Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Ковалентное присоединение одиночных молекул для спектроскопии силы на основе AFM

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60934
Automatic Translation
1, 1, 1,3, 2, 1,3
1Institute of Physical Chemistry, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry, Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

Summary

Ковалентное присоединение молекул зонда к атомной силовой микроскопии (AFM) наконечники кантилевера является важным методом для исследования их физических свойств. Это позволяет нам определить силу растяжения, силу опреснения и длину полимеров с помощью спектроскопии одной молекулы на основе AFM с высокой воспроизводимостью.

Abstract

Атомная силовая микроскопия (AFM) на основе одномолекулярной силовой спектроскопии является идеальным инструментом для исследования взаимодействия между одним полимером и поверхностями. Для истинного эксперимента с одной молекулой, ковалентное вложение молекулы зонда имеет важное значение, потому что только тогда могут быть получены сотни следов силового расширения с одной и той же одной молекулой. Многие следы, в свою очередь, необходимо доказать, что одна молекула только зондируется. Кроме того, passivation имеет решающее значение для предотвращения нежелательных взаимодействий между одной молекулы зонда и AFM cantilever отзыв, а также между AFM кантилевер наконечник и основной поверхности. Представленный здесь протокол функционализации надежен и может быть легко применен к различным полимерам. Характерные события одной молекулы (т.е. растяжки и плато) обнаруживаются в следах форс-расширения. Из этих событий могут быть получены физические параметры, такие как сила растяжения, сила desorption и длина desorption. Это особенно важно для точного исследования стимулов-ответных систем на уровне одной молекулы. В качестве образцовых систем поли (этиленгликоль) (PEG), поли (N -изопропилокриламимид) (PNiPAM) и полистирола (PS) растягиваются и desorbed от SiOx (для PEG и PNiPAM) и из гидрофобных самособранных монослойных поверхностей (для PS) в адгектной среде.N

Introduction

С момента своего изобретения в 1980-хгодах 1, атомной силы микроскопа (AFM) стал одним из наиболее важных методов визуализации в естественных науках с участием суб-нанометров пространственного разрешения, под-piconewton силовое разрешение и возможность измерения в различных условиях растворителя и температуры2,3,4,5,6,7.

Помимо изображения8,,9, AFM используется для выполнения одноймолекулярнойсиловой спектроскопии (SMFS), дающей представление о клеевом взаимодействии между одним полимером и поверхностями, физических свойствах одного полимера и разворачивающихся механизмов белков7,,10,,11,12,13,,14,,15,16. В регулярном эксперименте SMFS, функционализированный кончик кантилевера вводятся в контакт с поверхностью так, что полимер на AFM cantilever наконечник физиорбирует на этой поверхности. Путем втягивать кончик cantilever AFM от поверхности, изменение в отклонении cantilever AFM преобразовано в усилие водя к кривой усилия-расширения4. Физические параметры, такие как растяжения силы, силы desorption и длина desorption может быть определена как зависит от различных параметров, таких как скорость вытягивания, время пребывания на поверхности, глубина отступа в поверхность, температура, растворитель17,18 и различные поверхности, как твердые субстраты, полимерные пленки или поддерживается липидных двухслойных19,20,21,22. Кроме того, полимер может быть исследован в различных пространственных направлениях, таким образом, исследуя фрикционные свойства полимера23,,24,,25,26.

Ковалентное крепление исследуемого полимера к наконечнику кантилевера AFM имеет важное значение для таких исследований. Таким образом, высокая доходность событий одной молекулы с одним и тем же полимером, привязанным к наконечнику AFM cantilever, предотвращает любые предубеждения результатов из-за калибровки весенней константы AFM cantilever27,28, различных точек крепления29 или различных полимеров (с различной длиной контура), таких как в случае экспериментов по наноловищему30,31,32. Кроме того, взаимодействие с другими полимерами, а также усреднения эффекты могут быть широко предотвращены18,28. Для ковалентного крепления полимера к наконечнику aFM cantilever могут быть применены различные типы химических модификаций, многие из которых обобщены в книге Хермансона33. Амин и тиол основе ссылок реакций, а также нажмите химии представляют собой наиболее часто используемые методы в AFM cantilever отзыв функционализации34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 показывают, как использовать 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC)/NHS химии прикрепить белок к aFM кантилевер наконечник. Тем не менее, указанные функциональные группы, как правило, перекрестные ссылки, что приводит к потере функциональности43,44. Также карбодиимиды демонстрируют склонность к быстрому гидролизу в растворе43. Группы малимид и тиол, как правило, более стабильны и не проявляют перекрестных реакций. Представленный протокол представляет собой оптимизацию ранее опубликованных протоколов, приведенных в ссылках35,,39.

Здесь представлен надежный протокол функционализации, который может быть легко приспособлен к большому количеству различных полимеров, независимо от таких свойств, как длина контура или гидрофобность. На примере были выбраны три различных полимера: гидрофильный полиэтиленгликоль (PEG) и поли(N-изопропилакриламид) (PNiPAM), а также высокой молярной массы гидрофобного полистирола (ПС). Для того, чтобы обеспечить ковалентную связывающую способность с соответствующей молекулой связующего, три полимера были выбраны для показа телехелика тиол муати в качестве функциональной конечной группы. Сама молекула связующим звеном, как правило, является коротким полимером ПЭГ с двумя активными участками, группой силана на одном конце и группой маеймида на другом конце. Первый позволяет ковалентное вложение к наконечнику кантилевера AFM, а второе является связывающей реакцией с группой тиола функционализированного полимера высокой молярной массы. Кроме того, неактивные молекулы связующих PEG служат в качестве пассивации слоя для предотвращения нежелательных взаимодействий между зондом полимера и AFM кантилевер отзыв, а также между AFM кантилевер отзыв и основной поверхности.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1 для схематического обзора.

