal, transversal, coronal). Ajouter le composé OCT jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement immergé, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles en contact avec le tissu.
- Placer le moule à -20 oC pendant la nuit ou plusieurs jours, puis déplacer le moule à -80 oC. Après 24 h, le moule est prêt pour la cryosection. Les tissus de ce format peuvent être stockés à long terme.
- Embedding Paraffine
- À l’aide d’éthanol, déshydratez les tissus de cette succession : 50 % d’éthanol pendant 10 min, 70 % d’éthanol pour 10 min, 80 % d’éthanol pendant 10 min, 95 % d’éthanol pendant 10 min, 100 % d’éthanol pour 10 min (faire ce 3x).
- Tremper les tissus dans une série de solutions d’éthanol/xylène dans cette succession : solution 2:1 éthanol/xylène pour 10-15 min, 1:1 solution d’éthanol/xylène pour 10-15 min, 1:2 éthanol/xylène solution pour 10-15 min, 100% xylène pour 10-15 min (faire ce 3x).
- Pour remplacer le xylène par une paraffine, tremper les tissus dans un four à vide (réglé entre 54-58 oC) dans cette succession: 2:1 xylène / paraffin solution pour 30 min, 1:1 solution de xylène/paraffin pour 30 min, 1:2 xylène/paraffin solution pour 30 min, 100% paraffine pour 1-2 h, 100% paraffin pour 1-2 h ou nuit.
REMARQUE : Le chauffage des tissus au-delà de 60 oC pendant de longues périodes de temps entraînera la dégradation des polymères paraffine et le tissu. - À l’aide d’une paraffine fraîche, intégrer les tissus dans la position désirée.
4. Section cryostat pour les tissus incrustés d’OCT
- Au cryostat, placez tous les échantillons à l’intérieur pendant un minimum de 1 h si les échantillons étaient auparavant conservés dans le congélateur à -80 oC. Ils devraient y rester jusqu’à ce que toutes les sections aient été recueillies.
- Assurez-vous que le cryostat est réglé aux réglages de température corrects. La température environnementale à l’intérieur de la chambre cryostat devrait être d’environ -20 oC et le bras du cryostat devrait être d’environ -24 oC.
REMARQUE : Cette température peut varier en fonction de la façon dont le bloc réagit au tranchage. Si le découpage incohérent est un problème, la température de l’environnement pourrait être abaissée. - Retirez le bloc OCT de son moule en tirant sur les bords du côté ouvert du moule pour le desserrer, puis en pinçant le bloc à l’extrémité fermée, où le moule se rétrécit.
- Pour monter le bloc OCT, placez la température ambiante OCT sur le mandrin, en commençant par le milieu et en travaillant au bord. Le mandrin entier n’a pas besoin d’être couvert.
- Placez le bloc OCT (voir étape 3.1) sur le moule. Le bord du bloc qui était contre le côté fermé du moule devrait être tourné vers le haut sur le mandrin. Laisser l’OCT sur le mandrin congeler jusqu’à ce qu’il soit blanc opaque, environ 5-10 min.
- Placez le mandrin sur le bras pendant encore 5-10 min pour que le bloc arrive à la température du bras. Pour obtenir une tranche parallèle, ajuster le bras jusqu’à ce que le bord du bloc est parallèle à la scène et il ya une distance égale entre l’étape et le bord inférieur du bloc est le même que la scène et le bord supérieur du bloc.
- Insérez la lame et ajustez la distance du bloc de la lame pour prendre des sections.
- Prendre des tranches à une épaisseur de 10 m. Continuer à trancher jusqu’à ce que le point d’intérêt soit atteint manuellement ou en utilisant la fonction de garniture.
- Pour recueillir des tranches, utilisez un petit pinceau plat et un pinceau détaillé. Lorsque le moule commence à être coupé, utilisez la brosse plate pour tirer doucement la tranche contre le support. Lors de la coupe à travers l’échantillon, le mouvement doit être continu et sans pause, bien que la vitesse peut dépendre de la fermeté de l’échantillon.
- Tout en coupant, utilisez la brosse plate pour guider doucement la tranche telle qu’elle est faite. La tranche n’a pas besoin d’être rincé avec le stade à ce stade, alors laissez-le s’envoler pour ne pas causer de larmes ou de tractions et affecter l’histologie.
