Summary

Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

Published: June 20, 2020
doi:

Summary

Het algemene doel van het protocol is om meer dan een miljoen geordende, uniforme, stabiele en biocompatibele femtoliter druppels voor te bereiden op een 1 cm2 vlakke substraat die kan worden gebruikt voor celvrije eiwitsynthese.

Abstract

De vooruitgang in ruimtelijke resolutie en detectiegevoeligheid van wetenschappelijke instrumentatie maakt het mogelijk om kleine reactoren toe te passen voor biologisch en chemisch onderzoek. Om aan de vraag naar hoogwaardige microreactoren te voldoen, ontwikkelden we een femtoliter druppelarray (FemDA) apparaat en illustreerden we de toepassing ervan in massaal parallelle celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties. Meer dan een miljoen uniforme druppels werden gemakkelijk gegenereerd binnen een vinger-sized gebied met behulp van een twee-staps olie-afdichting protocol. Elke druppel was verankerd in een femtoliter microkamer bestaande uit een hydrofiele bodem en een hydrofobe zijwand. De hybride hydrofiele hydrofiele structuur en de speciale afdichtingsoliën en oppervlakteactieve stoffen zijn cruciaal voor het stabiel vasthouden van de femtoliter waterige oplossing in de femtoliter ruimte zonder verdampingsverlies. De femtoliter configuratie en de eenvoudige structuur van het FemDA apparaat maakten een minimaal reagensverbruik mogelijk. De uniforme dimensie van de druppelreactoren maakte grootschalige kwantitatieve en tijdsmetingen overtuigend en betrouwbaar. De FemDA-technologie correleerde de eiwitopbrengst van de CFPS-reactie met het aantal DNA-moleculen in elke druppel. We hebben de procedures over de microfabricage van het apparaat, de vorming van de femtoliterdruppels en de verwerving en analyse van de microscopische beeldgegevens gestroomlijnd. Het gedetailleerde protocol met de geoptimaliseerde lage bedrijfskosten maakt de FemDA-technologie toegankelijk voor iedereen die standaard cleanroomfaciliteiten en een conventionele fluorescentiemicroscoop op zijn eigen plaats heeft.

Introduction

Onderzoekers gebruiken reactoren om bio/chemische reacties uit te voeren. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om de omvang van de reactor te verkleinen en de experimentele doorvoer te verhogen om het reagensverbruik te verlagen en tegelijkertijd de werkefficiëntie te verbeteren. Beide aspecten zijn erop gericht onderzoekers te bevrijden van een zware werkdruk, de kosten te verlagen en onderzoek en ontwikkeling te versnellen. We hebben een duidelijke historische routekaart over de ontwikkeling van de reactortechnologieën vanuit het oogpunt van reactievolumes en doorvoer: enkele bekers/kolf/reageerbuizen, milliliterbuizen, microliterbuizen, microliter 8-buisstrips, microliter 96/384/1536-putplaat en microfluïde nanoliter/picoliter/femtoliterreactoren1,2,3,4,5,6,7. Analoog aan het verkleinen van de functiegrootte van transistors op geïntegreerde circuitchips in de halfgeleiderindustrie in de afgelopen decennia, bio/ chemische microreactoren gaan door volumereductie en systeemintegratie. Dergelijke kleinschalige instrumenten hebben een diepgaande impact gehad op celgebaseerde of celvrije synthetische biologie, biomanufacturing en prototyping en screening met hoge doorvoer8,9,10,11,12. Dit document beschrijft onze recente inspanningen op de ontwikkeling van een unieke druppel array technologie en toont de toepassing ervan in CFPS13, een fundamentele technologie voor synthetische biologie en moleculaire screening gemeenschappen14. In het bijzonder bieden we bewust een geoptimaliseerd en goedkoop protocol om het FemDA-apparaat voor iedereen toegankelijk te maken. Het goedkope en gemakkelijk te hanteren protocol voor het geminiaturiseerde apparaat zou bijdragen aan de educatieve doeleinden van universiteiten en de technologie helpen verspreiden.

