Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Entwicklungsphänotypen bei Mäusen, die mit angeborenen Herzfehlern assoziiert sind.
Abstract
Angeborene Herzfehler (CHD) sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und betreffen bis zu 1% aller Lebendgeburten. Die zugrunde liegenden Ursachen für DIE CHD sind jedoch noch immer schlecht verstanden. Die sich entwickelnde Maus stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung von CHD dar, da kardiale Entwicklungsprogramme zwischen Mäusen und Menschen stark konserviert sind. Das Protokoll beschreibt detailliert, wie Mausembryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums hergestellt werden können, Methoden zur Isolierung und Erhaltung des Herzens für die nachgeschaltete Verarbeitung, quantitative Methoden zur Identifizierung gängiger CHD-Typen durch Histologie (z. B. ventrikuläre Septum Defekte, vorgerichtliche Septumdefekte, Patent ductus arteriosus) und quantitative Histomorphometriemethoden zur Messung gängiger Muskelverdichtungsphänotypen. Diese Methoden artikulieren alle Schritte, die bei der Probenvorbereitung, -entnahme und -analyse erforderlich sind, sodass Wissenschaftler DIE CHD korrekt und reproduzierbar messen können.
Introduction
CHDs sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und sind die Hauptursache für Geburtsfehler-bedingte Todesfälle1,2,3,4,5,6. Obwohl etwa 90% der neugeborenen Kinder CHD überleben, wird es häufig mit signifikanter Morbidität und medizinischen Interventionen im Laufe der Jahre verbunden, was eine schwere Belastung für das Leben der Patienten und das Gesundheitssystem7,8,9,10. Außerhalb rein genetischer Faktoren sind die Ursachen der CHD schlecht verstanden4. Unbekannte Ursachen machen 56-66% aller CHD-Fälle nach der American Heart Association und anderen Quellen2,3,4,11. Bekannte Faktoren sind genetische Mutationen, CNVs, de novo Single Nukleotid-Varianten und Aneuploidie. Es wird vermutet, dass Umwelt- und Ernährungsfaktoren auch wichtige Quellen sind, die zur CHD beitragen, wie epidemiologische Studien nahelegen, die den mütterlichen Lebensstil2,12, wirtschaftliche Benachteiligung und Rasse13, und durch die Erforschung von Ernährungsfaktoren wie Folsäure11,14 und die bioaktive Lipid-Retinsäure15,16. Die Untersuchung der Mechanismen und Ursachen von CHD und anderen kardiovaskulären Defekten ist wichtig, um präventive Strategien und neuartige therapeutische Optionen zu entwickeln1,4,17,18,19.
Die sich entwickelnde Maus ist ein Eckpfeiler modellt, um CHD bei Säugetieren zu untersuchen. Einige der angewandten Methoden und Analysen, wie z. B. Sezierungen zur Erhaltung der Herzmorphologie, Analyse von Entwicklungsstadien und Identifizierung von CHD-assoziierten Defekten, können jedoch für Wissenschaftler, die neu in der Analyse muriner Herzen sind, beängstigend sein. Das Ziel der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ist es, qualitative und quantitative Leitlinien für diese Prozesse anzubieten. So erklären wir in diesem Protokoll, wie man zeitnahe Paarungen durchführt, um Embryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums zu produzieren, schwangere Weibchen für eine intakte Herzregeneration (einschließlich assoziierter Gewebe wie dem Abflusstrakt), Herzfixierung und Kryostatschnitt, grundlegende histologische Methoden, quantitative Analysen von allgemeinen Herzfehlern und qualitative Analyse der Herzmuskelverdichtung, ein häufiger Vorläufer-Phänotyp für einige Arten von KHK.
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Protocol
Alle Tiere, die in den in diesem Papier genannten Experimenten verwendet wurden, wurden nach den Tierpflegerichtlinien des Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) behandelt.
1. Zeitliche Paarung von C57BL6/J-Mäusen für die Embryoproduktion
- Sobald Mäuse das Brutalter erreicht haben (6-8 Wochen), stellen Sie sie in Haremszuchtformat zusammen (d.h. zwei Weibchen pro Männchen). Richten Sie sie für die Zucht irgendwann am Nachmittag oder Abend.
HINWEIS: Mäuse brüten oft innerhalb von 1 h, nachdem die Lichter in ihrer Wohnanlage ausgeschaltet wurden. Weibchen sollten mit etwa 6-8 Monaten aus der Zucht ausgemustert werden und Männchen sollten spätestens im Alter von 12 Monaten verwendet werden. - Wenn Sie die Wägemethode verwenden, um die Befruchtung zu bestimmen, züchten Sie Mäuse in großen Gruppen, da die Wägemethode dazu führt, dass die zeitgezeitete Paarung langsamer verläuft als Methoden, bei denen nur Kopulationsstecker überwacht werden.
- Überprüfen Sie am nächsten Morgen zwischen 8 und 12 Uhr auf Kopulationsstecker. Stellen Sie sicher, dass dies zu den richtigen Zeiten erfolgt. Wenn der Steckertest vor 8 Uhr durchgeführt wird, besteht die Gefahr, dass der Stecker zu tief im Vaginalkanal ist, um beobachtet zu werden. Wenn der Steckertest nach 12 Uhr durchgeführt wird, besteht die Gefahr, dass der Stecker ausfällt.
