Summary
该协议的总体目标是在 1 厘米2平面基板上准备超过 100 万个有序、均匀、稳定且生物相容的 femtoliter 液滴，可用于无细胞蛋白质合成。
Abstract
科学仪器的空间分辨率和检测灵敏度的进步使得将小型反应堆应用于生物和化学研究成为可能。为了满足对高性能微反应器的需求，我们开发了一种女性滴阵列（FemDA）装置，并举例说明了它在大规模平行无细胞蛋白合成（CFPS）反应中的应用。使用两步油封式协议，在手指大小的区域内容易产生超过 100 万个均匀液滴。每个液滴都锚定在一个女性升微室，由亲水底部和疏水侧壁组成。混合亲水疏水结构以及专用密封油和表面活性剂对于在女性空间中稳稳地保留女性水溶液而不造成蒸发损失至关重要。Femtoliter 配置和 FemDA 器件的简单结构允许最少的试剂消耗。滴滴反应堆的统一尺寸使大规模定量和时间过程测量令人信服和可靠。FemDA 技术将 CFPS 反应的蛋白质产量与每个滴滴中的 DNA 分子数相关。我们简化了有关器件微制造、女性飞沫形成以及获取和分析微观图像数据的程序。具有优化的低运行成本的详细协议使拥有标准洁净室设施和传统荧光显微镜的每个人都可以使用 FemDA 技术。
Introduction
研究人员使用反应器进行生物/化学反应。为了降低试剂消耗，同时提高工作效率，为缩小反应堆尺寸和增加实验吞吐量作出了重大努力。这两个方面旨在使研究人员从繁重的工作量中解放出来，降低成本，加快研发。从反应量和吞吐量的角度，我们有一个明确的历史路线图，即反应器技术的发展：单烧杯/烧瓶/试管、毫升管、微升管、微升8管条、微升96/384/1536孔板和微流体纳米升/皮升/女性,升反应器1、2、3、4、5、6、6。2,3,4,6,715与过去几十年半导体行业集成电路芯片上的晶体管特性尺寸缩小类似，生物/化学微反应器正在经历体积降低和系统集成。这种小规模工具对基于细胞或无细胞的合成生物学、生物制造和高通量原型制作和筛选898、9、10、11、1210,11,12产生了深远的影响。,本文介绍了我们最近开发独特的滴滴阵列技术的努力，并展示了它在CFPS13中的应用，这是合成生物学和分子筛选社区的基础技术。特别是，我们特意提供优化和低成本的协议，使 FemDA 设备可供所有人使用。小型设备低成本且易于处理的协议将有助于大学的教育目的，并有助于推广技术。
FemDA 在平面玻璃基板上以 106/1厘米2的超高密度准备女性飞沫。我们在玻璃基板上涂上疏水性聚合物CYTOP15，并在预定义位置选择性地蚀刻（去除）CYTOP，在基材上产生微腔阵列。因此，产生的微室由疏水侧壁（CYTOP）和亲水底部（玻璃）组成。当水和油在图案表面连续流动时，水将被捕获并密封到微腔中。亲水疏水结构对于排斥微腔外的水、隔离单个微反应器以及在女性空间内保留微小的水溶液至关重要。该独特的特性已成功应用于制备水中油滴和脂质双层微室16、17。,17与原型装置16相比，我们首先优化了微制造工艺，实现了CYTOP聚合物的完全去除，以及玻璃底部的完全曝光。CYTOP 是一种特殊的氟聚合物，表面张力极低（19 mN/m），比玻璃、塑料和硅胶等传统微反应器材料低。其良好的光学、电气和化学性能已应用于微流体装置18、19、20、21、22、23、24的表面处理。18,19,20,21,22,23,24在FemDA系统中，要对CYTOP表面的油进行良好的润湿，油的表面张力必须低于固体表面25。否则，与固体表面接触的液体油往往会变成球形，而不是扩散到表面。此外，我们发现，一些流行的全氟碳油（例如，3M FC-40）16和氢氟16醚油（例如，3M Novec系列）可以溶解CYTOP，由于CYTOP的形态，这是致命的定量测量，在液滴交叉污染方面是值得怀疑的。幸运的是，我们发现了一种生物相容和环保的油，表面张力降低（< 19 mN/m） 表面张力13。我们还发现了一种新的表面活性剂，可以在选定的油中溶解，在低浓度（0.1%，至少比先前报道的流行26，27）13低1026,27倍。13由此产生的水/油界面可以通过表面活性剂稳定。由于油的蒸发率高，在用油冲洗后，我们应用了另一种生物相容和环保的油来替代第一个密封微腔的油。我们分别将第一种油（ASAHIKLIN AE-3000，0.1 wt % SURFLON S-386）称为"冲油"，第二种油（丰布林 Y25）分别称为"密封油"。
两步油封策略可以在几分钟内实现女性滴层阵列的牢固形成，无需精密的仪器。由于蒸发问题，生产小于皮克升体积28的微反应器一直被认为是具有挑战性的。FemDA通过系统地优化用于制备微反应器/液滴的材料和工艺来解决这个问题。产生的液滴的几个值得注意的特点包括高均匀性（或单分散性）、稳定性和在女性级表上的生物相容性。滴体积的变化系数 （CV） 仅为 3%（没有微图像的晕影校正），是世界上滴管平台中最小的 CV，可确保高度平行和定量测量。女性升液滴稳定至少24小时，在室温下液滴之间无交叉污染，对于可靠的时间过程测量非常有价值。关于生物相容性，我们成功地合成了各种蛋白质，从一个单拷贝模板DNA在女性滴，以前被认为是困难或低效的29，30。