1. Установка реагента

ПРИМЕЧАНИЕ: Полимеры, используемые для этого протокола являются: маеймид-полиэтилен гликоль-триэтоксизилан (силан-PEG-mal, 5 кДа), тиол-полиэтилен гликол-тиол (HS-PEG-SH, 35 kDa), тиол прекращается поли(N-изопропилакриламид) (PNiPAM-SH, 637 kDa) и тиол прекращается полистирол (PS-SH, 1,3 мДа).

  1. Подготовка четко определенных и высокой молярной массы PNiPAM-SH через атом передачи радикальной полимеризации, а затем преобразование и сокращение функциональной конечной группы для введения тиол moiety, как описано в литературе18. Пожалуйста, смотрите рисунок 1 для подробных структур.
  2. Для хранения химических веществ, подготовить меньшие aliquots в сухой системе перчаточные ящики с азотной атмосферой, чтобы избежать воздействия атмосферного кислорода и влаги. PEG и PNiPAM являются гигроскопические45,46 и функциональных конечных групп PEG, PNiPAM и PS, как известно, легко окисляется при хранении в условиях окружающей среды33,47,48. Все химические вещества должны храниться при -20 градусах Цельсия.
  3. Используйте аналитические растворители класса или выше. Кроме того, используйте ультрачистую воду для промывки AFM cantilevers чипов и стеклянной посуды, потому что эксперименты одной молекулы очень чувствительны ко всему загрязнению.

2. Установка оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пинцет и стаканы из нержавеющей стали или стекла. Используйте перевернутый пинцет для безопасного сцепления (например, модель R3 SA, имеющая низкую весеннюю константу).

  1. Приготовьте раствор RCA (ультрачистая вода, перекись водорода и аммиак (5:1:1)) для очистки стеклянной посуды и пинцета.
  2. Положите сосуды в стакан и заполните его RCA до тех пор, пока стеклянная посуда или пинцет полностью покрыты.
  3. Нагрейте стакан со ступени 2.2 на 1 ч при температуре 80 градусов по Цельсию.
  4. Промыть сосуды впоследствии с ультрачистой водой, пока не едкий запах не становится выяснен больше (по крайней мере в три раза).
  5. Сухая стеклянная посуда и пинцет в духовке (120 градусов по Цельсию).

3. Функционализация наконечника

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены в дымовой капот, чтобы избежать вдыхания органических паров. Кроме того, перчатки, лабораторное пальто и защита глаз не требуется. Используйте нитрила или латексные перчатки для каждого шага, чтобы избежать загрязнения. Носите растворитель устойчивых перчаток при использовании толуол. Все шаги, если не указано иное, выполняются на RT. Используйте свежее оборудование и перчатки для каждого шага, чтобы избежать возможного перекрестного загрязнения.