REMARQUE : Lorsque vous tranchez des embryons entiers, cette partie peut être particulièrement difficile, surtout lorsque l’on change de type tissulaire. Assurez-vous que les tranches sont faites sans pause et que la brosse ne tire pas trop agressivement sur les tranches. Lorsque les types de tissus changent, la tranche peut se briser, de sorte que le maintien de la température froide est la clé. Si la rupture est un problème, diminuez la température ou augmentez l’épaisseur de l’échantillon. - Pause le mouvement du bloc une fois que l’échantillon est complètement coupé à travers, mais la tranche n’est pas encore libre du bloc. Sans déplacer la brosse plate de la tranche, utilisez la brosse détaillée pour tapoter la tranche vers le bas pour la rendre plate et congeler contre la scène.
- Maintenez la tranche là pendant 10 s avant d’enlever la brosse de détail et de terminer la tranche. Utilisez les deux pinceaux pour aplatir doucement la tranche contre la scène, empêcher tout roulement et la tenir contre la scène pendant 20-30 s.
- Retourner la tranche et aplatir contre la scène à nouveau. Déplacez une diapositive chargée électrostatiquement assez près pour que la tranche soit attirée et adhérez à la diapositive sans avoir à toucher la glissière à la scène. Étiqueter les diapositives avec un crayon.
- Conservez les diapositives dans une boîte hermétique pour protéger les tissus contre l’accumulation de glace pendant l’entreposage. Pour le stockage à court terme, les glissières doivent être stockées à -20 oC avant la coloration. Pour le stockage à long terme, gardez-les à -80 oC.
5. Section microtomée pour les tissus incorporés paraffine
- Placer les blocs sur la glace avant la section afin de refroidir les échantillons. Lorsqu’elle est fraîche, les tranches de paraffine plus facilement et peuvent produire des tranches plus minces.
- Préparer un bain d’eau de 40 à 45 oC à l’aide d’eau ultrapure.
- Placez la lame dans le support dans le microtome. Assurez-vous qu’il est sécurisé, puis définissez l’angle de dégagement. Assurez-vous que l’angle de dégagement est correct. Cela peut être vérifié selon les instructions du fabricant.
- Placer le bloc de paraffine dans le microtome. Assurez-vous qu’il est correctement orienté de sorte que la lame va couper directement à travers le bloc.
- Assurez-vous que la lame est orientée correctement avec le bloc en faisant quelques tranches. Faites-le avec soin afin que des ajustements puissent être effectués.
- Couper le bloc jusqu’à ce que le point d’intérêt soit atteint.
- Faire des tranches à l’épaisseur désirée. Prenez en compte que les premières tranches seront probablement jetées.
- Ramassez les sections et déplacez-les dans le bain d’eau à l’aide de forceps. Cela devrait faire les sections aplatir. Utilisez les forceps pour les ajuster au besoin.
- Déplacez une diapositive chargée électrostatiquement assez près pour que la tranche soit attirée et adhérez à la glissière. Étiqueter les diapositives avec un crayon.
- Placer tous les toboggans collectés dans un porte-diapositives. Laisser sécher les lames pendant la nuit à 37 oC.
6. Déféaffinisation des tissus
- Laver les diapositives dans la séquence suivante: 3 min en xylène (2x), 3 min dans une solution de 1:1 xylène/100% d’éthanol, 3 min en 100% d’éthanol (2x), 3 min en éthanol 95%, 3 min en 70% d’éthanol, 3 min en éthanol 50%.
7. Tache d’hématoxyline et d’éosine
- Préparer les lames pour la coloration.
- Si vous utilisez des tissus préparés par l’OCT, tremper dans l’eau distillée pendant 4 minutes jusqu’à ce que l’OCT soit dissoute et laisser sécher.
- Si vous utilisez des tissus incorporés paraffine, ils doivent être déparaffinisés. Voir l’étape 6.1.
- Placer la la glissière dans l’hématoxyline filtrée de 0,1% pendant 10 min. Placer la la glissière dans de l’eau distillée, en changeant l’eau 1x immédiatement, puis de nouveau après 3 min.
- Placez la glissière dans 0,5% d’éosine pour 10 s ou trempez 12x. Tremper la la lame dans de l’eau distillée jusqu’à ce que l’éosine ne s’édent plus, environ 2-3 trempettes.