- Schnappen Sie sich das Weibchen an der Basis des Schwanzes und untersuchen Sie die Öffnung zum Vaginalkanal mit der Verwendung einer Mikropipette-Spitze. Ein Kopulationsstecker wird wie eine Schleimhautbarriere aussehen (Abbildung 1A), die in einigen Fällen etwas schwer zu erkennen sein könnte. Crustiness ist auch ein Hinweis darauf, dass ein Kopulationsstecker vorhanden ist oder war. Wenn es keine Schleimhautbarriere gibt (Abbildung 1B), dann hat sich das Weibchen wahrscheinlich nicht verpaart oder der Kopulationsstecker könnte bereits ausgefallen sein.
- Beziehen Sie sich auf den Morgen der Kopulation als e0.5.
HINWEIS: Bei C57BL6/J-Mäusen können Kopulationsstecker schwer zu identifizieren sein. Daher paarten sich manchmal die Mäuse, obwohl kein Stecker beobachtet wurde. Kopulation führt nicht immer zur Empfängnis. Dies ist bei C57BL6/J-Mäusen oft wahrscheinlicher. Überwachen Sie daher die Gewichtsprogression, um die Schwangerschaft zu bestätigen (siehe Schritt 1.4). Die Wiege ins kann helfen, schwangere Frauen zu identifizieren und zu bestätigen, dass Stecker zur Empfängnis geführt haben. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie Weibchen für aufeinander folgende Nächte paaren. Wenn ein bestimmtes Männchen beobachtet wird, um gut bei der Herstellung eines Kopulationssteckers zu sein, kann man diesem Männchen vertrauen, dass es sich für aufeinanderfolgende Nächte mit demselben Weibchen paart. - Denken Sie daran, dass die Wahrscheinlichkeit einer Schwangerschaft bei Mäusen, die bewährte Züchter sind, höher ist, da sie zuvor erfolgreich gezüchtet wurden. Um die Chancen auf bewährte Züchter zu erhöhen, sollten die verwendeten Männchen nicht zu alt sein.
- Nach dem Stecker-Assay, wiegen Sie die Weibchen. Dieses Wiegen sollte 7-10 Tage später weiterverfolgt werden. Wenn die Gewichtszunahme 1,73 g überschreitet, dann ist die Maus wahrscheinlich schwanger20. Wenn die Gewichtszunahme unter 1,73 g liegt, ist es wahrscheinlich nicht mit einer Schwangerschaft zu tun und die Maus sollte wieder in die Zuchtpopulation eingeführt werden.
HINWEIS: C57BL6/J-Mäuse produzieren kleine Würfe (durchschnittlich fünf bis sechs Embryonen). Wiegen in Methoden, um die Schwangerschaft zu bestimmen, sind für die Mehrheit genau. Mit dieser Methode bietet eine 12,8% falsch positive Rate und wird 3% der Frauen, die tatsächlich schwanger sind20. Wenn der Forscher befürchtet, dass die gewünschte Schwangerschaftszeit später ist, fahren Sie mit Schritt 1.5 fort. - Optional: Der Tag, an dem die Zerlegung stattfinden wird, stellen Sie sicher, dass die Schwangerschaft durch körperliche Inspektion fortgeschritten ist. Schnappen Sie sich das Weibchen an der Basis des Schwanzes und strecken Sie den Körper aus. Dies ist am einfachsten zu tun, indem Sie die Maus auf das Handgelenk legen und sanft die Basis des Schwanzes ziehen. Wenn das Weibchen schwanger ist, dann wird es wahrscheinlich Gewichtszunahme speziell im unteren Oberkörper geben, und es wird als kleine Klumpen erscheinen.
HINWEIS: Schwangerschaft kann bereits ab e12.5 greifbar sein und wird in den meisten Fällen durch e14.5 spürbar sein. C57BL6/J-Mäuse haben kleine Wurfgrößen, daher könnte das Weibchen schwanger sein, auch wenn es keine körperlichen Anzeichen gibt.
2. Zerlegung von Weibchen und Embryonen zur Herzerholung
- Bereiten Sie vor Beginn der Zerlegung die folgenden Lösungen bei Raumtemperatur vor.
- Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in Phosphatgepufferter Saline (PBS) in einer Konzentration von 0,5 mM auflösen.
HINWEIS: Nach der Vorbereitung ist es vorzuziehen, die Lösung auf Eis zu halten und nur bei 4 °C zu verwenden. Wenn eine Kontamination ein Problem darstellt, sollte sie vor der Verwendung autoklaviert werden. - Paraformaldehyd (PFA) in 4% Konzentration in PBS auflösen.
HINWEIS: Nach der Vorbereitung ist es vorzuziehen, die Lösung auf Eis zu halten und nur bei 4 °C zu verwenden. Bei 4 °C oder kälter für langzeitige Lagerung lagern. Die Konzentration der PFA-Lösung kann je nach den nachgeschalteten Anwendungen der Gewebeproben variieren. Dieser Prozentsatz wird für Hämatoxylin- und Eosinfärbung, Immunhistochemie und immunfluoreszierende Färbung verwendet.
- Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in Phosphatgepufferter Saline (PBS) in einer Konzentration von 0,5 mM auflösen.
- Sobald das Weibchen das gewünschte Schwangerschaftsstadium erreicht hat, sollte die Maus zur richtigen Tageszeit gemäß den anerkannten Richtlinien für die Tierverwendung eingeschläfert werden. Wenn die Zeiten am halben Tag (z.B. e15.5) sind, sollten sie gegen 12 Uhr geopfert werden. Wenn die Zeiten an ganzen Tagen (z.B. e15.0) sind, sollten sie gegen 12 Uhr geopfert werden.
HINWEIS: Es wird angenommen, dass die Empfängnis in der Nacht, in der die Mäuse gepaart sind, gegen Mitternacht auftritt. Es ist jedoch schwierig, den genauen Zeitpunkt der Empfängnis zu bestimmen. Aus diesem Grund wird das Timing geschätzt, nicht genau. - Nach dem Anheften der vier Gliedmaßen nach unten, sorgfältig einen I-förmigen Schnitt entlang des Oberkörpers, beginnend um die Harnröhre bis zum Brustbein.