FemDA bereidt femtoliterdruppels met een ultrahoge dichtheid van 106 per 1 cm2 op een vlakke glazen substraat. We hebben een hydrofoob polymeer, CYTOP15,op het glazen substraat gecoat en selectief geëtst (verwijderd) CYTOP op vooraf gedefinieerde posities om een microkamerarray op het substraat te genereren. Zo bestaat de resulterende microkamer uit een hydrofobe zijwand (CYTOP) en een hydrofiele bodem (glas). Wanneer achtereenvolgens stromend water en olie over het patroonoppervlak stromen, kan het water worden gevangen en verzegeld in de microkamers. De hydrofiele hydrofiele structuur is van vitaal belang voor het afweren van water buiten de microkamers, het isoleren van individuele microreactoren en het behouden van een kleine waterige oplossing in de femtoliterruimte. De unieke eigenschap werd met succes toegepast voor de bereiding van water-in-olie druppels en lipide bilayer microcompartimenten16,17. Vergeleken met het prototype apparaat16,hebben we eerst geoptimaliseerd de microfabricage proces om een volledige verwijdering van de CYTOP polymeer en een volledige blootstelling van de glazen bodem te realiseren. CYTOP is een speciaal fluorpolymeer met een extreem lage oppervlaktespanning (19 mN/m) lager dan die van conventionele microreactormaterialen zoals glas, kunststoffen en siliconen. De goede optische, elektrische en chemische prestaties zijn reeds gebruikt bij de oppervlaktebehandeling van microfluïde apparaten18,19,20,21,22,23,24. In het FemDA-systeem moet, om een goede bevochtiging van de olie op het CYTOP-oppervlak te bereiken, de oppervlaktespanning van de olie lager zijn dan die van het vaste oppervlak25. Anders, de vloeibare olie in contact met het vaste oppervlak heeft de neiging om bolvormig te worden in plaats van zich te verspreiden over het oppervlak. Bovendien vonden we dat sommige populaire perfluorkoolwaterstofoliën (bijvoorbeeld 3M FC-40)16 en hydrofluoroether oliën (bijvoorbeeld 3M Novec-serie) CYTOP kunnen oplossen als gevolg van de amorfe morfologie van CYTOP, wat dodelijk is voor kwantitatieve metingen en twijfelachtig zou zijn in termen van kruisbesmetting tussen druppels. Gelukkig hebben we een biocompatibele en milieuvriendelijke olie geïdentificeerd die een lagere (< 19 mN/m) oppervlaktespanningvertoont 13. We vonden ook een nieuwe oppervlakteactieve stof die kan oplossen in de geselecteerde olie en functie in een lage concentratie (0,1%, ten minste 10 keer lager dan eerder gemeld populaire degenen26,27)13. De resulterende water/olie-interface kan worden gestabiliseerd door de oppervlakteactieve. Vanwege de hoge verdampingssnelheid van de olie, na de spoeling met de olie, hebben we een andere biocompatibele en milieuvriendelijke olie aangebracht om de eerste te vervangen om de microkamers te verzegelen. We noemen de eerste olie (ASAHIKLIN AE-3000 met 0,1 wt % SURFLON S-386) de “spoelolie” en de tweede olie (Fomblin Y25) de “afdichtingsolie”, respectievelijk.

De twee-staps olie-afdichting strategie kan een robuuste vorming van de femtoliter druppel array te realiseren binnen enkele minuten en zonder geavanceerde instrumentatie. Als gevolg van de verdamping probleem, is het beschouwd als een uitdaging om microreactoren kleiner dan picoliter volumes28genereren . FemDA heeft dit probleem aangepakt door de materialen en processen die worden gebruikt voor de bereiding van microreactoren/druppels systematisch te optimaliseren. Verschillende opmerkelijke kenmerken van de resulterende druppels zijn de hoge uniformiteit (of monodispersity), stabiliteit, en biocompatibiliteit op de femtoliter schaal. De variatiecoëfficiënt (CV) van het druppelvolume is slechts 3% (zonder vignetteringscorrectie voor de microscopische beelden), het kleinste CV onder druppelplatforms ter wereld, wat zorgt voor een zeer parallelle en kwantitatieve meting. De femtoliter druppel is stabiel voor ten minste 24 uur zonder kruisbesmetting tussen druppels bij kamertemperatuur, wat waardevol is voor een betrouwbare tijd-cursus meting. Wat de biocompatibiliteit betreft, zijn we erin geslaagd om verschillende eiwitten te synthetiseren uit een enkelkopiesjabloon-DNA in de druppel van de femtoliter, die voorheen als moeilijk of inefficiënt29,30werd beschouwd . Het zou het waard zijn om te verduidelijken waarom sommige eiwitten die in staat zijn om gesynthetiseerd te worden in de FemDA niet kunnen worden gesynthetiseerd in andere druppelsystemen. FemDA was niet alleen een technische vooruitgang, maar realiseerde ook een ongekend kwantitatieve meting die de eiwitopbrengst (zoals weerspiegeld door de fluorescentieintensiteit van de druppel) kan correleren met het aantal sjabloon-DNA-moleculen in elke druppel. Als gevolg hiervan toonde het histogram van de fluorescentieintensiteit van druppels van femda-gebaseerde CFPS een discrete verdeling die mooi kan worden gemonteerd door een som Gaussische verdelingen van gelijke piek-naar-piekintervallen. Bovendien was de waarschijnlijkheid van het optreden van druppels met verschillende aantallen DNA-moleculen een perfecte pasvorm voor een Poisson-distributie31. Zo kan de verschillende eiwitopbrengst in elke druppel worden genormaliseerd op basis van de discrete verdeling. Deze kritieke eigenschap stelt ons in staat om de enzymatische activiteitsinformatie te scheiden van de schijnbare intensiteit, die nog niet beschikbaar is met andere microreactorplatforms. Bestaande microfluïde cel/druppelsorteersystemen zijn bedreven in volautomatisch sorteren en zijn goed in het concentreren van monsters, maar kunnen soms alleen een relatief breed of langstaart histogram produceren in het analytische aspect32,33. Ons zeer kwantitatieve en biocompatibel FemDA-systeem zet een nieuwe maatstaf en een hoge analytische standaard op het gebied van microreactorontwikkeling.