,30它值得阐明为什么一些能够在FemDA中合成的蛋白质不能在其他滴系统中合成。FemDA不仅是一个技术进步，而且实现了前所未有的定量测量，可以将蛋白质产量（如滴的荧光强度所反映）与每个滴滴中的模板DNA分子数量相关联。因此，基于FemDA的CFPS液滴荧光强度的直方图显示了离散分布，可以通过相等峰峰间隔的高斯分布总和很好地拟合。此外，含有不同数量DNA分子的液滴发生的概率非常适合泊森分布31。因此，根据离散分布，可以对每滴中不同的蛋白质产量进行标准化。这一关键功能使我们能够将酶活性信息与表观强度分开，而其他微反应器平台尚未提供这些信息。现有的微流体细胞/液滴分拣系统擅长全自动分拣，善于浓缩样品，但有时只能在分析方面32、33,33输出相对宽或长尾直方图。我们的高度定量和生物相容的FemDA系统为微反应器开发领域树立了新的基准和较高的分析标准。
可用于制备液滴的油和表面活性剂仍然非常有限。ASAHIKLIN AE-3000 和 SURFLON S-386 在 FemDA 中建立的组合是水相与石油第13阶段之间物理化学界面不断增长的武器库的新成员。FemDA 中的新界面在物理上稳定、化学惰，并且与多种蛋白质的复杂转录、翻译和翻译后修饰机制相容。找到一种在滴下设置中无法合成的蛋白质会相当有吸引力。此外，试剂的成本节约在女性滴滴系统中比在纳米升和皮升反应器系统35，36,36更明显。特别是，在微流体液滴生成系统中，经常会有大量死体积，这主要是由管道或外部供应造成的，而不是在我们的FemDA中。阵列格式还受到每个反应堆37的重复和详细的微观特征（类似于所谓的高含量分析）的青睐，而不仅仅是快速移动物体的单个快照。女性升表使100多万个反应堆能够整合到手指大小的区域，而同样数量的纳米升反应堆（如果存在的话）需要超过平方米的面积，这无疑不适合制造或使用这种系统。
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Protocol
1. 女性微腔阵列基板的微制造
注：在洁净室进行以下微制造实验。进入洁净室前，请戴上手套和洁净室套装。
- 清洁盖玻璃基板
- 将盖玻璃放在盖玻璃染色架上。在室温 （RT） 下，将 8 M 氢氧化钠 （NaOH） 中的盖玻璃声波 15 分钟。
注意：高浓度的NaOH对皮肤和眼睛非常危险。轻轻处理它，没有任何飞溅。 - 将机架从 NaOH 溶液中拿出来，用水冲洗盖玻璃十次。将盖玻璃保存在纯净水中。
注：将碱性废物丢弃到指定的储罐中。NaOH 解决方案可回收到原始瓶子中，使用时间长达五次。 - 用空气吹枪擦干每块盖玻璃。
- 在200°C下将干盖玻璃在热板上烘烤5分钟。在以下处理过程中，保持玻璃基板上侧的方向一致。
- 将盖玻璃放在盖玻璃染色架上。在室温 （RT） 下，将 8 M 氢氧化钠 （NaOH） 中的盖玻璃声波 15 分钟。
- 玻璃表面的硅化
- 将清洁的盖玻璃重置在干燥的污渍架上。
- 将 150 mL 乙醇加入 PTFE 烧杯中。使用针头（22 G x 70 mm）配备 1 mL 注射器绘制 0.075 mL（3-氨基丙酮）三氧西烷，并立即将其注入乙醇（即 0.05 伏特%）。多次拉动和推注射器，冲洗注射器内部。用针搅拌溶液，使其均匀。
注：（3-氨基丙酮）三氧西烷可在室温下储存，1安特姆压力可储存两年，密封紧密。绝对乙醇使用后应密封。我们不建议使用任何过期的试剂。 - 在 RT 中孵育 0.05 vol % 氨基气烷溶液中的盖玻璃 1 小时。
- 用纯净水冲洗盖玻璃五次。将盖玻璃保存在纯净水中。
注：将废物丢弃到指定的水箱中。 - 用空气吹枪擦干每块盖玻璃。
- 将所有干盖玻璃放在铝箔上。在 80°C 下将热板上的盖玻璃烘烤 5 分钟。
- 旋转涂层 CYTOP 全氟聚合物
- 将盖玻璃放在旋转涂布机的定制真空夹头上（图1A）。打开真空开关以固定玻璃基板。
注：真空夹头的设计对于在矩形（24 mm × 32 mm）和薄（0.13-0.17毫米）基材（图1A）上均匀涂覆粘性聚合物至关重要。我们发现，与真空通道相连的具有多个孔（48 个孔，每个孔直径为 1 mm）的矩形采样级比具有单个中心孔的圆形阶段工作得更好。 - 在玻璃基板中心放置 70-90 μL 的 A 型 CYTOP 聚合物。立即旋转涂层聚合物（图1B）。
注：旋转涂层条件（3，400 rpm，30 s）提供 3 μm 厚度。使用专为粘性液体设计的微移液。直立握住微移液，使聚合物在基材上几乎完美地圆。当柱塞向下移动时，气泡通常在移液器尖端内产生。不要随气泡掉落 CYTOP 的最后一滴。 - 拿起涂布玻璃用手指握住玻璃基板的角，并将其放在铝箔上。
- 重复步骤 1.3.1-1.3.3 以旋转涂层盖玻璃的所有剩余部分。
- 在80°C下烘烤涂布玻璃30分钟，然后在200°C下烘烤1小时。
注：此处理可完全固化 CYTOP，并将 CYTOP 与玻璃表面共同粘合。用铝箔制成的盖子盖住烘烤区域，以避免在长期烘烤过程中（如果需要）出现潜在的灰尘。 - 从热板中取出 CYTOP 涂层盖玻璃，冷却至 RT。小心地拿起涂布玻璃的每一块，并检查它是否正确涂覆。丢弃表现出不均匀涂层的基板。