- Die Gebärmutter wird sich wahrscheinlich direkt über dem Beckenbereich befinden. Die Maus-Gebärmutter ist Y-förmig; daher wird es wahrscheinlich sehr lang und um den Oberkörper gewickelt sein. Entfernen Sie es, indem Sie es vorsichtig anheben. Tun Sie dies mit den Seiten der feinen Zange in einer Schaufelbewegung. Die oberflächlichen Gewebe der Gebärmutter können sehr sorgfältig von den Spitzen der feinen Zange beim ersten Herausziehen der Gebärmutter gegriffen werden. Verwenden Sie eine Schere, um die Gebärmutter aus dem Körper zu schneiden.
HINWEIS: Achten Sie unter Berücksichtigung der ungewöhnlichen Y-förmigen Gebärmutter, stellen Sie sicher, dass die gesamte Gebärmutter entfernt wird. - Die Gebärmutter in eiskaltem PBS einweichen. Pin ein Ende der Gebärmutter nach unten und strecken Sie es in eine einzige Linie.
- Schneiden Sie die Gebärmutter in Abschnitte, die jeweils einen separaten Embryo enthalten. Den Embryo vorsichtig mit feiner Zange herausziehen. Dies ist am einfachsten mit einem Paar Zangen in jeder Hand zu tun. Nach dem Entfernen den Embryo sofort in eine neue Petrischale geben, die mit PBS-EDTA-Lösung bei 4 °C gefüllt ist.
HINWEIS: Normale PBS-Lösung kann auch verwendet werden, aber die EDTA verhindert die Gerinnung in den Proben. - Inszenieren Sie die Embryonen mit Theiler Staging21. Da die Inszenierung zwischen Embryonen innerhalb eines einzigen Wurfes variieren kann, inszenieren Sie jeden einzelnen Embryo.
HINWEIS: Dies kann auch eine Voraussicht in die möglichen angeborenen Herzfehler in den Embryonen bieten. Typischerweise können Symptome eines angeborenen Herzfehlers in der embryonalen Morphologie beobachtet werden. Andere größere Defekte, die oft mit bestimmten Herzerkrankungen verbunden sind, können vorhanden sein. - Das Herz kann auf verschiedene Weise entfernt werden, abhängig vom Alter des Embryos.
HINWEIS: Wenn unklar ist, ob der Abflusstrakt während der Entfernung intakt bleibt, entfernen Sie entweder mehr Gewebe als nur das Herz (den Abflusstrakt intakt zu halten und den direkten Kontakt zwischen Herz und Zange zu minimieren) oder analysieren Sie den gesamten Embryo.- Positionieren Sie den Embryo mit einem Sezierbereich und zwei Paarfeinern auf dem Rücken und stabilisieren den Zugang zur Brust. Dies kann durch anheften die Arme mit der Zange oder das Entfernen der Arme und halten den Oberkörper in Position zu tun.
- Verwenden Sie den scharfen Punkt eines zweiten Paarfläschen, um einen Schnitt entlang des Brustbeins des Embryos zu machen und sich zwischen den Clavusen bis zum Nabel zu erstrecken. Beginnen Sie mit sehr feinen und oberflächlichen Schnitten, während Sie allmählich auf das Innere der Brusthöhle hinarbeiten. Das Herz sollte kaum sichtbar werden. Kontaktieren Sie sie während dieser oberflächlichen Schnitte nicht mit der Zange.
- Den Rippenkäfig mit dem ersten Zangenpaar offen ziehen, um sanft auf den Rumpf des Embryos zu drücken, leicht kaudal zum Rippenkäfig. Das Herz sollte herausspringen oder sichtbar werden. Das Herz kann einige sanfte Koaxing erfordern, um herauszukommen. Verwenden Sie die Seite der Zange, um sicherzustellen, dass der Punkt der Zange nie in Kontakt mit dem Herzen kommt. Um den Arbeitsbereich und die Zange sauber zu halten, halten Sie ein fusselfreies Wischen in der Nähe.
- Greifen Sie vorsichtig die Lungenblutgefäße mit den Seiten der Zange, stellen Sie sicher, dass das Gewebe nicht zu trennen, und ziehen Sie das Herz aus der Brusthöhle. Dann reinigen Sie das Herz.
HINWEIS: Bei Embryonen e13.5 und jünger wird das Herz durch das Perikard abgedeckt. Diese muss entfernt werden, um das Herz zu erreichen.
- Mit einem Stereoskop, nehmen Sie ein Foto des Herzens für spätere Referenz.
- Spülen Sie die Herzen in PBS-EDTA-Lösung für 1-2 min, und legen Sie sie dann in 4% PFA-Lösung für ca. 45-60 min, um sie zu beheben. Wenn die Analyse des gesamten Embryos gewünscht wird, über Nacht einweichen. Das Volumen der PFA-Lösung sollte 5-6x das Volumen des zu fixierenden Gewebes betragen.
HINWEIS: Diese Inkubationszeit kann je nach späteren Studien variieren. Diese Inkubationszeit wird für Hämatoxylin- und Eosinfärbung, Immunhistochemie und immunfluoreszierende Färbung verwendet. - 5-10 min mit PBS-Glycin 3x waschen und wieder in PBS geben. Natriumazid oder Penicillin/Streptomycin kann auch hinzugefügt werden, um das Bakterienwachstum zu minimieren und intaktes Gewebe zu erhalten. Die Herzen können nun kurzfristig bei 4 °C gelagert werden.