De oliën en oppervlakteactieve stoffen die kunnen worden gebruikt voor de bereiding van druppels zijn nog steeds zeer beperkt34. De combinatie van ASAHIKLIN AE-3000 en SURFLON S-386 gevestigd in FemDA is een nieuw lid van het groeiende arsenaal van de fysiochemische interface tussen de waterige fase en de oliefase13. De nieuwe interface in FemDA is fysiek stabiel, chemisch inert en biologisch compatibel met de complexe transcriptie-, vertaal- en post-translationele modificatiemachines voor vele soorten eiwitten13. Het zou eerder aantrekkelijk zijn om een eiwit te vinden dat niet in plaats daarvan in de druppelinstellingen kan worden gesynthetiseerd. Bovendien is de kostenbesparing van reagentia meer zichtbaar in het femtoliter druppelsysteem dan in nanoliter- en picoliterreactorsystemen35,36. In het bijzonder zou er vaak een groot dood volume, dat voornamelijk wordt veroorzaakt door buizen of externe leveringen, in microfluïde druppelgeneratie systemen, maar niet in onze FemDA. Het arrayformaat wordt ook begunstigd door herhaalde en gedetailleerde microscopische karakterisering (vergelijkbaar met de zogenaamde high-content analyse) voor elke reactor37,in plaats van slechts een enkele momentopname voor een snel bewegend object. De femtoliter schaal maakte de integratie van meer dan een miljoen reactoren op een vinger-sized gebied, terwijl hetzelfde aantal nanoliter reactoren (indien het bestaat) vereist meer dan vierkante meter gebied, die ongetwijfeld onpraktisch zou zijn voor de vervaardiging of het gebruik van een dergelijk systeem.

Protocol

1. Microfabricage van het femtoliter microkamersubstraat OPMERKING: Voer het volgende microfabricage-experiment uit in een cleanroom. Draag handschoenen en een cleanroom pak voor het invoeren van de cleanroom. Reinigingsdekselglas substraat Zet het afdekglas op een afdekglas kleuringsrek. Soniceer het afdekglas in 8 M natriumhydroxide (NaOH) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).LET OP: NaOH in hoge concentraties is zeer gevaarlijk voor huid en oog. Ga er voorzic…

Representative Results

Het microfabricageproces bestaat uit substraatreiniging, oppervlaktefunctionalisatie, CYTOP-coating, fotolithografie, droge etsen, fotoresisten strippen en uiteindelijke reiniging. Belangrijk is dat het gepresenteerde protocol volledige verwijdering van het hydrofobe CYTOP-polymeer in de microkamers figuur 3Amogelijk liet , waardoor een zeer parallelle hydrofiele hydrofiele-in-hydrofobe structuur op een standaard afdekglassubstraat werd geproduceerd. Met behulp van het olieafdichtingsprotoco…

Discussion

De zeer kwantitatieve meting op basis van de zeer uniforme, stabiele en biocompatibele druppels in FemDA maakte de discrete distributie mogelijk, het unieke kenmerk van onze studie die verschilt van andere. We hebben de processen voor microfabricage en druppelvorming systematisch geoptimaliseerd en gedetailleerd in dit document. Er zijn verschillende kritieke stappen in het vastgestelde protocol.

Ten eerste bepaalt de uniforme coating van zeer viskeuze CYTOP-polymeer op het rechthoekige dunne …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI subsidienummer JP18K14260 en het budget van Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology. Wij danken Shigeru Deguchi (JAMSTEC) en Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) voor het leveren van de karakteriseringsfaciliteiten. Wij danken Ken Takai (JAMSTEC) voor commerciële software ondersteuning. De microfabricage werd uitgevoerd op Takeda Sentanchi Supercleanroom, de Universiteit van Tokio, ondersteund door “Nanotechnology Platform Program” van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT), Japan, Grant Number JPP09F19UT0087.

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

View Video