注：涂层良好的CYTOP的表面应看起来平坦，没有不规则的彩虹状图案（图1C）。从适当角度进行目视检查可以快速判断平坦度和涂层质量。协议可以在这里暂停。
- 将盖玻璃放在旋转涂布机的定制真空夹头上（图1A）。打开真空开关以固定玻璃基板。
- 旋转涂层光刻
- 将 CYTOP 涂层盖玻璃放在旋转涂布机的真空夹头上（参见步骤 1.3.1）。打开真空开关以固定盖玻璃。
- 在基板中心滴下0.2-0.3 mL的光阻。立即旋转涂层光刻，在 6，000 rpm 的 60 s。
注：请勿用气泡掉落光刻胶的最后一滴。如果旋转涂布器支持更高的旋转速度，则旋转速度可能高达 7，500 rpm，以实现更薄的涂层。CYTOP 的低表面能量可防止大多数光阻子粘附到其表面。如果 AZ P4903 光度电阻不可用，则 AZ P4620 光度电阻是一个不错的选择。 - 用两根手指握住涂层基板，握住基板的角。使用乙醇浸透的清洁雨刮器擦去基底边缘附近的多余的光阻（通常称为边缘珠去除或EBR）（图1D）。将基板放在铝箔上。
注：不建议 EBR 使用丙酮。 - 重复步骤 1.4.1-1.4.3 旋转涂层的玻璃罩，用于剩余的 CYTOP 涂层盖玻璃。拿起涂布玻璃的每一块，检查它，看它是否涂好。
注：涂层良好的光刻胶的表面应看起来平坦，没有不规则的图案（图1D）。从适当角度进行目视检查可以快速判断平坦度和涂层质量。采用丙酮、2丙醇和H2O依次清洗并重复使用，可循环回收不均匀涂层的基材。 - 在 110 °C 下将涂层基板在热板上烘烤 5 分钟。
- 从热板中取出涂层基板，冷却至 RT。在相对湿度为 40%-60% 时，让站立 30 分钟，以补充光刻剂。
注：H2O 是以下光化学反应所必需的。烘焙的光刻胶会失去光刻胶内的 H2O 内容。补液过程允许从空气中吸收H2O。相对湿度低于20%或高于80%不适合补液工艺。
- 光刻
- 在补液等待时间（参见步骤 1.4.6），启动蒙版对齐器。预热光源。加载镶边照片罩。
注： 按照说明书操作面罩对准器。如果EB设施可用，光掩膜可以通过电子束 （EB） 光刻进行制造。或者，照片掩码可以外包给当地公司。 - 将补水基板（完成步骤 1.4.6 后）加载到夹头上（图 1E）。
- 设置曝光参数。在真空接触模式下，以 13 mW/cm2 （h 线） 的紫外线强度暴露基板 25 s。然后卸下基板并将其放在盖玻璃染色架上（步骤 1.1.1 中使用的相同机架）。
- 重复步骤 1.5.2-1.5.3 以公开补水基板的剩余部分。
- 在补液等待时间（参见步骤 1.4.6），启动蒙版对齐器。预热光源。加载镶边照片罩。
- 发展
- 开发基板 5 分钟以溶解暴露的光阻（图 1F）。在此期间，在 4 分钟的时间点轻轻摇动开发人员中的机架一次。
注： 开发人员是 AZ 300 MIF。替代碱性开发（例如 AZ 400 K）通常适用于开发，但需要优化开发条件（例如时间、温度、搅拌）。请勿将玻璃烧杯用作开发人员容器。 - 使用纯净水冲洗基板十次。将盖玻璃保存在纯净水中。
注： 将开发人员丢弃到指定的储罐。 - 使用空气吹枪彻底干燥每块基板。
- 开发基板 5 分钟以溶解暴露的光阻（图 1F）。在此期间，在 4 分钟的时间点轻轻摇动开发人员中的机架一次。
- 反应-ion 蚀刻
- 将干基板（从步骤 1.6.3 起）放入反应-里昂蚀刻 （RIE） 机器的反应室中。
注：根据设施维护规则，RIE 机器可以每次都打开或关闭。如果开关已关闭，请根据手册打开开关。 - 用O2等离子体蚀刻光电阻未覆盖的CYTOP（图1G）。
注： RIE 条件如下所示。O2气体流量：50 sccm;腔室压力：10.0 Pa;射频功率：50 W;蚀刻时间：27分钟对CYTOP全蚀刻3μm厚度进行了蚀刻时间优化。 - 使用钳子从反应室拾取每块基板，并将其放在盖玻璃染色架上。
注：根据设施的维护规则，反应室可能需要短 O2等离子清洗过程（例如蚀刻时间：5 分钟），以保持反应室每次运行后的清洁。
- 将干基板（从步骤 1.6.3 起）放入反应-里昂蚀刻 （RIE） 机器的反应室中。
- 去除光刻和清洁
- 在RT下用丙酮声波基板5分钟溶解剩余的光刻。
- 在 RT 下用 2 丙醇对基板进行 5 分钟声波。
- 使用纯净水冲洗基板五次。在RT时将基材声波5分钟。使用纯净水将样品再冲洗5次。将基板保持在纯净水中。
- 用空气吹枪干燥每块基板（图1H）。
注：基板可储存在塑料培养皿中。在RT中，预制基板的结构稳定至少一年。协议可以在这里暂停。 - 通过三维（3D）激光扫描共聚焦显微镜、白光干涉测量（或相干扫描干涉测量）或扫描电子显微镜来描述准备基板的表面轮廓。使用相应的软件测量结果微腔的直径和深度。
注：该样品可在非接触式和非破坏性3D激光扫描共聚焦显微镜或白光干涉仪进行鉴定后的其他实验。协议可以在这里暂停。
2. 制备多二甲基硅氧烷（PDMS）微通道
注：请勿戴乳胶手套来处理 PDMS。相反，要戴上聚乙烯 （PE） 手套。
- 使微通道主控
- 使用台式切割机将双涂层粘合剂 Kapton 薄膜胶带切割成定义的（3 毫米 x 19 mm）微通道形状。