3. Gewebevorbereitung
HINWEIS: Gewebe können entweder mit OCT (optimale Schnitttemperatur) Einbettung oder Paraffineinbettung hergestellt werden. Es gibt Vor- und Nachteile für beide Methoden, und das Ziel der Analyse sollte bei der Entscheidung, welche Einbettungsmethode verwendet werden soll, berücksichtigt werden.
- OCT-Einbettung
HINWEIS: Diese Methode kann der Einbettung von Formalin/Paraffin vorzuziehen sein, da Kryosections die Antigenreaktivität erhalten, immer noch für Hämatoxylin- und Eosinfärbungen verwendet werden können und Scheiben schneller produzieren.- Bereiten Sie eine In-PBS gelöste Saccharoselösung mit einer Konzentration von 30 % (w/v) vor.
- Übertragen Sie das Gewebe in ein neues 15 ml konisches Rohr oder 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das PBS-30% Saccharose enthält. Zunächst wird das Gewebe schweben.
- Legen Sie es bei 4 °C in den Kühlschrank. Das Gewebe wird bereit für OCT Einbettung bereit sein, wenn es auf den Boden des Rohres sinkt, in der Regel in 24-40 h.
HINWEIS: Muskelgewebe leiden während frost-/tauenzyklen erheblich und verlieren ihre native Morphologie. Saccharose wird vom Gewebe absorbiert und wirkt als Kryokonservierungsmittel, das eine verbesserte Konservierung der Morphologie ermöglicht. Stellen Sie sicher, dass genügend Lösung im Rohr vorhanden ist, damit das Schwimmen der Gewebe ausreichend überwacht werden kann. PBS-Saccharose ist leicht mit Bakterien kontaminiert, so überprüfen Sie die Lösung häufig auf Trübung, die entweder Pilz oder bakterielle Überwucherung zeigt. Um das Kontaminationsrisiko zu minimieren, kann der PBS-Saccharoselösung entweder Penicillin/Streptomycin oder Natriumazid zugesetzt werden. - Entfernen Sie die Herzen mit einer Pasteur Pipette, stellen Sie sicher, dass das Öffnen der Pipette breit genug ist, um das Gewebe nicht zu reißen. Schneiden Sie die Pipette bei Bedarf mit einer Schere. Wenn Sie mit ganzen Embryonen arbeiten, verwenden Sie Zangen, um die Probe abzurufen.
HINWEIS: Tun Sie dies vorsichtig. Auch wenn die Pipetteöffnung breit genug ist, um die Herzen zu bergen, können die Ränder der Pipette das Gewebe noch reißen. Zangen können Gewebeproben einrücken, wenn sie zu aggressiv verwendet werden. - Lassen Sie das Gewebe kurz auf einem fusselfreien Wisch trocknen. Legen Sie die Probe in einer OCT-Form in die gewünschte Position zum Schneiden (d. h. sagittal, quer, koronal). Fügen Sie OCT-Verbindung hinzu, bis die Probe vollständig untergetaucht ist, um sicherzustellen, dass keine Blasen in Kontakt mit dem Gewebe sind.
- Legen Sie die Form bei -20 °C über Nacht oder mehrere Tage und bewegen Sie die Form dann auf -80 °C. Nach 24 h ist die Form zum Kryosektionen bereit. Gewebe in diesem Format können langfristig gelagert werden.
- Paraffin Einbettung
- Mit Ethanol, dehydrieren Sie das Gewebe in dieser Folge: 50% Ethanol für 10 min, 70% Ethanol für 10 min, 80% Ethanol für 10 min, 95% Ethanol für 10 min, 100% Ethanol für 10 min (do this 3x).
- Das Gewebe in einer Reihe von Ethanol/Xylol-Lösungen in dieser Folge einweichen: 2:1 Ethanol/Xylol-Lösung für 10-15 min, 1:1 Ethanol/Xylol-Lösung für 10-15 min, 1:2 Ethanol/Xylol-Lösung für 10-15 min, 100% Xylol für 10-15 min (do this 3x).
- Um das Xylol durch Paraffin zu ersetzen, Das Gewebe in einem Vakuumofen (zwischen 54-58 °C) in dieser Folge einweichen: 2:1 Xylol/Paraffinlösung für 30 min, 1:1 Xylol/Paraffinlösung für 30 min, 1:2 Xylol/Paraffinlösung für 30 min, 100% Paraffin für 1-2 h, 100% Paraffin für 1-2 h oder über Nacht.
HINWEIS: Wenn sie das Gewebe über einen längeren Zeitraum über 60 °C erhitzen, werden die Paraffinpolymere abgebaut und das Gewebe spröde. - Mit frischem Paraffin, betten Sie das Gewebe in der gewünschten Position.
4. Kryostatschnitt für OCT-Eingebettete Gewebe
- Legen Sie am Kryostat alle Proben mindestens 1 h ins Innere, wenn die Proben zuvor im Gefrierschrank -80 °C gelagert wurden. Sie sollten dort bleiben, bis alle Abschnitte gesammelt sind.
- Stellen Sie sicher, dass der Kryostat auf die richtigen Temperatureinstellungen eingestellt ist. Die Umgebungstemperatur in der Kryostatkammer sollte bei etwa -20 °C und der Arm des Kryostats bei etwa -24 °C liegen.
HINWEIS: Diese Temperatur kann variieren, je nachdem, wie der Block auf das Schneiden reagiert. Wenn inkonsistentes Schneiden ein Problem ist, könnte die Temperatur der Umgebung gesenkt werden. - Entfernen Sie den OCT-Block aus seiner Form, indem Sie an den Rändern der offenen Seite der Form ziehen, um ihn zu lösen, und dann den Block am geschlossenen Ende kneifen, wo sich die Form verengt.