  1. Выполните активацию поверхности, применяя кислородную плазму к чипу AFM cantilever MLCT-Bio-DC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность плазменной обработки для дальнейшей функционализации шаги масштабируется с содержанием кислорода в плазменной камере.
    1. Используйте свежеочищенные пинцеты для размещения чипов aFM cantilever в плазменной камере (40 кГц, 600 Вт).
    2. Используйте пользовательскую программу активации: эвакуация (0,1 мбар) - затопление кислородом до давления: 0,2 мбар (4 мин) - плазменный процесс (мощность: 40%, продолжительность: 2 мин, давление процесса: 0,2 мбар).
    3. Вентилировать камеру и вести с шагом 3.2.2 немедленно для того, чтобы предотвратить любые адсорбции загрязняющих веществ для AFM кантилевер чипы из воздуха.
  2. Силанизация и PEGylation
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки является критическим параметром между шагами. Подготовьте решения как можно более свежие во время ожидания. Группы малимид ы могут подвергаться гидролизу в ваквистых носителях, а тиоллегко окисляются до дисульфидов в растворе33,47 препятствующих реакции функционализации наконечника AFM.
    1. Приготовьте силан-ПЕГ-маль-раствор в толуол (1,25 мг/мл) в растворителе устойчивых пластиковых или стеклянных трубках и залейте 6 мл раствора в плоские блюда Петри, по 3 мл каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперименте SMFS наблюдается связывание нескольких зондных полимеров, смешивание силана-ПЕГ-мала с нефункциональным силан-ПЕГ может уменьшить количество точек крепления. Для регулировки пассивного слоя ПЭГ с различными массами (т.е. длины контура) можно использовать27.
    2. Инкубировать чипы AFM cantilever сразу после шага 3.1.3 в силане-PEG-mal растворе (до 10 фишек за чашку Петри) по 3 ч при 60 C35.
    3. Возьмите блюда Петри из духовки и дайте раствору остыть в течение по крайней мере 10 мин.
    4. Тщательно промыть каждый чип AFM cantilever. Уменьшите влияние капиллярных сил на aFM cantilever при прохождении интерфейса с растворителем воздуха, например, наклоняя эти фишки немного при погружении в решение.
      1. Для PEG и PS полимеров, промыть три раза с толуолом.
      2. Для полимера PNiPAM, промыть один раз с толуолом и дважды с этанолом.
    5. Выберите по крайней мере две фишки AFM cantilever в качестве управления чипами AFM cantilever, пропустив шаг 3.3 и промойте их следующим образом, чтобы увеличить полярность растворителя:
      1. Для ПЕГ и PS полимеров, промыть дважды с этанолом и один раз с ультрачистой водой.
      2. Для полимера PNiPAM промыть дважды ультрачистой водой.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль AFM кантилевер чипы прошли через все этапы функционализации, кроме полимерного вложения (шаг 3.3). Они служат для доказательства чистоты процесса функционализации, системы держателя чипов AFM, поверхностей и растворителей, используемых для эксперимента SMFS.
  3. Ковалентное полимерное крепление
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что aFM кантилевер отзыв, как ожидается, будет полностью покрыта группами малимид, Есть только несколько связывающих сайтов для одного полимера зонда, потому что maleimide проходит гидролиз в воде, что приводит к неактивным PEGs47. Эти неактивные ПЭГ действуют как пассивный слой, как описано выше.
    1. Инкубировать aFM кантилевер ные фишки сразу после шага 3.2.5 в одном из следующих полимерных растворов в 3 мл блюд Петри. Если соответствующий полимер не растворяется должным образом, используйте водяную ванну 40 градусов и хорошо перемешайте раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как использование тиол прекращено полимеров может привести к образованию дисульфидных связей препятствует реакции с группами maleimide силан-PEG-mal, сокращение агента рекомендуется, в частности, если шаг 3.3 применяется в вакученных буферов для водорастворимых полимеров33.
      1. Для ПЕГ и PS полимеров, используйте концентрацию 1,25 мг/мл в толуол для 1 ч при 60 градусах Цельсия.
      2. Для полимеров PNiPAM используйте концентрацию 1,25 мг/мл в этаноле в течение 3 ч на RT.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперименте SMFS наблюдается связывание нескольких зондных полимеров, концентрация полимера должна быть снижена.
    2. Тщательно промыть каждый чип AFM cantilever.
      1. Для PEG и PS полимеров, промыть дважды с толуол, дважды с этанолом и один раз с ультрачистой водой после 10 минут остыть.
      2. Для полимеров PNiPAM промыть дважды этанолом и дважды ультрачистой водой.
    3. Храните каждый чип AFM cantilever отдельно в небольшой (1 мл) Петри блюдо заполнено ультрачистой водой при 4 градусах Цельсия до использования в эксперименте.

4. Подготовка поверхности

  1. Силиконовая оксидовая
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта поверхность была использована для SMFS с PEG и PNiPAM.
    1. Разрежьте оксида кремния на мелкие кусочки с помощью алмазного ножа.
    2. Положите кусочки оксида кремния отдельно в микроцентрифуговых трубках и заполните эти трубки этанолом.
    3. Снотировать кусочки оксида кремния в течение 10 мин.
    4. Промыть кусочки оксида кремния этанолом дважды и тщательно высушить их под потоком азота. Используйте кусочки оксида кремния немедленно.
  2. Самосборный монослой гидрофобного алкана тиола на золоте (SAM)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта поверхность была использована для SMFS с PS. Подробнее о SAM читайте вматериале 39,49.
    1. Для выполнения шагов 4.1.1 - 4.1.4) используйте кремниевую пластину с золотым покрытием (A 100, 5 нм титана, 100 нм золота).
    2. Инкубировать поверхностные части в растворе 1-додеканттиола (2 мМ) на 18 ч.
    3. Промыть свежеприготовленные SAMs в этанол дважды.
    4. Сухие ЗАД с потоком азота для прямого использования или хранить их в этаноле до 4 дней для последующего использования.

5. Приобретение данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Все измерения, показанные здесь, были выполнены в ультрачистой воде с помощью Cypher ES AFM с использованием стадии нагрева и охлаждения образца для изменения температуры. Как правило, все AFMs, обеспечивающие возможность измерения в жидкостях, могут быть использованы.