注：Kapton 胶带为 7602 #25（大冈 Seisakusho），导致通道高度为 135 μm。STIKA 桌面切割机使用 Adobe Illustrator 的插件（可从罗兰网站：https://www.rolanddga.com）根据 Adobe Illustrator 文件中的绘图来运行切割。协议可以在这里暂停。 - 将每一个切卡普顿胶带粘在培养皿的平底上。标准 90 mm 培养皿可容纳 12 件胶带。
注：浮雕结构作为PDMS复制成型的主控形状。如果胶带和 Petri 盘基板之间夹杂着任何气泡，请用钳子轻轻按压胶带表面。或者，经典的软光刻可以应用于硅晶圆38上的母版。协议可以在这里暂停。
- 使用台式切割机将双涂层粘合剂 Kapton 薄膜胶带切割成定义的（3 毫米 x 19 mm）微通道形状。
- 在胶带图案的培养皿中固化PDMS树脂
- 佩戴新的PE手套，并使用一次性塑料移液器将SYLGARD 184硅胶弹性体2.5克固化剂转移到指定的塑料烧杯中（图2A）。
- 换上新手套，使用一次性50mL注射器将SYLGARD 184硅弹性体预聚合物底座的25克转移到上述塑料烧杯中。
注：在此处更换手套，以防止固化剂可能交叉污染到底座。 - 使用脱醚混合混合器混合和脱去混合物（程序：3 分钟混合，然后 2 分钟脱位）。
注：如果脱气混合器不可用，可在真空室中手动搅拌（约 15 分钟）混合物。 - 将 PDMS 混合物倒入带状培养皿中（图2B）。将培养皿放在迷你真空室中，将PDMS混合物除洗1-3小时（图2C）。
注：如果 PDMS 混合物中有任何空气在 1 小时后留在 PDMS 混合物中，请将 Petri 盘从真空室中取下，使用吹风机打破气泡，然后将 Petri 盘放回真空室，然后继续脱气过程。 - 将培养皿在烤箱中放入60°C过夜，以固化PDMS（图2D）。
注：虽然增加温度可以缩短固化时间，但聚苯乙烯培养皿在没有物理变形的情况下可以耐受的最高温度约为60°C。
- PDMS 通道的复制成型
- 从培养皿中剥下固化的PDMS弹性体（图2E）。
- 使用平电缆切割机切断每个 PDMS 通道块（图 2F）。
- 将 PDMS 弹性体放在面向通道侧的切割垫上。使用活检冲孔在通道的每一端打孔（图2G）。
- 使用苏格兰胶带清洁 PDMS 通道的表面。然后用另一块苏格兰胶带将 PDMS 树脂包装起来，使其在使用前保持清洁。将准备好的 PDMS 通道存放在干净的培养皿中。
注： 协议可以在这里暂停。
3. 女性微腔阵列装置的组装
- 沿着培养皿的内壁放置一些浸水的清洁雨刷器，使一个简化的加湿室。将苏格兰胶带覆盖的 PDMS 树脂放在加湿室中，并使用石蜡薄膜密封造型室。孵育至少3小时，但不超过一天。
注：PDMS是一种多孔材料，允许气体通过树脂39。PDMS 的多孔结构导致从周围吸收水分子，直到达到平衡。这种预处理用水蒸气填充PDMS的孔隙，可以显著抑制PDMS通道边缘附近的水滴的蒸发。 - 将苏格兰胶带从 PDMS 树脂上取下。将 PDMS 通道放置在基板的微室阵列区域（图 2H）。
注：PDMS 树脂可逆地粘附在 CYTOP 表面。用钳子轻轻按 PDMS 块，以去除 PDMS 树脂和基材之间是否存在的任何气泡。 - 将 200 μL 非过滤移液器尖端插入 PDMS 通道孔的一个（作为出口）。
注：PDMS 和 CYTOP 之间的粘附强度有限。为避免PDMS树脂的物理变形以及PDMS通道脱离表面，请勿将移液器尖端插入太深。
4. 将反应溶液加载到组装设备
- 把铝微管放在冰上。在铝架上的1.5 mL微管中预冷冲洗油（ASAHIKLIN AE-3000 油与 0.1 wt % SURFLON S-386 表面活性剂混合）。
- 把另一个铝块放在冰上。
- CFPS 反应解决方案的制备
- 在 PCR 管中准备 CFPS 反应解决方案。混合CFPS试剂盒的每个等位分量，稀释的模板DNA（如荧光蛋白mNeonGreen40和大肠杆菌碱性磷酸酶41）溶液，以及根据特定需求（如RNase抑制剂、氟基质、陪护酮）的其他必要成分。
注：用于 CFPS 的模板 DNA 必须按照相应 CFPS 套件的说明进行准备。本演示应用了基于T7的表达系统42。由于 FemDA 器件中的试剂消耗量相当小，因此 10 μL 足够大，足以填满整个 PDMS 通道。 - 对于 mNeon 绿色荧光蛋白合成，按以下顺序混合组件：将 2.7 μL 的无核酸酶 H2O 添加到溶液 A 的 6 μL 等位（从 CFPS 套件中）;加入0.3μL的RNase抑制剂;加入稀释模板DNA溶液1.5μL;将混合物短暂混合并转移到溶液 B 的 4.5 μL 等位报价（从 CFPS 套件）。
注： 总体积为 15 μL。由于每个等号的数量与最终混合物的总体积成正比，总体积小于 10 μL 可能会导致某些部件等位器件的体积过小（< 0.2 μL）。 - 对于碱性磷酸酶合成，按以下顺序混合组分：将1.2μL的H2O添加到溶液A的6μL;加入0.3μL的RNase抑制剂;加入0.6 μL的二硫化物粘结增强剂1和2（从套件）;加入0.3 μL 5 mM 6，8-difluoro-4-甲基苯丙烯磷酸（DiFMUP）;加入1.5μL的DNA溶液;将混合物短暂混合并转移到溶液B的4.5μL。