- Um den OCT-Block zu montieren, legen Sie die Raumtemperatur OCT auf das Futter, beginnend von der Mitte und arbeiten bis zum Rand. Das gesamte Futter muss nicht abgedeckt werden.
- Legen Sie den OCT-Block (siehe Schritt 3.1) auf die Form. Die Kante des Blocks, die gegen die geschlossene Seite der Form war, sollte nach oben auf dem Futter sein. Lassen Sie das OCT auf dem Futter einfrieren, bis es undurchsichtig weiß ist, ca. 5-10 min.
- Legen Sie das Futter auf den Arm für weitere 5-10 min für den Block auf die Armtemperatur zu kommen. Um eine parallele Scheibe zu erhalten, passen Sie den Arm so an, bis der Rand des Blocks parallel zur Bühne ist und es einen gleichmäßigen Abstand zwischen der Bühne und dem unteren Rand des Blocks gibt, der mit der Bühne und dem oberen Rand des Blocks identisch ist.
- Legen Sie die Klinge ein, und passen Sie den Abstand des Blocks von der Klinge an, um Abschnitte zu nehmen.
- Nehmen Sie Scheiben mit einer Dicke von 10 m. Schneiden Sie so lange, bis der Point of Interest entweder manuell oder mit der Trimmfunktion erreicht ist.
- Um Scheiben zu sammeln, verwenden Sie einen kleinen flachen Pinsel und einen Detailpinsel. Wenn die Form zu schneiden beginnt, verwenden Sie die flache Bürste, um die Scheibe vorsichtig gegen den Ständer zu ziehen. Beim Durchschneiden der Probe muss die Bewegung kontinuierlich und ohne Pause sein, obwohl die Geschwindigkeit von der Festigkeit der Probe abhängen kann.
- Verwenden Sie beim Schneiden die flache Bürste, um die Scheibe vorsichtig zu lenken, während sie hergestellt wird. Die Scheibe muss an dieser Stelle nicht bündig mit der Bühne sein, also lassen Sie sie, um keine Risse oder Züge zu verursachen und die Histologie zu beeinflussen.
HINWEIS: Beim Schneiden ganzer Embryonen kann dieser Teil besonders schwierig sein, insbesondere wenn Gewebetypen gewechselt werden. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben ohne Pausen gemacht werden und der Pinsel nicht zu aggressiv an den Scheiben zieht. Wenn sich gewebetypen ändern, kann die Scheibe brechen, daher ist es entscheidend, die Temperatur kalt zu halten. Wenn Bruch ein Problem ist, verringern Sie die Temperatur oder erhöhen Sie die Dicke der Probe. - Halten Sie die Bewegung des Blocks an, sobald die Probe vollständig durchgeschnitten ist, aber die Scheibe ist noch nicht frei vom Block. Ohne den flachen Pinsel aus der Scheibe zu bewegen, verwenden Sie den Detailpinsel, um die Scheibe nach unten zu klopfen, um sie flach zu machen und gegen die Bühne einzufrieren.
- Halten Sie die Scheibe dort für 10 s, bevor Sie den Detailpinsel entfernen und die Scheibe fertigstellen. Verwenden Sie die beiden Pinsel, um die Scheibe sanft gegen die Bühne abzuflachen, ein Rollen zu verhindern und sie für 20-30 s auf die Bühne zu stellen.
- Drehen Sie die Scheibe und flachen Sie wieder gegen die Bühne. Bewegen Sie eine elektrostatisch geladene Folie so nah, dass die Scheibe angezogen werden kann, und haften Sie an der Folie, ohne die Folie zur Bühne berühren zu müssen. Beschriften Sie die Folien mit einem Bleistift.
- Bewahren Sie die Dias in einer luftdichten Box auf, um das Gewebe während der Lagerung vor Eisbildung zu schützen. Für die kurzfristige Lagerung sollten Dias vor der Färbung bei -20 °C gelagert werden. Für die Langzeitlagerung bei -80 °C aufbewahren.
5. Mikrotomschnitt für Paraffin-eingebettete Gewebe
- Legen Sie die Blöcke vor dem Schnitt auf Eis, um die Proben zu kühlen. Wenn sie kühl sind, schneidet Paraffin leichter und kann dünnere Scheiben produzieren.
- Bereiten Sie ein 40-45 °C Wasserbad mit Reinstwasser vor.
- Legen Sie die Klinge in den Halter innerhalb des Mikrotom. Stellen Sie sicher, dass es sicher ist, und stellen Sie dann den Abstandswinkel ein. Stellen Sie sicher, dass der Abstandswinkel korrekt ist. Dies kann nach den Anweisungen des Herstellers überprüft werden.
- Legen Sie den Paraffinblock in das Mikrotome. Stellen Sie sicher, dass es richtig ausgerichtet ist, so dass die Klinge gerade über den Block schneidet.
- Stellen Sie sicher, dass die Klinge korrekt mit dem Block ausgerichtet ist, indem Sie ein paar Scheiben machen. Tun Sie dies sorgfältig, damit Anpassungen vorgenommen werden können.
- Trimmen Sie den Block, bis der Point of Interest erreicht ist.
- Machen Sie Scheiben in der gewünschten Dicke. Berücksichtigen Sie, dass die ersten Slices wahrscheinlich verworfen werden.
- Nehmen Sie die Abschnitte auf und bewegen Sie sie mit Zangen ins Wasserbad. Dadurch sollten die Abschnitte abgeflacht werden. Verwenden Sie die Zange, um sie nach Bedarf anzupassen.