  1. Вставьте функционалированный чип AFM cantilever в AFM.
  2. Клей подготовленную поверхность в держатель образца, который подходит для измерения в жидкостях (например, репликационное соединение высокого разрешения 101RF или УФ-излечимый клей).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти связующие агенты очень инертны и устойчивы к большому количеству полярных растворителей. Устойчивость клея к неполярным растворителям (например, толуену или гексану) или высокие температуры должны быть проверены перед использованием.
  3. Погрузите чип AFM cantilever и образец зонда в жидкость, здесь: ультрачистая вода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Падение растворителя (около 100 л) может быть отложено на держатель чипа AFM cantilever. Покрытие чипа AFM cantilever с растворителем уменьшает капиллярные силы, которые в противном случае действуют на aFM cantilever при приближении к поверхности образца, проходящей через воздухорастворительинтерфейс.
  4. При необходимости отрегулируйте температуру и дайте системе уравновеситься.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения температуры могут привести к отклонению aFM кантилевер из-за биметаллического эффекта для AFM кантилеверов со светоотражающим покрытием, как алюминий или золото. Равновесие должно выполняться вдали от поверхности (несколько мкм) до тех пор, пока не будет наблюдаться дальнейшее изменение сигнала отклонения (до 15 мин для MLCT-Bio-DC).
  5. Изменяйте температуру случайным образом, чтобы исключить любые последствия старения функционализации. Убедитесь, что применяемые температуры не приводят к необратимому изгибу кантилевера AFM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любое влияние температуры на свойства растворителя (например, испарение или изменение вязкости) может помешать вашим экспериментам. В представленных примерах температура варьировалась в диапазоне до 40 К в шагах от 10 K с водой в качестве растворителя (например, от 278 K до 318 K).
  6. Подойдите к поверхности, чтобы определить InvOLS (обратная оптическая чувствительность рычага), взяв кривые силового расширения на твердую поверхность (например, оксид кремния). Для этого возьмите сигнал отклонения фотодетектора (в V) против пьезо расстояния и определить наклон части, представляющей отступ наконечника aFM кантилевер в основной поверхности (отталкивающий режим) с помощью линейной функции. Чтобы уменьшить количество ошибок, возьмите среднее значение не менее пяти значений, чтобы получить окончательное значение InvOLS. Для получения более подробной информации,,39см.4
    ПРИМЕЧАНИЕ: InvOLS может быть надежно определен только на твердых поверхностях. В случае экспериментов на мягких поверхностях или интерфейсах убедитесь, что вы поместите твердую поверхность близко к мягким поверхностям. Затем калибровка InvOLS может быть проведена до или после экспериментов на мягкой поверхности без необходимости разборки установки AFM.
  7. Для весны постоянн определение, переместить AFM кантилевер на высоту ни с привлекательными, ни отталкивающим взаимодействия между AFM cantilever кончик и поверхность (несколько мкм). Затем запишите тепловой шумовой спектр, где проецируется спектральная плотность мощности (PSD) против частоты. Следующие шаги обычно выполняются автоматизированными встроенными функциями в коммерческом программном обеспечении AFM: во-первых, приобретенный тепловой шумовой спектр анализируется путем установки функции на PSD, например, простой гармонический осциллятор (SHO). Пригонка делается до минимума между первым и вторым резонансом. Во-вторых, определяется область под установленной частью участка PSD против частоты, представляющая среднее квадратное смещение кантилевера AFM в вертикальном направлении. Наконец, теорема экипировки используется для получения силы AFM cantileverпостоянной 28,50.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий диапазон частот должен быть использован, включающий первый резонансный пик кантилевера AFM. Чтобы получить удовлетворительное соотношение сигнала к шуму, необходимо накопить не менее 10 PSD с максимально возможным разрешением частоты.
  8. Начните эксперимент. Записывающие карты силы, принимая кривые силового расширения в сетке, как мода (например, 10 х 10 точек на площадь 20 х 20 мкм2),чтобы избежать каких-либо локальных поверхностных эффектов (например, примесей, вывихов) и в среднем различных областях поверхности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичными параметрами являются скорость вытягивания 1 мкм/с и скорость отбора проб 5 кГц для обеспечения достаточного разрешения. Коэффициент отбора проб должен быть адаптирован, когда скорость вытягивания различна. Расстояние убирания должно быть адаптировано к контуру или длине обезвоживания измеренного полимера (приблизительно в два раза больше ожидаемой длины).
  9. Используйте и изменяем время пребывания к поверхности, чтобы один полимер прилипнуть к поверхности (обычно 0 - 5 с).
  10. Повторите определение InvOLS и весенней константы в конце эксперимента, чтобы проверить последовательность и стабильность системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сильной слипания между полимером и поверхностью, калибровка может быть сделана после фактического эксперимента, чтобы сохранить функционализацию.

6. Оценка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки данных для выполнения следующих шагов использовалось специально написанное программное обеспечение на основе Igor Pro.

  1. Преобразуйте необработанный сигнал отклонения (в Вольтах) в значения силы (в Ньютонах) путем умножения с записанными InvOLS и определенной константой пружины.
  2. Вычтите отклонение кантилевера AFM (после умножения необработанного сигнала отклонения с InvOLS) с расстояния, управляемого элементами пьезо в вертикальном направлении, чтобы получить истинное расширение (расстояние наклона поверхности)4.
  3. Исправьте кривые форс-расширения, полученные для дрейфа, подойдя линейную функцию к исходной линии после последнего события и вычитая то же самое из кривой форс-расширения. Приспособленная часть должна представлять собой достаточное расширение от поверхности, где ни привлекательные, ни отталкивающим взаимодействия не наблюдаются между наконечником AFM cantilever и основной поверхностью. Затем базовая линия устанавливается на нулевую ось.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае измерений на высоко отражающих поверхностях, таких как золото, могут появиться помехи. Они являются результатом частичного отражения лазерного луча с поверхности и с обратной стороны кантилевера AFM. Таким образом, полученные кривые силового расширения могут показать синусоидальный артефакт сигнала силы вдоль вертикального расширения. Это артефакт, который препятствует значениям конечной силы. Для того, чтобы все еще принимать эти кривые силы расширения во внимание, возможна коррекция(рисунок 2).
  4. Если помехи появляются в кривых форс-расширения, выберите репрезентативную кривую force-extension (кривая опрокидывания), не показывающую никаких других событий, кроме возможно пика неспецифической слипки и того же синусоидального артефакта (т.е. амплитуды и фазы) (Рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гладкая репрезентативной кривой форс-расширения для получения низкочастотной модели помех.
  5. Выберите кривую силового расширения, которая должна быть исправлена(рисунок 2B).
  6. Накладывай обе кривые силового расширения со ступеней 6.4. и 6,5. чтобы убедиться, что оба показывают тот же синусоидальный артефакт (т.е. амплитуда ифазы) (рисунок 2C).
  7. Вычесть (сглаженную) репрезентативную кривую силы-расширения из кривой форс-расширения, которая будет исправлена, что приведет к прямой, а не синусоидальной базовой линии (рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы пик неспецифической адгезии репрезентативной кривой отличался от любых событий одной молекулы, появляющихся в кривых для коррекции. На самом деле, выбор репрезентативной кривой имеет решающее значение для надлежащей коррекции.