注：在碱性磷酸酶的测定中，氟基质DiFMUP可在端质磷酸盐群酶裂解时产生高荧光6，8-迪氟罗-7-羟基-4-甲基coumarin（DiFMU）。
- 在 PCR 管中准备 CFPS 反应解决方案。混合CFPS试剂盒的每个等位分量，稀释的模板DNA（如荧光蛋白mNeonGreen40和大肠杆菌碱性磷酸酶41）溶液，以及根据特定需求（如RNase抑制剂、氟基质、陪护酮）的其他必要成分。
- 使用 200 μL 非过滤移液器尖端绘制 10 μL 的混合物。将移液器尖端插入 PDMS 通道的进气孔（参见步骤 3.3）。向下推柱塞，将溶液注入通道，直到溶液从出口溢出（步骤 3.3 中已插入另一个移液器尖端）。
- 将移液器与移液器尖端分开，并保持这两个移液器提示仍插入入口和出口。
注：避免在移液过程中产生气泡。在将移液器与移液器尖端分离之前，不要将拇指从柱塞上留空，以免溶液在 PDMS 通道内回流。
5. 为 CFPS 生成女性滴滴阵列 （FemDA）
- 将整组组装设备转移到预冷却铝块（参见步骤 4.2）。仔细确认微室阵列区域迅速从半透明（图2I）变为透明（图2J）。
注：CFPS 反应溶液不能直接进入微腔。水中空气的溶解度与温度成反比。当设备从 RT 移动到低温后，被困的空气将溶解到溶液中。透明度变化是判断溶液是否进入微腔的便捷视觉指标。 - 抽取预冷却冲油的 30 μL（参见步骤 4.1），然后立即将机油从上开口转移到入口插入的移液器尖端中。冲水油进入通道并挤出位于微腔外的多余反应溶液。每个微室都由冲洗油隔离。
注：反应溶液和冲油之间的移动界面是可见的，这有助于人们观察通道内流体的运动。挤出溶液可以收集到以前的管中，储存在4°C，并重复使用用于另一个FemDA装置或平行散装反应（在微管或微化板）。 - 预抽30 μL密封油（福布林Y25）到200μL过滤移液器尖端。把移液器挂在某处。
- 同时从设备中取出两个插入的移液器提示（参见步骤 3.3 和 4.4）。立即将设备从铝块移动到副膜。
注： 在拆卸移液器尖端期间，使用钳子固定（但远离通道区域）铝块上的设备。 - 立即将装有密封油的就绪移液器尖端（参见步骤 5.3）插入 PDMS 通道的入口，并将机油注入通道，直到机油从出口溢出。
注： 将设备移动到 RT 后，立即执行此步骤。为防止通道内出现回流，在密封油从出口溢出之前，不要将拇指从柱塞上留出。冲水油在移出导道出口后立即蒸发，而以下密封油由于蒸发损失极低而积聚在出口中。 - 将移液器与移液器尖端分开，然后从设备中取出移液器尖端。使用清洁雨刮器一片清洁 PDMS 表面，然后分别向入口和出口涂抹新的密封油滴。女性升液滴由机油密封在单独的微腔中。
注：在拆卸微移液器尖端期间，使用钳子固定（但远离通道区域）基板上的 PDMS 通道。 - 擦拭盖玻璃下表面积聚的水分。已准备好的 FemDA 设备现已准备好进行孵化和显微镜成像。
6. 显微镜成像
- 启动倒置荧光显微镜。等待摄像机的稳定性（冷却）。使用 60 倍或 100 倍油浸没物镜。将 FemDA 设备设置在电动舞台上。设置成像参数。
注：成像参数包括文件路径、成像通道、滤镜、曝光时间（一般来说，100 ms就足够了;根据摄像机的规格也可以缩短或更长的时间）和光照强度。 - 找到焦点平面。调整目标镜头的 z 轴位置，并使用内部自动对焦系统固定焦平面。设置要成像的兴趣区域（ROI;即 x、y 轴）。
注：主要显微镜制造商（尼康、奥林巴斯、蔡司、莱卡）都提供了将自动对焦系统集成与显微镜的选项。这种自动对焦系统对于在自动多区域成像期间保持焦平面恒定是必要的。RO 覆盖 PDMS 通道中的 FemDA 区域。 - 捕获荧光图像。为每个 ROI 捕获去聚焦明亮场 （BF） 图像的单帧。成像不同通道时，不要更改 RO 的顺序和坐标。
7. 图像数据分析
注：使用基于斐济（http://fiji.sc）的自制插件（名为"FemDA"）分析图像数据，以提取每个水滴43的荧光强度。根据操作系统安装正确的斐济版本。斐济支持大多数图像文件格式（例如，尼康显微镜的 nd2 文件，蔡司显微镜的 czi 文件），使用内置插件"生物格式"。
- 插件安装
- 将插件文件（查询后可提供给相应作者或通过以下机构链接：https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ）复制到斐济的"插件"文件夹中。
- 启动斐济软件;插件"FemDA"可以在斐济的下拉菜单"插件"中找到。
- 图像数据预处理
- 打开去聚焦的 BF 图像（请参阅步骤 6.3）。单击"流程" |减去背景...删除图像数据各帧的平滑连续背景（图 4B）。单击"流程" |过滤器 |用于降低图像数据各帧噪声的中位数（图 4C）。
- 单击图片 |调整 |用于检查图像数据各帧（图 4A-C中的放大插入）的前景（指示微室）与背景（指示微室外部区域）的阈值。
注： 从"阈值"窗口中的下拉列表中选择正确的算法，以便只能标识微室区域以及每个微室的边缘，并将其突出显示为前景。特别是，大多数突出显示的边必须是连续的，没有间隙。