- Bewegen Sie eine elektrostatisch geladene Rutsche so nah, dass die Scheibe angezogen und an der Folie haften kann. Beschriften Sie die Folien mit einem Bleistift.
- Platzieren Sie alle gesammelten Dias in einem Dia-Rack. Lassen Sie die Dias über Nacht bei 37 °C trocknen.
6. Entparaffinierung von Geweben
- Die Dias in der folgenden Reihenfolge waschen: 3 min in Xylol (2x), 3 min in einer 1:1 Xylol/100% Ethanollösung, 3 min in 100% Ethanol (2x), 3 min 95% Ethanol, 3 min in 70% Ethanol, 3 min in 50% Ethanol.
7. Hämatoxylin- und Eosinfärbung
- Bereiten Sie die Folien für die Färbung vor.
- Wenn Sie OCT-vorbereitetes Gewebe verwenden, in destilliertem Wasser für 4 min einweichen, bis OCT aufgelöst ist und trocknen lassen.
- Bei Verwendung von Paraffin-eingebetteten Geweben müssen diese deparaffinisiert werden. Siehe Schritt 6.1.
- Legen Sie die Rutsche 10 min in gefiltertes 0,1% Hämatoxylin. Legen Sie die Rutsche in destilliertes Wasser, wechseln Sie das Wasser sofort und dann wieder nach 3 min.
- Legen Sie die Rutsche in 0,5% Eosin für 10 s oder tauchen Sie 12x. Tauchen Sie die Rutsche in destilliertes Wasser, bis das Eosin nicht mehr streifen, etwa 2-3 Dips.
- Dehydrieren Sie den Schlitten, indem Sie 50% Ethanol für 10 s, 75% Ethanol für 10 s, 95% Ethanol für 30 s und 100% Ethanol für 1 min. In Xylol tauchen, bis Xylol glatt herauskommt, 5-7 Dips.
- Lassen Sie Xylol verdampfen und montieren Sie es mit einem schnell trocknenden Montagemedium, das einen Brechungsindex in glasnähe hat.
8. Qualitative Analyse von allgemeinen Herzfehlern
- Nehmen Sie Bilder aller Proben mit einem invertierten oder Stereomikroskop und der entsprechenden Kamera auf. Nehmen Sie makroskopische und mikroskopische Bilder, abhängig von der Art der analysierten Defekte. Makroskopische Bilder können mit jeder Vergrößerung unter 10x aufgenommen werden. Mikroskopische Bilder sollten bei 40-facher Vergrößerung oder höher aufgenommen werden. Die Fotos, die in diesem Papier aufgenommen wurden, wurden mit 5-facher Vergrößerung mit einem Stereomikroskop und einem 40-fachen Luftobjektiv (Objektiv N.A. von 0,55) mit einem invertierten Mikroskop aufgenommen.
HINWEIS: Makroskopische Bilder sind ein guter Ausgangspunkt, da sie eine Ansicht auf das gesamte Herz bieten (Abbildung 3). Wenn sich Muster identifizieren, können bestimmte Bereiche fokussiert und weiter untersucht werden. - Richten Sie alle Bilder nebeneinander auf einem Computerbildschirm aus. Haben Sie alle Bilder von Kontrollproben auf einer Seite des Bildschirms und alle Bilder von experimentellen Proben auf der anderen Seite des Bildschirms. Es ist am besten, eine Behandlungsgruppe nach der anderen zu analysieren.
- Achten Sie auf Unterschiede in den Phänotypen zwischen den Behandlungsgruppen, beginnend bei Schlüsselbereichen, in denen häufige Herzfehler auftreten. Dies hängt davon ab, ob die Bilder makroskopisch sind, die grobe Anatomie des Herzens darstellen, oder mikroskopisch, die mikroskopische Anatomie des Herzgewebes darstellen.
- Beginnen Sie mit der Suche nach häufigen makroskopischen Herzfehlern, wie ventrikulären Septumdefekten (Abbildung 2A), vorgerichtlichen Septumdefekten (Abbildung 2B) und Patent ductus arteriosus (Abbildung 2C). All diese Defekte sind am leichtesten in der Quersicht des Herzens zu erkennen.
- Um Septumdefekte zu identifizieren, sollten Sie mehrere Scheiben betrachten, da sie in einer Ebene des Gewebes und nicht in einer anderen beobachtet werden könnten.
HINWEIS: Manchmal ist ein Defekt nicht das Fehlen eines Septums, sondern ein Loch im Septum. Achten Sie daher darauf, einen Riss nicht mit einem Septaldefekt zu verwechseln. Die Suche nach Konsistenzen zwischen nahe gelegenen Slices in einer bestimmten Region kann bestätigen, ob es sich tatsächlich um einen Defekt oder einen Riss beim Schneiden handelt. - Um Defekte im Abflusstrakt zu identifizieren, wie z. B. den Patentductus arteriosus, verwenden Sie mehrere Scheiben, um den wichtigsten Blutgefäßen beim Verlassen des Herzens zu folgen. Erstellen Sie ein Bild der wichtigsten Blutgefäße relativ zueinander. Ein Beispiel ist in Abbildung 2Cdargestellt.
HINWEIS: Einige Unregelmäßigkeiten können auf das Entwicklungsstadium eines Embryos zurückzuführen sein (z. B. schließt der Patent ductus arteriosus postnatal kurz nach der Geburt; das ventrikuläre Septum schließt sich erst ab 14,5). Einige andere häufige makroskopische Herzfehler, die nicht in den Zahlen enthalten sind, sind persistente truncus atereriosus, die am einfachsten bei e16.5 und höher erkannt werden können; Doppelauslass rechter Ventrikel (DORV), der in Scheiben nachgewiesen werden kann, in denen das Herz in den Abflusstrakt gelangt; und eine übergeordnete Aorta22. Ein häufiger mikroskopischer Herzfehler beinhaltet verminderte Muskelverdichtung (Abbildung 4).