Representative Results

Следующие примеры показывают результаты растяжения и растяжения одной молекулы полимеров PEG, PNiPAM и PS. Все советы AFM cantilever были функционализированы с протоколом, приведенным выше. PEG и PNiPAM были измерены на SiOx с изменением температуры. Для детального обсуждения в результате температуры зависимых вытяжек кривых для PEG и PNiPAM, см Kolberg et al.18 Другой мотив силового расширения плато плато постоянной силы (например, при desorbing PS от самособранных монослойных метиловых тиол на золоте (SAM) в воде4,27,39,51).

Пример 1: Растяжка ПЭГ и ПНИПАМ в воде
Температурно-зависимое поведение растяжения в воде было измерено с помощью одного PNiPAM и PEG полимеров ковалентно связаны с AFM кантилевер наконечник на одном конце и physisorbed на поверхности SiOх на другом конце. После калибровки и экспериментов по очистке контроля (менее 2% кривых силового расширения показывают события одной молекулы), по крайней мере две силовые карты были записаны для каждого кантилевера AFM. Эксперимент, зависящий от температуры, был проведен путем записи по крайней мере одной силовой карты при каждой температуре. Когда появилось всего несколько событий растяжения, соответствующий кантилевер AFM был отброшен и следующий кантилевер AFM чипа был взят (обычно в порядке C, B, D и E MLCT-Bio-DC). По примеру, данные PEG, одно событие растяжения наблюдалось в 95 из 500 измеренных кривых форс-расширения (19%). Для PNiPAM, 252 из 600 кривых силового расширения показали растяжения картины (42%). Для лучшего сравнения кривых силового расширения была создана одна кривая для каждой температуры. Для этой цели были выбраны только те кривые с растяжением события по крайней мере до 500 pN, где конформационные колебания и эффекты растворителя незначительны, были выбраны52. Окончательное количество участков, принятых во внимание было 3 на 278 K, 7 на 298 K и 4 на 318 K для ПЭГ и 4 на 278 K, 3 на 298 K и 3 на 318 K для PNiPAM18.

Процедура генерации мастер-кривых приведена на рисунке 3. Выбранные кривые силового расширения(рисунок 3A)перемасштабируются в длину L0 (расширение силой 500 pN), см. Рисунок 3B. Пик стыковки показывает большое изменение неспецифической стычки между поверхностью и наконечником aFM cantilever, но не влияет на поведение растяжения полимера. После слияния перемасштабированных кривых силового расширения они усреднились путем биномнального сглаживания, представленного на рисунке 3C. Для этого гауссийский фильтр совмещеет данные с нормализованными коэффициентами, полученными из треугольника Паскаля на уровне, равном параметру сглаживания 2053. Наконец, мастер кривая получается для каждой температуры, как удается на рисунке 3D. Масштабирование показывает диапазон, в котором влияние температуры на поведение силового расширения наиболее выражено.

Сравнение температурного поведения PEG(A)и PNiPAM (B) можно найти на рисунке 4. Для ПЭГ наблюдалось снижение силы растяжения с повышением температуры. При повышении температуры с 278 до 318 К наблюдалось увеличение примерно на 5% перемасштабирования на 100 pN. Для PNiPAM может быть выявлен противоположный температурно-зависимый сдвиг. Снижение примерно на 1% перемасштабированного расширения на 100 pN наблюдалось, когда температура была увеличена с 278 до 328 K. Кроме того, растяжение свободной энергии может быть получено из силовых выдвижения мастер кривых путем определения области под кривой для любого данного значения силы. Это может быть использовано для извлечения энергичных и энтропических вкладов растяжения свободной энергии с помощью молекулярной динамики (MD) моделирования18.

Пример 2: Отчаяние PS с поверхности SAM в воде
Обезборки PS с поверхности SAM в воде может быть использован для определения силы и длины десонции и тем самым количественно гидрофобного взаимодействия. После калибровки, по крайней мере две карты силы были записаны в двух различных точках поверхности. Когда полимерное крепление было успешным, кривые силового расширения показали плато постоянной силы, как характерная особенность, см. Рисунок 5А и Рисунок 5C. Плато-как desorption наблюдается, когда динамика зондированных облигаций гораздо быстрее, чем потянув скорость AFM кантилевер наконечник (квази-равновесие). Силы desorption плато-как кривые форсирования сразу обеспечивают adhesion свободные энергии путем интегрировать след силы-расширения54. Они были использованы для определения электростатических, дисперсивных и гидрофобных взаимодействий, а также фрикционных свойств одиночных полимеров на поверхностях в жидкой среде22,4,,23,,51,,54,,55.