- 滴点坐标确定
- 单击插件 |费达 |FemDA分析打开自定义插件的图形用户界面（图4D的上半部分）。
- 输入单个微腔的最小像素和最大像素数。输入微腔的预期最小和最大圆度（0：任意形状;1：完美圆）。输入起始帧和结束帧的帧编号。
- 单击 GUI 上的"生成 ROI"以检测每个微室，成功检测到的 ROI 显示在弹出窗口ROITable中。
- 返回窗口FemDA 分析，然后单击"应用ROI"掩码按钮，检查帧上的微室是否正确检测到（图 4D左下）。如果没有，请修改其中一些，然后重复单击"生成 ROI"和"应用 ROI"掩码。如果是，则转到下一步。
注： 由于前景和背景之间的对比度不足，阈值的任何算法都无法很好地识别为 ROI（参见图 4D的下半部分），可能只有极少数微室可以很好地识别为 ROI。在统计观点中，没有问题。
- 荧光强度提取
- 打开荧光图像并将其带到前面。再次单击"应用 ROI"蒙版，将确定的 RO 应用于荧光图像（图 4D右下角）。
- 选择用于分析端点图像（如 mNeonGreen 数据所示）或用于分析时间过程数据（如碱性磷酸酶数据所示）的"时间延迟"（如碱性磷酸酶数据所示）。
- 在框中输入100 表示每个 ROI 的前 100 像素将仅用于计算相应滴滴的平均强度。如果在前像素数中输入0，则每个 ROI 的所有像素将用于计算相应滴滴的平均强度。
注： BF 和荧光图像之间可能存在多个像素的漂移，这意味着 ROI 中的某些像素可能属于荧光图像的背景。因此，插件提供了一个选项，用于指定用于计算每个水滴平均强度的顶级强度排名像素数。 - 要分析端点图像（即，在步骤 7.4.2 中选择一枪），请单击"测量强度"按钮以计算所有检测到的液滴的平均强度。ROITable使用荧光映像中的新数据进行更新。同时，直方图显示在新的弹出窗口直方图（图4E）。
注： 更改框箱编号中的箱大小可以优化直方图的显示。在开发的 GUI 中可以完成高斯分布的总和。斐济的弹出日志窗口显示拟合结果。或者，通过单击"保存为文本"的按钮导出数据，并与其他软件执行各种统计分析（图 4F、G）。 - 为了分析时间过程图像（即，在步骤 7.4.2 中选择时移），弹出窗口是"强度时间过程"而不是直方图，其中包含对应于特定时间点和时间强度图的直方图（图 5）。还可以使用弹出窗口的"文件"菜单导出文本数据。
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Representative Results
微制造工艺包括基材清洗、表面功能化、CYTOP涂层、光刻、干蚀刻、光刻剥离和最终清洁。重要的是，所提出的协议允许完全去除微腔图3A内的疏水性CYTOP聚合物，在标准盖玻璃基板上产生高度平行的亲水疏水结构。在油封协议的帮助下，通过在微腔中封装荧光溶液，验证了结果液滴的统一尺寸（图3B）。使用开发的软件提取的荧光强度是滴径的良好指标。荧光强度的 CV，3%，反映了整个阵列上水滴大小的窄分布（图 3C）。从共聚焦显微镜重建的3D图像也显示了一致的滴体积随着时间的推移（图3D，补充电影1）44。44相比之下，广泛使用的FC-40油产生的液滴在荧光强度45中表现出几倍的差异。FemDA 中的形成液滴在 RT 中稳定至少 24 小时（图 3E）。液滴的高质量最终构成了定量测量的基础。
高通量数据需要高通量数据分析工具46，47。46,开发的插件大大简化了图像数据分析，加快了图像数据分析。基于数字图像处理理论48，可对去聚焦BF图像进行二分一化，用于在背景校正和降噪后提供每个滴滴的坐标信息（图4A-C）。这个想法使暗滴的精确定位成为可能。
荧光蛋白mNeonGreen在FemDA中合成。每滴浓度为0.05分子的模板DNA被随机分布到每个滴滴中，通过无细胞转录和翻译反应启动蛋白质合成。由于每滴的DNA分子平均数量小于1，一些液滴含有零模板DNA，而其他液滴则含有一个或多个DNA分子。在RT孵化6小时后，使用显微镜采集了终点图像。在并发去聚焦BF图像的帮助下，开发的软件对堆栈图像数据进行了分析（图4A-E）。每个小滴的荧光强度是相应滴中蛋白质产量的度量。荧光强度的直方图显示了离散分布，并且由相等峰峰间隔的高斯分布总和（图4F）很好地拟合，这强烈表明每个滴滴的DNA分子数量不同。与重复的掷硬币游戏类似，泊森分布在数学上描述了发生的独立随机事件的数量。含有不同数字（本例中最多3个）的DNA分子的液滴发生的概率非常适合泊松分布（P = e-= k / k！），其中α是每个液滴中DNA分子的预期平均数，k是液滴中DNA分子的实际数量，每滴平均0.05个DNA分子（图4G）31，如预期的那样随机分布DNA分子。31由于模板DNA溶液的加载浓度与最终安装的浓度相同（即0.05），因此，FemDA 中的 CFPS 反应效率为 100%（或接近 100%）。换句话说，单个DNA分子足以有效地触发女性滴滴中的CFPS反应。
碱性磷酸酶的CFPS反应每5分钟记录一次。开发的软件还支持分析时间过程数据（图5）。耦合的氟原反应显示，在早期时间点液滴的荧光强度有类似的离散分布。直方图结果还验证了滴滴中不同数量的DNA分子的占用情况。随着氟基板DiFMUP的逐渐耗竭，荧光强度最终收敛到一个值。