- Déshydrater la lame en trempant dans 50% d’éthanol pour 10 s, 75% d’éthanol pour 10 s, 95% d’éthanol pour 30 s, et 100% d’éthanol pendant 1 min. Trempette dans le xylène jusqu’à ce que le xylène sorte lisse, 5-7 trempettes.
- Laisser le xylène s’évaporer et monter avec un milieu de montage de séchage rapide qui a un indice réfractiv près du verre.
8. Analyse qualitative des malformations cardiaques courantes
- Prenez des images de tous les échantillons à l’aide d’un microscope inversé ou stéréo et de sa caméra respective. Prenez des images macroscopiques et microscopiques, selon les types de défauts analysés. Les images macroscopiques peuvent être prises avec n’importe quel grossissement en dessous de 10x. Les images microscopiques doivent être prises à 40x grossissement ou plus. Les photos prises dans ce document ont été prises avec un grossissement 5x à l’aide d’un microscope stéréo et d’un objectif d’air 40x (lentille N.A. de 0,55) à l’aide d’un microscope inversé.
REMARQUE : Les images macroscopiques sont un bon point de départ parce qu’elles donnent une vue sur l’ensemble du cœur(figure 3). Au fur et à mesure que les modèles sont identifiés, des domaines spécifiques peuvent être axés sur et étudiés plus en détail. - Alignez toutes les images côte à côte sur un écran d’ordinateur. Avoir toutes les images d’échantillons de contrôle sur un côté de l’écran et toutes les images d’échantillons expérimentaux de l’autre côté de l’écran. Il est préférable d’analyser un groupe de traitement à la fois.
- Recherchez les différences dans les phénotypes entre les groupes de traitement, à partir d’endroits clés où des malformations cardiaques courantes ont lieu. Cela variera selon que les images sont macroscopiques, qui dépeignent l’anatomie brute du cœur, ou microscopique, qui dépeignent l’anatomie microscopique du tissu cardiaque.
- Commencez à rechercher des malformations cardiaques macroscopiques courantes, comme les défauts septaux ventriculaires(figure 2A), les défauts septaux auriculaires(figure 2B)et le brevet ductus arteriosus(figure 2C). Tous ces défauts sont plus facilement visibles dans la vue transversale du cœur.
- Pour identifier les défauts septaux, envisagez d’examiner plusieurs tranches, car elles pourraient être observées dans un plan du tissu et non dans un autre.
REMARQUE: Parfois, un défaut n’est pas l’absence d’un septum, mais un trou dans le septum. Par conséquent, faites attention à ne pas confondre une larme avec un défaut septal. La recherche de consistances entre les tranches voisines dans une région spécifique peut confirmer s’il s’agit en fait d’un défaut ou d’une déchirure du coup de tranche. - Pour identifier les défauts dans le tractus, tels que le brevet ductus arteriosus, utiliser plusieurs tranches pour suivre les principaux vaisseaux sanguins comme ils quittent le cœur. Créez une image des principaux vaisseaux sanguins les uns par rapport aux autres. Un exemple est présenté dans la figure 2C.
REMARQUE : Certaines irrégularités peuvent être dues au stade de développement d’un embryon (p. ex., le brevet ductus arteriosus se ferme après la naissance, peu après la naissance; le septum ventriculaire ne se referme pas complètement avant l’e14,5). D’autres défauts macroscopiques communs de coeur qui ne sont pas inclus dans les figures incluent le tronc persistant atereriosus, qui peut être détecté le plus facilement à e16.5 et plus tard ; ventricule droit à double prise (DORV), qui peut être détecté en tranches dans lesquelles le cœur pénètre dans le tractus sortant; et une aortedominante 22. Une malformation cardiaque microscopique commune comprend une diminution du compactage musculaire(figure 4).
9. Analyse quantitative du compactage cardiaque du muscle à l’aide d’hématoxyline et de tissus tachés d’éosine
- En utilisant la vue macroscopique des échantillons de tissus tachés(figure 4A), identifier une région d’intérêt pour l’image lors d’un grossissement 40x(figure 4B). Pour ce papier, le mur du ventricule gauche a été utilisé. Enregistrer l’image dans le format désiré. Pour ce document, les images ont été enregistrées sous forme de fichiers .tif.
- Ouvrez l’image dans le logiciel ImageJ.