Каждое плато постоянной силы было оснащено сигмоидальной кривой для определения силы desorption и длины desorption, которые затем были построены в гистограммах. Гистограммы были оснащены гауссианским, чтобы извлечь максимальное значение и стандартное отклонение. Для лучшего обзора, сила desorption и значения длины были показаны вместе в рассеянии сюжет, как указано на рисунке 5B и рисунок 5D.

Для полистирола на SAM в воде, определенные силы десурбации соответствуют ранее полученным значениям19,23. Поскольку длина desorption коррелирует с длиной контура полимера51,распределение длины desorption может быть использовано в качестве доказательства ковалентного связывания соответствующего полимера с наконечником aFM cantilever через его функциональную конечную группу. Таким образом, длина desorption служит отпечатком пальца.

Для более чем одного полимера, прикрепленного к наконечнику aFM cantilever, каскады плато (дискретные шаги) можно наблюдать в кривых форс-расширения56. Каждое плато представляет собой опреснение полимера при другом расширении. Эксперимент, приведенный на рисунке 5C и рисунке 5D, показал типичный случай двух полимеров, прикрепленных к наконечнику кантилевера AFM в то же время. При установке окончательного разрыва можно найти бимодальное распределение по длине desorption, в то время как сила desorption показала узкое распределение. В этом случае, меньшая длина desorption может быть найдена в 90% кривых силового расширения, либо в качестве одного плато или в качестве дополнительного плато на более длинном плато, как удается на рисунке 5C. Более высокая длина desorption была найдена в 37% полученных кривых форс-расширения. Таким образом, распределение длины desorption может быть использовано для определения количества различных полимеров, прикрепленных к наконечнику aFM cantilever. В целом, узкое распределение значений длины desorption является хорошим показателем того, что один и тот же один полимер был исследован в полученных кривых форс-расширения. В то же время, суперпозиция соответствующего силы-расширения может быть использована для принятия решения о том, был ли измерен один и тот же один полимер.

После доказательства ковалентной связывания одного полимера PS, дальнейшие эксперименты с этим полимером PS могут быть выполнены из-за различных субстратов (твердая поверхность, а также полимерные пленки), условия растворителя, температура, скорость вытягивания или время пребывания.

Figure 1
Рисунок 1: Схематический обзор процесса функционализации наконечников. Включает в себя химическую модификацию наконечника aFM cantilever после (1)активации плазмы (2)силанизации / PEGylation и (3)полимерного крепления. Кроме того, показаны подробные химические структуры используемых полимеров, а именно PEG, PNiPAM и PS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Устранение помех в кривых силового расширения. (A) Найти силу расширения кривой показаны синусоидальной силы сигнала артефакт вдоль расширения, но не имея одной молекулы растяжения события. (B) Выберите кривую форс-расширения с одной молекулы событие, которое должно быть исправлено из синусоидального артефакта. (C) Наложить кривые для контроля, если синусоидальные артефакты кривых действительно совпадают. (D) Вычитая кривой форс-расширения (A) от (B) кривая форс-расширения с прямой базовой линией получена. Хотя пик адгезии не может быть использован для дальнейшего анализа, кривая форс-расширения теперь корректируется для артефакта, ведущего к гораздо более точным значениям силы в области события одной молекулы (здесь: 0,2 мкм расширения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Определение мастер-кривых из кривых расширения силы ПЭГ на уровне 298 K. (A)Экспериментальные данные на 298 K, используя 7 кривых силового расширения. После переквалификации в длину L0 силой 500 pN (B), кривые силового расширения могут быть объединены и усреднен биномального сглаживания получения мастер кривой(C). Перемасштабированные кривые приводятся в виде точек, в то время как мастер-кривая показана как сплошная линия. Наконец, полученные мастер кривые для различных температур можно сравнить (D). Масштабирование указывает диапазон, в котором влияние температуры на поведение силового расширения наиболее выражено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Сравнение температурно-зависимых мастер-кривых PNiPAM и PEG. Для ПЭГ увеличение перемасштабирования расширения на 100 pN (средней силы диапазона) наблюдается при повышении температуры (A), в то время как для PNiPAM противоположный температурно-зависимый сдвиг выявлено (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ кривых силы расширения PS на SAM в воде. (A) Образцовая кривая форс-расширения (синий) с сигмоидальным припадком плато (фиолетовый). Кроме того, стрелки отмечают определенную силу (красную) и длину (зеленый) плато. Сила desorption и значения длины desorption полученные сигмоидальными припадками показаны в графике рассеяния и результирующей гистограммы приспособлены с Gaussian. (B) Определяется средняя сила desorption и desorption значения длины (112 и 6) pN и (659 х 7) нм, в котором 93% из силы расширения кривых показать такие отдельные события плато. (C) Образцовая кривая силы-расширения (синий) для двух полимеров, прикрепленных к наконечнику кантилевера AFM в то же время. Здесь сила desorption показывает unimodal распределение со средним значением силы (117 и 5) pN, в то время как бимодальное распределение можно найти для длины desorption, ведущей к средним значениям длины (656 и 9) нм и (1050 и 16) нм. (D) 90% пробных кривых силового расширения показывают только одно плато событий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

AFM-основанная SMFS является одним из основных инструментов для исследования взаимодействия одной молекулы в физике полимеров. Для истинного эксперимента с одной молекулой, ковалентное вложение полимера зонда к наконечнику aFM cantilever имеет важное значение.