9. Quantitative Analyse der Herzmuskelverdichtung mit Hämatoxylin und Eosin-gefärbten Geweben
- Anhand der makroskopischen Ansicht der gebeizten Gewebeproben (Abbildung 4A) identifizieren Sie einen Bereich von Interesse, der mit einer 40-fachen Vergrößerung abgebildet ist (Abbildung 4B). Für dieses Papier wurde die Wand des linken Ventrikels verwendet. Speichern Sie das Bild im gewünschten Format. Für dieses Papier wurden Bilder als .tif-Dateien gespeichert.
- Öffnen Sie das Bild in der ImageJ-Software.
- Stellen Sie das Bild auf 8 Bit ein. Dadurch kann das Bild das Schwellenwertwerkzeug im nächsten Schritt23,24verwenden. Wählen Sie dazu "Bild | Typ | 8-Bit".
- Legen Sie den Schwellenwert für das Foto fest. Der Zweck dieses Schritts besteht darin, nur die Pixel auszuwählen, die den Hintergrund darstellen, mit Ausnahme der Pixel, die die Gewebe23,24darstellen.
HINWEIS: Diese Fläche wird später subtrahiert. Ein korrekter Schwellenwert wählt die Pixel aus, die der Forscher aus der Oberfläche des Muskelgewebes ausschließen möchte. Daher sollte das Endergebnis das Gewebe in Graustufen enthalten und der Hintergrund wird ausgewählt.- Klicken Sie auf "ImageJ | Bild | Anpassen | Schwelle". Bewegen Sie die obere Leiste, um Schwellenwertanpassungen vorzunehmen. Schließen Sie das Fenster für Schwellenwertanpassungen, ohne weitere Änderungen vorzunehmen, sobald die gewünschten Abschnitte ausgewählt sind21.
- Verwenden Sie das Werkzeug Polygonauswahl, um den Platz auszuwählen, den das Gewebe einnimmt. Stellen Sie sorgfältig sicher, dass die Umrisse die Geweberänder nachzeichnen, da lose Spuren falsche Messungen liefern.
- Passen Sie die Messeinstellungen auf ImageJ so an, dass die Software nur den Pixelbereich misst, der mit dem Schwellenwertwerkzeug in Schritt 9.423ausgewählt wurde. "ImageJ | Analysieren | Festlegen von Messungen | Fläche und Limit auf Schwellenwert". Wählen Sie nur Fläche und Limit auf Schwellenwertaus.
- Messen Sie den Bereich der hervorgehobenen Pixel. "ImageJ | Analysieren | Maß". Dieser Wert stellt den Bereich des negativen Raums dar.
- Messen Sie die Fläche der gesamten Interessenregion. Dies ist der Bereich, der mit dem Werkzeug Polygonauswahl ausgewählt wurde. "Bild J | Analysieren | Festlegen von Messungen | Bereich". Wählen Sie nur Bereich aus, und deaktivieren Sie die Option Limit to Threshold. Dann messen, wählen Sie "Bild J | Analysieren | Maß".
- Berechnen Sie den Bereich, den das eigentliche Muskelgewebe innerhalb des Interessenbereichs belegt. Subtrahieren Sie die Fläche des negativen Raums von der Fläche der gesamten Interessensregion. Dieser Wert ist der Bereich des Muskelgewebes.
- Berechnen Sie den Muskelverdichtungsindex (MCI). Teilen Sie den Bereich des Muskelgewebes durch den Bereich der Region von Interesse.
Je größer der MCI-Wert, desto verdichteter ist der Muskel. Diese MCI-Werte können dann für statistische Analysen verwendet werden, um signifikante Veränderungen in der Muskelverdichtung zwischen Behandlungsgruppen zu testen (Abbildung 4C).
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Representative Results
Der Muskelverdichtungsindex wurde zwischen Herzen verglichen, die sich unter zwei verschiedenen Umgebungen, einer Steuerung und einer experimentellen Gruppe, entwickeln. Diese Protokolle wurden verwendet, um die Verdichtung von Muskelgewebe quantitativ zu analysieren, was statistische Analysen ermöglichte. Die Muskelverdichtung zeigte sich in den Versuchsherzen signifikant reduziert im Vergleich zu den Embryonen, die sich unter nichtexperimentellen Bedingungen entwickelten.
Embryonen wurden verworfen, wenn das Beobachtungszeitpunkt ungenau schien. Obwohl das verkümmerte Wachstum von Embryonen ein Ergebnis der Behandlung des Experiments sein könnte und es eine Bandbreite im Entwicklungsfortschritt gibt, wurde die Züchtung ausreichend verteilt, um den Zeitpunkt der Embryoentwicklung zu gewährleisten. Die Inszenierung der Embryonen erfolgte mit Theiler Staging21. Die Proben wurden als schlecht geschnitten angesehen, wenn die Scheiben nicht konsistenzhaltig waren oder offensichtliche Risse oder Falten aufwiesen. Färbung bot genügend Kontrast, um die Gewebekanten zu machen, war aber nicht so dunkel, dass Zellmerkmale ununterscheidbar waren. Die Dias wurden dann mit einem invertierten Mikroskop mit einem 40-fachen Objektiv abgebildet. MCI-Werte wurden mit ImageJ-Software und Microsoft Excel berechnet. Diese MCI-Werte wurden mit einem T-Test analysiert.