图1：超高密度微腔阵列基板的微制造工艺。（A） 定制真空夹头的技术图纸。单位： mm. （B） CYTOP 薄膜厚度与自旋速度数据。（C） 在青化玻璃基板上的全氟聚合物CYTOP的自旋涂层。照片分别展示了均匀涂层和不均匀涂层的坏例子。黑色箭头指示不均匀 CYTOP 薄膜的特定位置。（D） 在 CYTOP 涂层基板上的光刻胶旋转涂层。旋转涂层后，必须使用乙醇浸透的清洁雨刮器（中间照片）去除基底边缘附近的光阻。照片分别展示了均匀涂层和不均匀涂层的坏例子。白色箭头指示不均匀光阻膜的特定位置。（E） 使用蒙版校准器曝光涂层光刻机。（F） 开发开发人员中暴露的光刻胶。光度电阻的暴露部分可溶于开发人员解决方案中。（G） CYTOP 的活性蚀刻。未发现的CYTOP被O2等离子体移除。（H） 去除光刻面膜。光刻胶被丙酮去除。基板使用2丙醇和H2O进行清洁。请点击这里查看此图的较大版本。
图2：微室阵列装置的制备和使用。（A） 称重 PDMS 的固化剂和预聚物。（B） 将混合和脱化混合物倒入带状的培养皿中。聚合物混合物中有一些新产生的气泡。（C） 再次在真空室中除去混合物。气泡在顶部表面上升并破裂。（D） 脱化并固化的PDMS树脂。（E） 从培养皿中剥去固化的 PDMS 弹性体。（F） 使用平电缆切割机切断每个 PDMS 通道块。（G） 使用活检冲孔在 PDMS 通道的每一端打孔。（H） 组装的装置。PDMS 树脂可以粘附在 CYTOP 表面。（I） PDMS 通道内的半透明微室阵列区域在冷却前充满水溶液。（J） 冷却后 PDMS 通道内的透明微室阵列区域。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：超均匀和超稳定的女性飞沫。（A） 3D 激光扫描共聚焦显微镜成像，用于制造基材。示例图像中的圆柱形微腔显示高度为 3 μm，直径为 4 μm。（B）在平面阵列的大面积上均匀地滴。此处仅显示整个数组的部分区域。每个液滴密封了荧光溶液（10μM ATTO-514）。（C） 液滴在整个单个数组上的大小分布。荧光强度用作水滴大小的指示器。简历只有3%。（D） 使用共聚焦 z 堆栈时间过程数据进行体积测量。阵列上的液滴体积由显微镜软件（NIS-元素，尼康）给出。（E） 光漂白后荧光恢复.在第一帧之后，使用共聚焦显微镜的密闭激光束对几滴水滴进行了完全光漂白。其荧光强度记录为24小时，未观察到荧光恢复（红线）。同一视场中其他非光漂白液滴的荧光强度记录在黑线中。每个时间点的错误条（半透明颜色）为 1 SD。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：端点微观图像数据的分析过程。去聚焦的明亮场图像用于提取每个微腔/液室的坐标。根据微室边缘（作为前景）与其他区域（作为背景）之间的强度差，可以从背景中提取连续和近圆边。由于跨视场（A）的背景分布不均，一般需要一些图像预处理来提高双分化输出的质量。减去背景（B） 后，每个帧的背景都统一化了。根据经验，"滚球半径"（步骤 1）中的输入值为 20-50，用于 2048 像素 × 2048 像素图像，10-20 表示 512 像素 = 512 像素图像。值越大，处理时间越短。要降低背景减法图像中的噪声，请对图像（C） 应用中位滤波器 。通常，半径（步骤 3）中的输入值为 1-2 像素。如放大的插入所示，背景减法和滤镜图像可以使用内置阈值插件很好地进行双化，以便可以准确识别与边和兴趣区域 （ROIs） 对应的前景。图像所有帧的 ROI 检测都是通过使用已安装的自制插件FemDA 分析（D） 进行的。ROI 的像素大小（步骤 5 和 6）和圆度（步骤 7 和 8），我们希望放入计算中的帧（步骤 9 和 10）根据实际数据手动定义。单击"生成 ROI"（步骤 11）并等待后，确定了输入帧中每个 ROI 的坐标。单击应用ROI 蒙版（步骤 12）后，每个检测到的 ROI 都用黄色线括起来并突出显示。打开荧光图像并再次单击应用 ROI 蒙版后，确定的 ROIs 蒙版应用于荧光图像。"顶部像素数（步骤 14）指定了每个 ROI 的顶级强度排名像素数，用于计算各个液滴的平均强度。单击测量强度（步骤 15）并等待后，生成直方图（E）。直方图可以使用直方图窗口中可用的参数安装高斯分布总和。或者，平均强度数据可以导出到文本文件（步骤 16），并通过其他软件（F） 进行分析。（G） 在给定阵列中含有不同数量DNA分子的液滴发生的概率。直方图（灰色）由泊森分布（红色虚线）很好地拟合，每个滴体平均有0.05个DNA分子，正如DNA分子随机分布的预期一样。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：分析时间过程微观图像数据。检测到的 RO（按照图 4的步骤 1-12）直接应用于时间过程数据。在图 4的步骤 13 中，选择"延时"并在时间间隔 [min]中输入相邻帧之间的实际时间间隔（以分钟为单位）。单击"测量强度"（图 4的步骤 15）并等待后，将生成时间强度图和直方图（与图 4E相同）。"反"位置指定直方图的时间点，该点显示为垂直红线。插件还支持为每个跟踪行指定颜色。黄色：0个DNA;蓝色是1个DNA;红色：2个DNA;黑色：3个DNA。时间过程数据也可以导出到文本文件。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充电影 1. 请点击此处下载此影片。