- Réglez l’image à 8 bits. Cela permet à l’image d’utiliser l’outil de seuil dans la prochaine étape23,24. Pour ce faire, sélectionnez «Image » Type de type 8 bits".
- Fixez le seuil de la photo. Le but de cette étape est de sélectionner uniquement les pixels qui représentent l’arrière-plan, à l’exclusion des pixels qui représentent les tissus23,24.
REMARQUE : Cette surface sera soustraite plus tard. Un seuil correct sélectionnera les pixels que le chercheur veut exclure de la surface des tissus musculaires. Par conséquent, le résultat final devrait inclure le tissu à l’échelle grise et l’arrière-plan sera sélectionné.- Cliquez sur "ImageJ ' Image de l’image Ajuster Seuil". Déplacez la barre supérieure pour effectuer des ajustements de seuil. Fermez la fenêtre d’ajustement de seuil sans apporter d’autres modifications une fois que les sections désirées sont sélectionnées21.
- Utilisez l’outil Polygon Selections pour sélectionner l’espace que le tissu occupe. Assurez-vous soigneusement que les contours tracent les bordures des tissus, car les tracés lâches fourniront de fausses mesures.
- Ajuster les paramètres de mesure sur ImageJ afin que le logiciel ne mesure que la zone de pixels qui ont été sélectionnés à l’aide de l’outil seuil dans l’étape 9.423. "ImageJ Analyser Mesures d’ensemble Zone et limite au seuil". Sélectionnez uniquement la zone et limitez-vous au seuil.
- Mesurez la zone des pixels mis en évidence. "ImageJ Analyser Mesure". Cette valeur représente la zone de l’espace négatif.
- Mesurer la zone de toute la région d’intérêt. C’est la zone qui a été sélectionnée à l’aide de l’outil Polygon Selections. "Image J Analyser Mesures d’ensemble Zone". Sélectionnez uniquement Zone et désélection limitez-vous au seuil. Ensuite, mesurez, en sélectionnant "Image J ' Analyser Mesure".
- Calculer la zone que le tissu musculaire réel occupe dans la région d’intérêt. Soustrayez la zone de l’espace négatif de la zone de toute la région d’intérêt. Cette valeur est la zone du tissu musculaire.
- Calculer l’indice de compaction musculaire (MCI). Diviser la zone du tissu musculaire par la zone de la région d’intérêt.
Plus la valeur MCI est grande, plus le muscle est compacté. Ces valeurs MCI peuvent ensuite être utilisées pour l’analyse statistique pour tester les changements significatifs dans le compactage musculaire entre les groupes de traitement(figure 4C).
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Representative Results
L’indice de compactage musculaire a été comparé entre les cœurs se développant sous deux environnements différents, un contrôle et un groupe expérimental. Ces protocoles ont été utilisés pour analyser le compactage du tissu musculaire quantitativement, ce qui a permis l’analyse statistique. Le compactage de muscle s’est avéré sensiblement réduit dans les coeurs expérimentaux par rapport aux embryons qui se sont développés dans des conditions non expérimentales.
Les embryons ont été écartés si le moment d’observation semblait inexact. Bien que la croissance rabougrie des embryons puisse être le résultat du traitement de l’expérience, et qu’il existe une gamme de progrès du développement, la reproduction a été suffisamment espacée pour assurer le moment du développement de l’embryon. La mise en scène des embryons a été réalisée à l’aide de Theiler Staging21. Les échantillons ont été jugés mal tranchés si les tranches ne reflétaient pas la consistance ou si elles avaient des larmes ou des plis évidents. La coloration a fourni assez de contraste pour faire dehors les bords de tissu, mais n’était pas si foncée qu’à rendre les dispositifs cellulaires indiscernables. Des diapositives ont ensuite été illustrées avec un microscope inversé avec un objectif 40x. Les valeurs MCI ont été calculées à l’aide du logiciel ImageJ et de Microsoft Excel. Ces valeurs mcI ont été analysées à l’aide d’un T-test.