Многие предыдущие работы основаны на экспериментах нанолового лова, в частности для PNiPAM, где полимеры адсорбируются на поверхность, а затем растягиваются случайным образом выбирая их из субстрата с помощью наконечника aFM cantilever30,31. Это может изменить результаты и привести к неправильной интерпретации поведения одной молекулы. Там, кооперативные эффекты могут доминировать результаты, потому что взаимодействие с соседними полимерами не может быть исключено. Это имеет большое влияние на результаты, особенно для полимеров, которые показывают значительно различное поведение навалом по сравнению с отдельными изолированными молекулами57,58.

Представленный здесь протокол функционализации надежен и может быть легко применен к различным полимерам, независимо от их контурной длины, гидрофобности или стерильного помехи мономеров. Кроме того, пассивация предоставляется для предотвращения нежелательных взаимодействий между одним полимером зонда и наконечником aFM cantilever, а также между наконечником aFM cantilever и основной поверхностью. Кроме того, показана оценка кривых силового расширения, показывающих события растяжения. Там предлагается процедура определения главных кривых силового расширения. Это предлагает лучшее средство выявления, например, влияния, связанного с температурой, на поведение, связанное с расширением силы. Кроме того, проводится анализ событий десорпации одной молекулы с постоянными силовыми плато. Кроме того, дается простой способ коррекции синусоидальных артефактов сигнала силы в кривых форс-расширения, который в противном случае мог бы ухудшить результаты эксперимента.

По сравнению с Stetter et al.39,представленная здесь процедура функционализации сводится к трем шагам вместо четырех, а надежность процедуры повышается. Основным преимуществом проведения PEGylation и силанизации в один шаг является более контролируемая реакция и увеличение урожайности. Кроме того, необходимо подготовить меньше решений и принять меньше мер по обезврежению. Это сокращает усилия и время для подготовки и увеличивает воспроизводимость. Кроме того, перемещение aFM кантилеверов всегда является важной частью процесса функционализации. Переход от одного решения к другому всегда рискует сильно повлиять на качество функционализации из-за переноса через интерфейс воздушной воды или потери AFM кантилеверов из-за неправильного использования пинцета.

Для того, чтобы доказать правильное ковалентное присоединение одного полимера к aFM кантилевер наконечник различных условиях должны быть выполнены. Во-первых, контроль AFM кантилеверы имеют важное значение и должны быть готовы к каждой функционализации. Процесс функционализации и жидкая ячейка для проведения экспериментов считаются чистыми только в том случае, если небольшое количество кривых силового расширения показывает растяжки или плато в эксперименте по контролю (в представленных примерах менее 2%).

Четкая растяжка шаблон без каких-либо дальнейших капель или максима имеет важное значение для надлежащего одной молекулы растяжения событий. Кроме того, следует проанализировать зависимость силы разрыва от скорости силовой нагрузки при разрыве или полной эластичной реакции кривой растяжения, чтобы исключить одновременный десонирование нескольких полимеров59,60. Для PEG и PNiPAM 19% и 42% кривых силового расширения, сделанных в разных положениях поверхности, показали такую растяжку соответственно. Для того, чтобы получить растяжения событий, физиорбация полимера на соответствующую поверхность основной должны быть сильными. В противном случае наблюдается плато, как событие desorption. Это еще более важно для обнаружения растяжения событий на высоких силах (до 500 pN и более). Поскольку эта сильная физика не выполняется для каждой кривой форс-расширения, выход таких событий меньше, чем для чистого плато, как desorption событий. В качестве альтернативы можно использовать сильно придерживающиеся группы, такие как катехолы или химисорпирование между полимерной и основной поверхностью. Однако для этого необходимо внедрить дополнительные функциональные группы или места сцепления на полимере61,,62.

На самом деле масса (т.е. длина контура) полимера обеспечивает ценный отпечаток пальца. Хотя масса не может быть непосредственно переведена в измеренную длину контура по следующим причинам, распределение длины очень ценно для определения одномолекулярных событий. В случае полимера PNiPAM с низкой полидисперсностью(No 1,28), мы обнаружили значительные различия в значениях расширения для полученных событий растяжения (и, следовательно, в длине полимера) в экспериментах. Одной из причин этого может быть определение длины полимера и его распределение. В хроматографии для исключения размера (SEC) относительный вес целевого полимера определяется по сравнению со стандартами, такими как PS или poly (метил-метакрилат) (PMMA)63. Предполагаемый относительный вес, как ожидается, будет отклоняться от абсолютного молекулярного веса, поскольку гидродинамический радиус целевого полимера и стандарт аможет существенно отличаться. Кроме того, слой силана может быть олигомеризирован ложной водой в толуоле во время процесса функционализации. Прикрепление таких олигомеров к наконечнику aFM cantilever приводит к более гибкому слою с меньшим количеством якорных точек64. Кроме того, точка крепления полимера к кремниевому слою не обязательно может быть на вершине, что приводит к смещению обнаруженных значений длины29. В то время как полимерная модель, такая как червь цепи (WLC) или свободно совместной цепи (FJC) модель не может воспроизвести соответствующие силы расширения поведения для PEG или PNiPAM должным образом на протяжении всего диапазона расширения18,29,41,65,66, такая модель полимера может быть ценным для других полимерных и белковых систем10,15,67,68.