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Discussion
基于 FemDA 中高度均匀、稳定和生物相容液滴的高定量测量使离散分布得以实现，这是我们研究的独特特征，不同于其他。本文系统地优化并详细介绍了微制造和滴层形成过程。已建立的协议中有几个关键步骤。
首先，在矩形薄玻璃基板上高粘性CYTOP聚合物的统一涂层在很大程度上决定了结果基板的质量。鉴于目标透镜的工作距离通常较短，放大倍率高（参见步骤 6.1），必须使用薄盖玻璃。在薄而灵活的基板上进行高质量的自旋涂层通常很棘手。我们尚未测试所有可能的设计，但发现具有相同矩形尺寸的多孔真空夹头确实适用于自旋涂层。将 CYTOP 聚合物掉落在盖玻璃基板的中心并立即启动自旋涂层非常重要（参见步骤 1.3.2）。难度程度与基材形状有关较小，但与聚合物的粘度有关。CYTOP 产品线提供几种不同浓度的商业产品。包装中随附的稀释剂也可用于稀释原始产品，如果需要，其粘度较低。我们用于实验的CYTOP 816是浓度最高的商业产品，能够稳稳溶解溶剂中的聚合物。较厚的涂层需要较低的自旋速度或多轮涂层和固化。在新环境中使用新的旋转涂布机时，强烈建议绘制特征厚度与自旋速度曲线。
其次，洁净室的适当湿度对于理想的光刻和在指定位置完全去除光刻胶至关重要。光刻造像中的光化学反应使用H2O作为反应物之一。然而，在高于H2O沸温的温度下，软烘焙会去除涂层光刻胶中的H2O含量。"干燥"光刻机必须花时间再次从空气中吸收H2O（参见步骤1.4.6）。这一点往往被忽视。鉴于许多实验室可能只有一些没有湿度控制的简化的洁净室设施，湿度在季节会剧烈波动或受天气影响。低成本解决方案是在洁净室中使用家用加湿器或除湿器。开发后完全暴露的CYTOP层可以通过RIE有选择地完全去除，完全露出玻璃底部。最终，亲水玻璃底部和疏水性CYTOP侧壁的混合结构对于稳扎地将水溶液捕获到女性空间非常重要。
第三，新发现的油（ASAHIKLIN AE-3000，Fomblin Y25）和表面活性剂（SURFLON S-386）显示了前所未有的密封性能，氟聚合物反应器13。冲洗油的喷射必须在冷却的扁平金属块上进行（参见步骤 5.2）;否则，无法形成通道入口附近的液滴。第二个密封油的喷射可以在RT进行（参见步骤5.5）。这些油和表面活性剂以前从未用于生物研究。目前还没有找到更好的替代方案。为了扩大油和表面活性剂的有用组合，用于液滴制备，油的新成员（或同一产品线中的类似）和表面活性剂（或同一产品线中的类似物）值得尝试应用于微流体液滴系统中。
以下是需要注意的另外两点。其一，在显微镜成像过程中，ROI存在时滞。一个周期的总成像时间主要取决于阵列大小和客观透镜的放大倍率。曝光时间、快门速度和电动级的移动速度也是次要因素。根据经验，在 60° 放大倍率下成像 106滴滴至少需要 10-20 分钟。这种不可避免的时滞在数据分析中引入了一些错误，应始终予以仔细考虑。另一个原因是，单个基板上的液滴总数不会超过108~109，即使增加液滴的密度或减小液滴的单个大小。这是因为面罩对准器（对于 4 英寸晶圆）可以处理的玻璃基板尺寸有限。由于大型、薄和易碎的玻璃基板难以处理，因此不可建议进一步增加盖玻璃的尺寸。
FemDA 可被视为超小型微化微化板。在96孔微化板中进行的任何生化反应都可以尝试使用FemDA进行。它肯定可用于酶活性测量，无需复杂的蛋白质纯化。它也可以兼容数字聚合酶链反应（数字PCR）和数字酶相关的免疫吸附测定（数字ELISA）31，49。31,49体积小、阵列大、稳定性高，与现有的数字生物测定方法不同，具有一定的优势。能够解决女性滴液中不同数量的模板DNA分子的FemDA系统已经显示了精确蛋白质筛选13的威力。FemDA 是一种新的体外分体系统，能够快速进化各种酶。随着生物信息学和图书馆建设技术的进步，高性能蛋白质的按需创造时代必将到来。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了JSPS KAKENHI赠款号JP18K14260和日本海洋-地球科学技术厅预算的支持。我们感谢德古奇（JAMSTEC）和伊库塔（JAMSTEC）提供特征设施。我们感谢 Ken Takai （JAMSTEC） 的商业软件支持。微制造在东京大学武田森田超洁净室进行，由日本教育文化、体育、科学技术省（MEXT）的"纳米技术平台计划"支持，授予编号JPMXP09F19UT0087。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
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