Figure 1 : L’essai de plug donne des souris C57BL6/J. (A) Une souris avec un bouchon de copulation facilement identifiable. (B) Une souris sans bouchon de copulation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Malformations cardiaques courantes. Schémas de la vraie morphologie anticipée d’un défaut congénital de coeur. (A) Vue transversale d’un défaut septal ventriculaire. (B) Vue transversale d’un défaut septal auriculaire. (C) Brevet ductus arteriosus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Hématoxyline et tache d’éosine des cœurs e15.5. (A) Un cœur taché qui s’est développé dans des conditions normales. Barre d’échelle de 750 m . (B) Un cœur souillé qui s’est développé dans des conditions expérimentales. Barre d’échelle de 750 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse quantitative du compactage musculaire entre les cœurs qui se sont développés sous les régimes maternels normaux et les cœurs qui se sont développés sous les régimes maternels déficients en acides gras essentiels. (A) Hématoxyline et cœurs tachés d’éosine à une vue macroscopique (5x). Barres d’échelle à 1 000 m (B) Hématoxyline et cœurs tachés d’éosine à la vue microscopique (40x). Barres d’échelle de 75 m. (C) Les données résultantes des mesures de l’indice de compaction musculaire. Les valeurs ont été analysées à l’aide d’un T-test (n - 4 par groupe de traitement). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole explore les techniques impliquées dans l’analyse du développement cardiaque dans les cœurs embryonnaires. Certaines limites de cette méthode sont la dextérité physique requise pour les techniques préparatoires, qui peuvent nécessiter la pratique, et la compétence avec l’imagerie au microscope. Si les tranches obtenues au cryostat sont désordonnées, la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine ne sera pas claire, ou si les images prises au microscope ont un mauvais éclairage, alors la méthode utilisée avec ImageJ ne fonctionnera pas. Une limitation de la fonction seuil du logiciel ImageJ est qu’il sélectionne des pixels situés sur une extrémité d’un seuil dépendant de la valeur pixel. Par conséquent, tous les pixels qui existent du mauvais côté du seuil seront incorrectement inclus ou exclus dans le calcul. En fin de compte, le dépannage sera nécessaire pour l’adoption des protocoles à utiliser dans une étude.
Dans le cas où l’extraction cardiaque est trop difficile, envisager de sauter à l’étape 2.8. En outre, envisager d’enlever plus que le cœur et les poumons de la cavité thoracique. La cible devient alors plus grande et plus facile à manipuler, et le contact direct entre le cœur et les forces fines est minimisé. Lors de la section cryostat, les échantillons expérimentaux seront toujours directement comparés aux échantillons témoins. Cela permet une certaine marge d’erreur de l’utilisateur tant que l’erreur est cohérente dans tous les échantillons. Pour minimiser les erreurs de l’utilisateur et éviter les faux résultats, assurez-vous que des sections comparables sont obtenues des deux groupes de traitement. Par exemple, si plus d’une personne produit des sections, assurez-vous qu’une personne produit un nombre uniforme de sections pour les contrôles et tous les groupes de traitement, et pas seulement un sous-groupe. Enfin, lors du seuil des images sur ImageJ, l’outil de seuil est utilisé pour permettre une liberté maximale dans la sélection des pixels qui représentent les tissus et les pixels qui ne le font pas. Si nécessaire, ajustez le contraste des images pour intensifier davantage la valeur pixel de l’arrière-plan à partir de la valeur pixel du tissu. Bien qu’il existe des options de dépannage, les techniques exigent encore un haut degré de compétence. Cependant, l’exécution de ce protocole donne accès à des données qui ne sont généralement pas mesurées dans d’autres études de recherche sur le développement cardiaque. Ainsi, l’utilisation des caractéristiques de ce protocole pourrait apporter une contribution significative à une recherche scientifique.
L’identification des impacts des traitements expérimentaux dans la recherche en cardiologie est souvent étudiée par l’évaluation de la morphologie. C’est particulièrement le cas en biologie du développement, dans lequel le placenta rend difficile la mesure des caractéristiques physiologiques des cœurs en développement. Par conséquent, l’analyse morphologique qui permet de perspicacité dans la fonction du cœur déplace considérablement la trajectoire de la recherche en biologie du développement. Bien que la plupart des papiers analysent l’épaisseur du muscle cardiaque pour déterminer la force du cœur, la mesure directe du compactage musculaire pourrait fournir un aperçu plus approfondi de la physiologie du cœur mammifère en développement25,26,27.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation à signaler.
Acknowledgments
Le laboratoire Aguirre est soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution K01HL135464 et par l’American Heart Association sous le numéro de prix 19IPLOI34660342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
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