Abbildung 1: Plug-Assay führt zu C57BL6/J-Mäusen. (A) Eine Maus mit einem leicht identifizierbaren Kopulationsstecker. (B) Eine Maus ohne Kopulationsstecker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Häufige Herzfehler. Schemata der wahren erwarteten Morphologie eines angeborenen Herzfehlers. (A) Quersicht eines ventrikulären Septumdefekts. (B) Quersicht eines vorgerichtlichen Septumdefekts. (C) Patent ductus arteriosus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Hämatoxylin und Eosinfleck von e15.5 Herzen. (A) Ein gefärbtes Herz, das sich unter normalen Bedingungen entwickelt hat. Skala bar = 750 m . (B) Ein gefärbtes Herz, das sich unter experimentellen Bedingungen entwickelt hat. Maßstabsleiste = 750 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantitative Analyse der Muskelverdichtung zwischen Herzen, die sich unter normaler mütterlicher Ernährung entwickelt haben, und Herzen, die sich unter essentieller Fettsäuremangel bei mütterlicher Ernährung entwickelt haben. (A) Hämatoxylin und Eosin gefärbte Herzen in einer makroskopischen (5x) Ansicht. Skala Nagenstäbe = 1.000 m (B) Hämatoxylin und Eosin-gefärbte Herzen bei mikroskopischer Sicht (40x). Skalenbalken = 75 m (C) Die resultierenden Daten der Messungen des Muskelverdichtungsindex. Die Werte wurden mit einem T-Test (n = 4 pro Behandlungsgruppe) analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll untersucht die Techniken, die an der Analyse der Herzentwicklung in embryonalen Herzen beteiligt sind. Einige Einschränkungen dieser Methode sind die erforderliche körperliche Geschicklichkeit für die Vorbereitenden Techniken, die Übung erfordern können, und Geschicklichkeit mit Mikroskop-Bildgebung. Wenn die am Kryostat erhaltenen Scheiben chaotisch sind, die Hämatoxylin- und Eosinfärbung nicht klar ist, oder wenn die am Mikroskop aufgenommenen Bilder eine schlechte Beleuchtung haben, dann funktioniert die mit ImageJ verwendete Methode nicht. Eine Einschränkung der Schwellenwertfunktion der ImageJ-Software besteht darin, dass Pixel ausgewählt werden, die sich an einem Ende eines Schwellenwerts befinden, das vom Pixelwert abhängt. Daher werden alle Pixel, die auf der falschen Seite des Schwellenwerts vorhanden sind, falsch in die Berechnung einbezogen oder ausgeschlossen. Letztendlich ist die Fehlerbehebung für die Annahme der Protokolle für die Verwendung in einer Studie erforderlich.
Für den Fall, dass die Herzextraktion zu schwierig ist, sollten Sie das Überspringen von Schritt 2.8 in Betracht ziehen. Darüber hinaus sollten Sie mehr als nur das Herz und die Lunge aus der Brusthöhle entfernen. Das Ziel wird dann größer und leichter zu manipulieren, und der direkte Kontakt zwischen dem Herzen und den feinen Zangen wird minimiert. Beim Kryostatschnitt werden die Versuchsproben immer direkt mit Kontrollproben verglichen. Dies lässt Raum für Benutzerfehler, solange der Fehler in allen Beispielen konsistent ist. Um Benutzerfehler zu minimieren und falsche Ergebnisse zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass aus beiden Behandlungsgruppen vergleichbare Abschnitte erhalten werden. Wenn z. B. mehr als eine Person Abschnitte erstellt, stellen Sie sicher, dass eine Person eine gerade Anzahl von Abschnitten für Steuerelemente und alle Behandlungsgruppen erstellt und nicht nur eine Untergruppe. Schließlich wird beim Schwellenwert für Bilder in ImageJ das Schwellenwertwerkzeug verwendet, um maximale Freiheit bei der Auswahl von Pixeln zu ermöglichen, die Gewebe darstellen, und Pixeln, die dies nicht tun. Passen Sie bei Bedarf den Kontrast der Bilder an, um den Pixelwert des Hintergrunds vom Pixelwert des Gewebes weiter zu erhöhen. Obwohl es Fehlerbehebungsoptionen gibt, erfordern die Techniken immer noch ein hohes Maß an Fähigkeiten. Die Durchführung dieses Protokolls bietet jedoch Zugriff auf Daten, die in der Regel nicht in anderen kardialen Entwicklungsstudien gemessen werden. Daher könnte die Nutzung der Merkmale dieses Protokolls einen wesentlichen Beitrag zu einer wissenschaftlichen Untersuchung leisten.
Die Identifizierung der Auswirkungen experimenteller Behandlungen in der kardiologischen Forschung wird oft durch morphologische Bewertung untersucht. Dies ist insbesondere in der Entwicklungsbiologie der Fall, wo die Plazenta es schwierig macht, physiologische Merkmale der Sichentwicklung von Herzen zu messen. Daher verschiebt die morphologische Analyse, die Einblicke in die Funktion des Herzens ermöglicht, den Verlauf der Entwicklungsbiologieforschung dramatisch. Obwohl die meisten Papiere die Dicke des Herzmuskels analysieren, um die Stärke des Herzens zu bestimmen, könnte die direkte Messung der Muskelverdichtung weitere Einblicke in die Physiologie des sich entwickelnden Säugetierherzens geben25,26,27.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben zu berichten.
Acknowledgments
Das Aguirre Lab wird vom National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health unter der Nummer K01HL135464 und von der American Heart Association unter der Nummer 19IPLOI34660342 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
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