Ковалентное крепление одного полимера PS (с длиной контура более 1 мкм) считается успешным только тогда, когда значительное количество кривых силового расширения показывает достаточно длинное плато постоянной силы(рисунок 5). Плато в результате desorbing одного полимера определяется одним резким падением постоянной силы к исходной линии при определенном расширении, как указано на рисунке 5A. Если больше полимеров крепятся к наконечнику aFM cantilever, каскад плато наблюдается56 (рисунок 5C). Длина плато (длина десурбации), коррелирует с длиной контура полимера51, должна быть значительно длиннее, чем любой пик сцепения из-за неспецифического прижаться к наклона AFM к основной поверхности (здесь около 200 нм). Функции, появляющиеся исключительно в одной кривой расширения силы, не должны интерпретироваться. В представленных экспериментах, по крайней мере 80 из 100 кривых показали плато длиннее 200 нм в по крайней мере две карты силы в двух различных точках на поверхности. Кроме того, распределение длины desorption, используя рассеяния участков, таких, как удается на рисунке 5B и 5D, выявить, если и сколько полимеров связаны с AFM кантилевер отзыв. В случае PS, узкое распределение силы desorption и длины, взятой из плато кривых форс-расширения, служило свидетельством успешного ковалентного присоединения. Это, наконец, доказало успех протокола функционализации. Поэтому мы настоятельно рекомендуем представить такие силы и длины распределения в публикациях.

Оценка кривых силовых выдвижения с использованием встроенных алгоритмов, которые составляют много заранее установленных параметров, должна быть выполнена с осторожностью. Причинами являются, например, то, что фиксированная частота выборки не подходит для каждой приложенной скорости вытягивания или что автоматическое сглаживание кривых форс-расширения может усреднеть важные детали. Обычно правильное понимание соответствующей процедуры оценки может предотвратить ошибки в процедуре оценки, которые, в свою очередь, могут сильно повлиять на окончательные выводы эксперимента SMFS на основе AFM.

Таким образом, мы представляем протокол функционализации, который является надежным и может быть легко применен к различным полимерам. Кроме того, представлена надлежащая оценка одной молекулы кривых силового расширения, что позволяет определить физические параметры, такие как растяжение силы, силы десорбции и длины десорбции. Представленные протоколы и процедуры являются ценными для исследования стимулов-ответных систем на уровне одной молекулы.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

B.N.B. и T.H. признают финансирование Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии - EXC-2193/1 - 390951807, gef'rdert durch умереть Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) им Rahmen дер Exzellenzstrategie де Бундес и дер Ленд - EXC-2193/1 - 390951807, и грант HU 997/1-13 (проект No 420798410). М.Г. признает частичную поддержку в рамках проекта LOEWE iNAPO со стороны Министерства высшего образования, исследований и искусств Гессена. Мы благодарим доктора Вольфганга Броннера и доктора Агне Зукаускайте из Института прикладной физики твердого тела IAF за пожертвование высококачественных кремниевых пластин с золотым покрытием.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Dodecanethiol (≥98%) Sigma-Aldrich, USA 417364-500ML Used for SAM
Ammonia solution (30%) Roth, Germany CP17.2 Used for cleaning
Cypher ES Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA - AFM
Ethanol (≥99.9%) Roth, Germany PO76.1 Solvent
Gold coated silicon wafer Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany - Used for SAM
High Resolution Replicating Compound Microset Products Ltd, UK 101RF Bonding agent
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich, USA H1009 Used for cleaning
Igor Pro Wavemetrics, USA - Software environment
Tetra-30-LF-PC Diener Electronic, Germany - Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane Creative PEG works, USA PHB-1923 Linker polymer
MLCT-Bio-DC Bruker, USA MLCT-Bio-DC AFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm MicroChemicals, Germany WSA40600250 P1314SNN1 Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm Elga LabWater, Germany 10034-540 Ultrapure water source
R3 SA Vomm GmbH, Germany 5803 Blank Tweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) Gallei Group, Saarland University, Germany - PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrene Polymer Source, Canada P40722-SSH PS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiol Creative PEGWorks, USA PSB-615 PEG probe polymer
Toluene (99.99%) Fisher Chemicals T324-500 Solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1 (2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Hashmi, S. , Elsevier. Amsterdam. (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), New York, N.Y. 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), New York, N.Y. 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), New York, N.Y. 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705 (2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110 (2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394 (2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques - 3rd Edition. , Academic Press. San Diego. (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187 (2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 - The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301 (2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

Tags

Химия выпуск 157 единая молекула силовая спектроскопия атомный силовой микроскоп адгезия функционализация PEGylation
Ковалентное присоединение одиночных молекул для спектроскопии силы на основе AFM
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T.,… More

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T., Gallei, M., Balzer, B. N. Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (157), e60934, doi:10.3791/60934 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter