Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

En Femtoliter dråbe array for massivt parallel proteinsyntese fra single DNA molekyler

doi: 10.3791/60945 Published: June 20, 2020

Summary

Det overordnede mål med protokollen er at forberede over en million bestilte, ensartet, stabil og biokompatibel femtoliter dråber på en 1 cm2 planar substrat, der kan bruges til celle-fri proteinsyntese.

Abstract

Fremskridt inden for geografisk opløsning og detektionsfølsomheden af videnskabelige instrumenter gør det muligt at anvende små reaktorer til biologisk og kemisk forskning. For at imødekomme efterspørgslen efter højtydende mikroreaktorer udviklede vi en femtoliterdråbesystem (FemDA) enhed og eksemplificerede dens anvendelse i massivt parallelle cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner. Over en million ensartede dråber blev let genereret inden for en finger-størrelse område ved hjælp af en to-trins olie-forsegling protokol. Hver dråbe var forankret i en femtoliter mikrokammer bestående af en hydrofil bund og en hydrofob sidevæg. Den hybride hydrofile-i-hydrofobe struktur og de dedikerede tætningsolier og overfladeaktive stoffer er afgørende for stabilt at bevare femtoliter vandig opløsning i femtoliter rummet uden fordampning tab. Femtoliterkonfigurationen og den enkle struktur af FemDA-enheden tillod minimalt reagensforbrug. Den ensartede dimension af dråbereaktorer gjort store kvantitative og tid-kursus målinger overbevisende og pålidelig. FemDA-teknologien korreleret proteinudbyttet af CFPS reaktion med antallet af DNA-molekyler i hver dråbe. Vi strømlinede procedurerne om mikrofabrikation af enheden, dannelsen af femtoliterdråberne og erhvervelsen og analysen af de mikroskopiske billeddata. Den detaljerede protokol med de optimerede lave driftsomkostninger gør FemDA-teknologien tilgængelig for alle, der har standard renrumsfaciliteter og et konventionelt fluorescensmikroskop i deres eget sted.

Introduction

Forskere bruger reaktorer til at udføre bio/kemiske reaktioner. Der er gjort en betydelig indsats for at reducere reaktorens størrelse og øge forsøgskapaciteten for at sænke reagensforbruget og samtidig forbedre arbejdseffektiviteten. Begge aspekter har til formål at befri forskere fra en tung arbejdsbyrde, mindske omkostningerne og fremskynde forskning og udvikling. Vi har en klar historisk køreplan for udviklingen af reaktorteknologierne ud fra reaktionsmængder og gennemløb: enkeltbæger/kolbe/reagensglas, milliliterrør, mikroliterrør, mikroliterstrimler 8-rørstriber, mikroliter 96/384/1536-brøndplade og mikrofluidiske nanoliter/picoliter/femtoliterreaktorer1,,2,,3,,4,5,6,7. Svarende til nedskæringer funktionen størrelse transistorer på integrerede kredsløb chips i halvlederindustrien i de seneste årtier, er bio / kemiske mikroreaktorer går gennem volumenreduktion og systemintegration. Sådanne små værktøjer har haft en dybtgående indvirkning på celle-baseret eller celle-fri syntetisk biologi, biofremstilling, og høj-throughput prototyping og screening8,9,10,11,12. Dette dokument beskriver vores seneste indsats for at udvikle en unik dråbearray og demonstrerer dens anvendelse i CFPS13, en grundlæggende teknologi for syntetiske biologi- og molekylære screeningssamfund14. Især giver vi bevidst en optimeret og billig protokol for at gøre FemDA-enheden tilgængelig for alle. Den billige og let at håndtere protokol for miniaturiseret enhed ville bidrage til uddannelsesmæssige formål universiteter og bidrage til at sprede teknologien.

FemDA forbereder femtoliterdråber ved en ultrahøj tæthed på 106 pr. 1 cm2 på et plant glas substrat. Vi belagt en hydrofob polymer, CYTOP15,på glasset substrat og selektivt ætset (fjernet) CYTOP på foruddefinerede positioner til at generere en mikrokammer array på substratet. Således er den resulterende mikrokammer består af en hydrofob sidevæg (CYTOP) og en hydrofil bund (glas). Når sekventielt strømmende vand og olie over den mønstrede overflade, kan vandet blive fanget og forseglet i mikrokammer. Den hydrofile-i-hydrofobiske struktur er afgørende for at afvise vand uden for mikrokammeret, isolere individuelle mikroreaktorer og bevare en lille vandig opløsning inde i femtoliterrummet. Den unikke egenskab blev anvendt med succes til fremstilling af vand-i-olie dråber og lipid tolag mikrokommenter16,17. Sammenlignet med prototypenenhed 16,vi først optimeret mikrofabrikation proces til at realisere en fuldstændig fjernelse af CYTOP polymer samt en fuld eksponering af glasbunden. CYTOP er en speciel fluorpolymer med ekstremt lav overfladespænding (19 mN/m) lavere end for konventionelle mikroreaktormaterialer som glas, plast og silikone. Dens gode optiske, elektriske og kemiske ydeevne er allerede blevet udnyttet i overfladebehandling af mikrofluidic enheder18,19,,20,,21,,22,23,24. I FemDA-systemet skal oliens overfladespænding være lavere end den faste overflade25for at opnå god befugtning af olien på CYTOP-overfladen. Ellers er den flydende olie i kontakt med den faste overflade tendens til at blive sfærisk snarere end at sprede sig over overfladen. Desuden fandt vi, at nogle populære perfluorcarbonolier (f.eks. 3M FC-40)16 og hydrofluoretherolier (f.eks. 3M Novec-serien) kan opløse CYTOP som følge af CYTOP's amorfe morfologi, som er fatal for kvantitativ måling og vil være tvivlsom med hensyn til krydskontaminering blandt dråber. Heldigvis identificerede vi en biokompatibel og miljøvenlig olie, der udviser lavere (< 19 mN/m) overfladespænding13. Vi fandt også et nyt overfladeaktivt stof, der kan opløses i den valgte olie og funktion i en lav koncentration (0,1%, mindst 10 gange lavere end tidligere rapporteret populære dem26,,27)13. Den resulterende vand / olie interface kan stabiliseres af det overfladeaktive stof. På grund af oliens høje fordampningshastighed, efter skylningen med olien, anvendte vi en anden biokompatibel og miljøvenlig olie til at erstatte den første til at forsegle mikrokammerene. Vi kalder den første olie (ASAHIKLIN AE-3000 med 0,1 wt % SURFLON S-386) "flush olie" og den anden olie (Fomblin Y25) den "forsegling olie," hhv.

Den to-trins olie-forsegling strategi kan realisere en robust dannelse af femtoliter dråbe array inden for få minutter og uden sofistikeret instrumentering. På grund af fordampningsproblemet er det blevet anset for udfordrende at generere mikroreaktorer, der er mindre end picolitervolumener28. FemDA tog fat på dette problem ved systematisk at optimere de materialer og processer, der anvendes til fremstilling af mikroreaktorer/dråber. Flere bemærkelsesværdige træk ved de resulterende dråber omfatter høj ensartethed (eller monodispersity), stabilitet og biokompatibilitet på femtoliter skalaen. Variationskoefficienten (CV) for dråbevolumenet er kun 3% (uden vignettering korrektion for mikroskopiske billeder), det mindste CV blandt dråbeplatforme i verden, hvilket sikrer en meget parallel og kvantitativ måling. Femtoliterdråben er stabil i mindst 24 timer uden krydskontaminering blandt dråber ved stuetemperatur, hvilket er værdifuldt for en pålidelig tidsmåling. Med hensyn til biokompatibilitet lykkedes det os at syntetisere forskellige proteiner fra en enkelt kopi skabelon DNA i femtoliter dråbe, som tidligere var blevet anset for vanskeligt ellerineffektivt 29,30. Det ville være værd at belyse, hvorfor nogle proteiner, der kan syntetiseres i FemDA ikke kan syntetiseres i andre dråbesystemer. FemDA var ikke blot en teknisk fremgang, men indså også en hidtil uset kvantitativ måling, der kan korrelere proteinudbyttet (som afspejlet af dråbens fluorescensintensitet) til antallet af skabelon-DNA-molekyler i hver dråbe. Som følge heraf viste histogrammet for fluorescensintensiteten af dråber fra FemDA-baserede CFPS en diskret fordeling, der kan fint monteres ved en sum gaussisk fordelinger af lige top-til-peak intervaller. Desuden var sandsynligheden for forekomst af dråber, der indeholder forskellige antal DNA-molekyler, en perfekt pasform til en Poisson-fordeling31. Således kan de forskellige proteinudbytte i hver dråbe normaliseres baseret på den diskrete fordeling. Denne kritiske funktion giver os mulighed for at adskille enzymatiske aktivitet oplysninger fra den tilsyneladende intensitet, der ikke har været tilgængelig med andre mikroreaktor platforme endnu. Eksisterende mikrofluidiske celle- og dråbesorteringssystemer er dygtige til fuldautomatisk sortering og gode til at koncentrere prøverne , men kan nogle gange kun udsende et relativt bredt eller langthalet histogram i det analytiske aspekt32,33. Vores meget kvantitative og biokompatible FemDA-system sætter et nyt benchmark og en høj analytisk standard inden for mikroreaktorudvikling.

De olier og overfladeaktive stoffer, der kan anvendes til fremstilling af dråber, er stadig meget begrænsede34. Kombinationen af ASAHIKLIN AE-3000 og SURFLON S-386 etableret i FemDA er et nyt medlem af det voksende arsenal af den fysiokemiske grænseflade mellem den vandige fase og oliefase13. Den nye grænseflade i FemDA er fysisk stabil, kemisk inert, og biologisk kompatibel med den komplekse transskription, oversættelse, og post-translationelle modifikation maskiner til mange slags proteiner13. Det ville være temmelig attraktivt at finde et protein, der ikke kan syntetiseres i dråbeindstillingerne i stedet. Desuden er omkostningsbesparelserne for reagenser mere tydelig i femtoliterdråbesystemet end i nanolit- og picoliterreaktorsystemer35,36. Især vil der ofte være en stor død volumen, som hovedsagelig er forårsaget af slanger eller eksterne forsyninger, i mikrofluidic dråbe generation systemer, men ikke i vores FemDA. Array formatet er også begunstiget af gentagne og detaljerede mikroskopiske karakterisering (svarende til såkaldte høj-indhold analyse) for hver enkeltreaktor 37, snarere end kun et enkelt øjebliksbillede for en hurtig bevægelse objekt. Femtoliterskalaen gjorde det muligt at integrere over en million reaktorer på et område i fingerstørrelse, mens det samme antal nanolitreaktorer (hvis det findes) kræver et areal på kvadratmeter, hvilket utvivlsomt ville være upraktisk at fremstille eller anvende et sådant system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikrofabrikation af femtoliter mikrokammerarrayets substrat

BEMÆRK: Udfør følgende mikrofabrikationseksperiment i et renrum. Brug handsker og et renrumsdragt, før du går ind i renrummet.

  1. Rengøring dække glas substrat
    1. Indstil dækslet glas på et dæksel glas farvning rack. Syr dækglasset i 8 M natriumhydroxid (NaOH) i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
      FORSIGTIG: NaOH i høje koncentrationer er meget farligt for hud og øjne. Håndter den forsigtigt uden stænk.
    2. Tag risten ud af NaOH-opløsningen, og skyl dækglasset med vand i ti gange. Opbevar dækglasset i rent vand.
      BEMÆRK: Kassér alkalisk affald til den angivne tank. NaOH-løsningen kan genbruges til den originale flaske og bruges i op til fem gange.
    3. Tør hvert stykke dækglas med en luftblæsepistol.
    4. Bag det tørrede dækglas på en varmeplade ved 200 °C i 5 min. Hold retningen af oversiden af glasunderlaget ensartet under de følgende håndteringsprocesser.
  2. Silanisering af glasoverfladen
    1. Nulstil det rensede dækglas på en tør farvningsrist.
    2. Der tilsættes 150 ml ethanol i et PTFE-bægerglas. Brug en nål (22 G x 70 mm), der er udstyret med 1 ml sprøjte, til at trække 0,075 ml (3-aminopropyl)triethoxysilane og straks injicere den til ethanol (dvs. 0,05 vol%). Træk og skub sprøjten flere gange for at skylle indersiden af sprøjten. Rør opløsningen med nålen for at gøre den homogen.
      BEMÆRK: (3-aminopropyl)triethoxysilane kan opbevares ved stuetemperatur og 1 atm tryk i to år med en tæt forsegling. Absolut ethanol skal forsegles tæt efter brug. Vi anbefaler ikke at bruge udløbne reagenser.
    3. Dækglasset inkuberes i 0,05 vol % aminosilaneopløsningen i 1 time ved RT.
    4. Skyl dækglasset med rent vand i fem gange. Opbevar dækglasset i rent vand.
      BEMÆRK: Kassér affaldet til den udpegede tank.
    5. Tør hvert stykke dækglas med luftblæsepistolen.
    6. Placer alle de tørrede dække glas på aluminiumsfolie. Bag dækglasset på varmepladen ved 80 °C i 5 min.
  3. Spin-belægning CYTOP perfluoropolymer
    1. Placer dækglasset på en tilpasset vakuumpatron af en spincoater (Figur 1A). Tænd for vakuumkontakten for at fikse glasunderlaget.
      BEMÆRK: Vakuumpatronens design er afgørende for en ensartet belægning af tyktflydende polymer på det rektangulære (24 mm × 32 mm) og tyndt (0,13-0,17 mm) underlag (Figur 1A). Vi fandt ud af, at et rektangulært prøvetrin med flere huller (48 huller, hver med en diameter på 1 mm), der forbinder til vakuumkanalen, fungerede bedre end den runde fase med et enkelt centralt hul.
    2. Drop 70-90 μL type-A CYTOP polymer i midten af glasunderlaget. Straks spin-coat polymeren (Figur 1B).
      BEMÆRK: Spin-belægningstilstanden (3.400 omdrejninger i minuttet, 30 s) giver 3 μm tykkelse. Brug mikropipetten, der er beregnet til viskøst væske. Hold mikropipetten oprejst for at få polymeren til at falde næsten perfekt cirkel på underlaget. En luftboble genereres ofte inde i pipettespidsen, når stemplet bevæger sig nedad. Smid ikke den sidste dråbe CYTOP med boblen.
    3. Saml det belagte glas op med fingre, der holder hjørner af glasunderlaget, og læg det på aluminiumsfolie.
    4. Gentag trin 1.3.1-1.3.3 for at spinde alle de resterende stykker af dækglasset.
    5. Det belagte glas bages ved 80 °C i 30 min og derefter ved 200 °C i 1 time.
      BEMÆRK: Denne behandling hærder CYTOP'en fuldt ud og binder cytopen til glasoverfladen. Dæk bageområdet med et låg lavet af aluminiumsfolie for at undgå potentielt støv under den langvarige bagningsproces, hvis det er nødvendigt.
    6. Fjern det CYTOP-belagte dækglas fra kogepladen og afkøl ned til RT. Saml forsigtigt hvert stykke af det belagte glas op og undersøg det for at se, om det er korrekt belagt. Kassér det substrat, der udviser inhomogen belægning.
      BEMÆRK: Overfladen af en pænt belagt CYTOP skal se fladuden uregelmæssig regnbue-lignende mønstre (Figur 1C). Visuel inspektion fra en ordentlig vinkel kan hurtigt bedømme fladhed samt belægning kvalitet. Protokollen kan sættes på pause her.
  4. Spin-belægning fotoresisten
    1. Det CYTOP-belagte dækglas anbringes på vakuumpatronen (se trin 1.3.1) på centrifugeren. Tænd for vakuumkontakten for at fikse dækglasset.
    2. Drop 0,2-0,3 ml fotoresist i midten af substratet. Straks spin-coat fotoresisten på 6.000 rpm for 60 s.
      BEMÆRK: Smid ikke den sidste dråbe af fotoresisten med bobler. Hvis spin coater understøtter højere spin hastighed, kan spin hastighed være op til 7.500 rpm at opnå en tyndere belægning. CYTOP's lave overfladeenergi forhindrer de fleste fotoresister i at blive klæbet til overfladen. Hvis AZ P4903 photoresist ikke er tilgængelig, az P4620 photoresist er et godt alternativ.
    3. Saml det belagte underlag op med to fingre, der holder hjørner af underlaget. Tør den overskydende fotoresisten af nær substratets kantkant (ofte kaldet som kantperlefjernelse eller EBR) ved hjælp af en ethanol-gennemblødt ren visker (Figur 1D). Anbring underlaget på aluminiumsfolien.
      BEMÆRK: Acetone anbefales IKKE til EBR.
    4. Gentag trin 1.4.1-1.4.3 for at spinde fotoresisten for de resterende stykker CYTOP-belagt dækglas. Saml hvert stykke af det belagte glas op og undersøg det for at se, om det er korrekt belagt.
      BEMÆRK: Overfladen af en pænt belagt photoresist skal se flad uden uregelmæssige mønstre (Figur 1D). Visuel inspektion fra en ordentlig vinkel kan hurtigt bedømme fladhed samt belægning kvalitet. Det substrat, der udviser inhomogen belægning, kan genbruges ved vask med acetone, 2-propanol og H2O i rækkefølge og genbruges.
    5. Bag det belagte underlag ved 110 °C i 5 minutter på kogepladen.
    6. Fjern det belagte underlag fra kogezonen og afkøles til RT. Lad stå i 30 min ved en relativ luftfugtighed på 40%-60% for rehydrering af fotoresisten.
      BEMÆRK: H2O er nødvendig for følgende fotokemiske reaktion. Den bagte photoresist mistede H2O-indholdet inde i fotoresisten. Rehydreringsprocessen gør det muligt at absorbere H2O fra luften. Relativ luftfugtighed under 20% eller højere end 80% er ikke egnet til rehydreringsprocessen.
  5. Fotolitografi
    1. I ventetiden på rehydrering (se trin 1.4.6) startes maskens justering. Varm lyskilden op. Læg kromfotomasken.
      BEMÆRK: Følg brugsanvisningen for at betjene maskejusteringen. Fotomasken kan fremstilles via elektronstråle (EB) litografi, hvis EB-anlægget er tilgængeligt. Alternativt kan fotomasken outsources til en lokal virksomhed.
    2. Det rehydrerede substrat (efter endt trin 1.4.6) på borepatronen (Figur 1E).
    3. Angiv eksponeringsparametre. Substratet udsættes i 25 s med en UV-intensitet på 13 mW/cm2 (h-line) i vakuumkontakttilstand. Derefter aflæsses underlaget og sæt det på dækslet glas farvning rack (den samme rack, der anvendes i trin 1.1.1).
    4. Trin 1.5.2-1.5.3 gentages for at eksponere de resterende dele af det rehydrerede substrat.
  6. Udvikling
    1. Substratet udvikles i 5 minutter for at opløse den eksponerede fotoresistens (Figur 1F). Hvor forsigtigt ryste rack i bygherren en gang på timepunktet på 4 minutter.
      BEMÆRK: Udvikleren var AZ 300 MIF. Alternative alkaliske udviklere (f.eks. Brug IKKE glasbæger som udviklerbeholder.
    2. Skyl underlaget med rent vand i ti gange. Opbevar dækglasset i rent vand.
      BEMÆRK: Kassér udvikleren til den angivne tank.
    3. Tør grundigt hvert stykke substrat med luftblæsepistolen.
  7. Reaktiv-ion ætsning
    1. Det tørrede underlag (fra trin 1.6.3) anbringes i reaktionskammeret på reaktiv ionætsningsmaskinen (RIE).
      BEMÆRK: I henhold til vedligeholdelsesreglen for anlægget kan RIE-maskinen enten altid være tændt eller lukket ned hver gang. Hvis kontakten var slukket, skal du tænde for kontakten i henhold til manualen.
    2. Etch den fotoresisterede CYTOP med O2 plasma (Figur 1G).
      BEMÆRK: RIE-betingelsen var som følger. O2 gasflow: 50 sccm; kammertryk: 10.0 Pa; RF-effekt: 50 W; ætsningstid: 27 min. Ætsningstiden blev optimeret til fuldstændig ætsning 3 μm tykkelse af CYTOP.
    3. Saml hvert stykke substrat op fra reaktionskammeret ved hjælp af pincetten og læg dem på dækslet glas farvning rack.
      BEMÆRK: Ifølge anlæggets vedligeholdelsesregel kan reaktionskammeret2 kræve en kort O 2-plasmarensningsproces (f.eks. ætsningstid: 5 min) for at holde reaktionskammeret rent efter hver løbetur.
  8. Fjernelse af fotoresisten og rengøring
    1. Soniker substratet i acetone i 5 min ved RT for at opløse den resterende fotoresistens.
    2. Sonikere substratet i 2-propanol i 5 min på RT.
    3. Skyl underlaget med rent vand i fem gange. Soniker underlaget i 5 min ved RT. Skyl prøven med rent vand i yderligere fem gange. Hold underlaget i rent vand.
    4. Tør hvert stykke substrat med luftblæsepistolen (Figur 1H).
      BEMÆRK: Underlaget kan opbevares i en plastik petriskål. Det fabrikerede substrat er strukturelt stabilt ved RT i mindst et år. Protokollen kan sættes på pause her.
    5. Karakterisere overfladeprofilen af det som-forberedte substrat ved tre-dimensionelle (3D) laserscanning konfokal mikroskopi, hvidt lys interferometri (eller sammenhæng scanning interferometri), eller scanning elektron mikroskopi. Brug den respektive software til at måle diameteren og dybden af de resulterende mikrokammer.
      BEMÆRK: Prøven kan genbruges til andre forsøg efter karakteriseringen med det berøringsfrie og ikke-destruktive 3D-laserscanningskonfokale mikroskop eller hvidt lysinterferometer. Protokollen kan sættes på pause her.

2. Forberedelse af polydimethylsiloxan (PDMS) mikrokanal

BEMÆRK: Brug IKKE latexhandsker til at håndtere PDMS. Brug i stedet polyethylenhandsker( PE).

  1. Gør mikrokanalen mester
    1. Skær en dobbeltbelagt klæbende Kapton-filmtape over i en defineret (3 mm x 19 mm) mikrokanalform ved hjælp af en desktopskærer.
      BEMÆRK: Kapton-båndet var nr #25. STIKA desktop cutter bruger et plugin (tilgængelig fra Roland hjemmeside: https://www.rolanddga.com) af Adobe Illustrator til at køre skæring i henhold til tegningen i Adobe Illustrator-filen. Protokollen kan sættes på pause her.
    2. Stick hvert snit Kapton tape på den flade bund af en petriskål. Standard 90 mm petriskålen kan rumme 12 stykker af tapen.
      BEMÆRK: Reliefstrukturen fungerer som en mester for replika støbning af PDMS. Tryk forsigtigt på tapeoverfladen med en pincet, hvis der er luftbobler klemt inde mellem tapen og petriskålens underlag. Alternativt kan klassisk blødlitografi anvendes til at forberede master på en silicium wafer38. Protokollen kan sættes på pause her.
  2. Hærdning PDMS harpiks i tape-mønstrede petriskål
    1. Bær nye PE-handsker, og overfør 2,5 g hærdningsmiddel af SYLGARD 184 silikone elastomer ved hjælp af en engangsplastpipette til det angivne plastbæger (Figur 2A).
    2. Skift til nye handsker, og overfør 25 g af prepolymerbasen på SYLGARD 184 silikoneelastomer med en engangssprøjte på 50 ml i ovennævnte plastikbæger.
      BEMÆRK: Skift handskerne heri for at forhindre, at hærdningsmidlets eventuelle krydskontaminering kontaminering er til basen.
    3. Brug en deaeration mixer til at blande og afaerate blandingen (program: 3 min blanding efterfulgt af 2 min deaeration).
      BEMÆRK: Hvis deaerationmixeren ikke er tilgængelig, kan en manuelt ophidset (i ca. 15 min)blanding afgasses i et vakuumkammer.
    4. PDMS-blandingen hældes i den tapemønstrede petriskål (Figur 2B). Sæt petriskålen i et minivakuumkammer, og afaer PDMS-blandingen til 1-3 timer (Figur 2C).
      BEMÆRK: Hvis der er luft tilbage i PDMS-blandingen efter 1 time, skal petriskålen tages ud af vakuumkammeret, luftboblen brydes med en luftblæser, hvorefter petriskålen sættes tilbage i vakuumkammeret og fortsættes.
    5. Petriskålen anbringes i en ovn ved 60 °C natten over for at hærde PDMS (Figur 2D).
      BEMÆRK: Selv om en forøgelse af temperaturen kan forkorte hærdningstiden, er den maksimale temperatur, der kan tolereres af polystyren petriskålen uden fysisk deformation, omkring 60 °C.
  3. Replika støbning af PDMS kanal
    1. Skræl den hærdede PDMS elastomer af petriskålen (Figur 2E).
    2. Afskåret hvert stykke PDMS kanal blokke ved hjælp af en flad-kabel cutter (Figur 2F).
    3. Placer PDMS elastomer på en skæremåtte, der vender kanalen opad. Punch et hul i hver ende af kanalen ved hjælp af en biopsi punch (Figur 2G).
    4. Rengør overfladen på PDMS-kanalen med skotsk tape. Pak derefter PDMS-harpiksen ind i et andet stykke skotsk tape for at holde den ren før brug. Opbevar den forberedte PDMS-kanal i en ren petriskål.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

3. Samling af femtoliter mikrokammer array enhed

  1. Placer nogle stykker af vand-gennemblødt rene vinduesviskere langs indersiden væggen af en petriskål til at gøre en forenklet befugtning kammer. PDMS-harpiksen, der er dækket af scotchtape, anbringes i befugtningskammeret, og kammeret forsegles ved hjælp af paraffinfilm. Inkubere i mindst 3 timer, men ikke længere end en dag.
    BEMÆRK: PDMS er et porøst materiale, der gør det muligt for gas at passere over harpiksen39. Pdms porøse struktur fører til en absorption af vandmolekyler fra omgivelserne, indtil de når en ligevægt. Denne forbehandling fylder porerne i PDMS med vanddamp og kan i væsentlig grad undertrykke fordampningen af vandige dråber ved siden af kanten af PDMS-kanalen.
  2. Tag scotch tape fra PDMS harpiks. Anbring PDMS-kanalen på mikrokammerarrayområdet i underlaget (Figur 2H).
    BEMÆRK: PDMS-harpiksen klæber vendt til CYTOP-overfladen. Tryk forsigtigt på PDMS-blokken med en pincet for at fjerne eventuelle luftbobler mellem PDMS-harpiksen og underlaget, hvis der findes en sådan.
  3. Sæt en 200 μL ikke-filtreret pipettespids ind på en (som udløb) af hullerne i PDMS-kanalen.
    BEMÆRK: Adhæsionsstyrken mellem PDMS og CYTOP er begrænset. For at undgå fysisk deformation af PDMS-harpiksen samt løsrivelse af PDMS-kanalen fra overfladen må pipettespidsen ikke indsættes for dybt.

4. Indlæsning af reaktionsopløsning på den samlede anordning

  1. Sæt en aluminium microtube stå på isen. Prechill skylleolien (ASAHIKLIN AE-3000 olie blandet med 0,1 wt % SURFLON S-386 overfladeaktivt stof) i et 1,5 ml mikrorør på aluminiumsstativet.
  2. Læg endnu en aluminiumsblok på is.
  3. Udarbejdelse af en reaktionsløsning til den fælles fiskeripolitik
    1. Forbered CFPS reaktionsløsning i et PCR-rør. Bland hver aliquot komponent i CFPS kit, en fortyndet skabelon DNA (som eksemplificeret heri ved fluorescerende protein mNeonGreen40 og Escherichia coli alkalisk fosfatase41) opløsning, og andre nødvendige komponenter i henhold til de specifikke behov (f.eks.
      BEMÆRK: Den skabelon DNA, der anvendes til cfps, skal udarbejdes i overensstemmelse med instruktionen i det tilsvarende CFPS-sæt. Denne demonstration anvendte et T7-baseret udtrykssystem42. Da reagensforbruget i FemDA-enheden er ret lille, er 10 μL stort nok til at fylde hele PDMS-kanalen.
    2. For mNeonGreen fluorescerende proteinsyntese blandes komponenterne i følgende rækkefølge: tilsættes 2,7 μL nukleasefri H2O til en 6 μL aliquot opløsning A (fra CFPS-kittet); der tilsættes 0,3 μL RNase-hæmmer der tilsættes 1,5 μL fortyndet skabelon-DNA-opløsning blandingen til en opløsning B på 4,5 μL (fra CFPS-sættet).
      BEMÆRK: Det samlede volumen er 15 μL. Da mængden af hver aliquot er proportional med den endelige blandings samlede volumen, kan et samlet volumen på under 10 μL resultere i et alt for lille volumen (< 0,2 μL) af visse komponent aliquot.
    3. For alkalisk fosfatasesyntese blandes komponenterne i følgende rækkefølge: tilsættes 1,2 μL H2O til 6 μL opløsning A; der tilsættes 0,3 μL RNase-hæmmer der tilsættes 0,6 μL disulfidbindingsforstærker 1 og 2 (fra et sæt) der tilsættes 0,3 μL 5 mM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyyyphosphat (DiFMUP) der tilsættes 1,5 μL DNA-opløsning blandes og overføres til 4,5 μL opløsning B.
      BEMÆRK: I analysen af alkalisk fosfatase kan det fluorogene substrat DiFMUP producere stærkt fluorescerende 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) ved enzymatisk spaltning af terminalphosphatgruppen.
  4. Der udarbejdes 10 μL af blandingen ved hjælp af en 200 μL ikke-filtreret pipettespids. Sæt pipettespidsen ind i indløbshullet (se trin 3.3) i PDMS-kanalen. Tryk stemplet ned for at indsprøjte opløsningen på kanalen, indtil den løber over udgangen (hvor der allerede er indsat en anden pipettespids i trin 3.3).
  5. Adskil pipetten fra pipettespidsen, og hold disse to pipettespidser stadig indsat i indløbet og udløbet.
    BEMÆRK: Undgå at generere luftbobler under pipetteringen. Lad ikke tommelfingeren forlade stemplet, før pipetten adskilles fra pipetten for at forhindre tilbageløb af opløsningen inde i PDMS-kanalen.

5. Generering femtoliter dråbe array (FemDA) for CFPS

  1. Hele sættet af den samlede anordning overføres til den forkølede aluminiumsblok (se trin 4.2). Bekræft omhyggeligt, at mikrokammerarrayområdet hurtigt skifter fra gennemskinnelig (Figur 2I) til gennemsigtigt (Figur 2J).
    BEMÆRK: Den fælles fiskeripolitiks reaktionsløsning kan ikke direkte indgå i mikrokammeret. Opløseligheden af luft i vand er omvendt proportional med temperaturen. Den fangne luft opløses i opløsningen, efter at enheden er flyttet fra RT til lav temperatur. Gennemsigtighedsændringen er en praktisk visuel indikator til at vurdere, om løsningen kommer ind i mikrokammeret.
  2. 30 μL af den forkølede skylleolie (se trin 4.1) trækkes straks ind i den indsugningsindsatte pipettespids fra den øverste åbning. Skylleolien bevæger sig ind i kanalen og ekstruderer den overskydende reaktionsopløsning, der er placeret uden for mikrokammeret. Hvert mikrokammer isoleres af skylleolien.
    BEMÆRK: Den bevægelige grænseflade mellem reaktionsopløsningen og skylleolien er synlig, hvilket hjælper folk med at observere væskens bevægelse inde i kanalen. Den ekstruderede opløsning kan opsamles i det foregående rør, opbevares ved 4 °C og genbruges til en anden FemDA-enhed eller en parallel bulkreaktion (i mikrorøret eller en mikrotiterplade).
  3. Forudtræk 30 μL tætningsolie (Fomblin Y25) til en 200 μL filtreret pipettespids. Hæng pipetten oprejst et sted.
  4. Fjern samtidig de to indsatte pipettespidser (se trin 3.3 og 4.4) fra enheden. Flyt straks enheden fra aluminiumsblokken til parafilm.
    BEMÆRK: Brug en pincet til at fastgøre (men holde dig væk fra kanalområdet) enheden på aluminiumsblokken i den periode, hvor pipettespidserne fjernes.
  5. Sæt straks den klar pipettespids, der indeholder tætningsolien (se trin 5.3), ind i pcmkanalens indløb, og indsprøjt olien i kanalen, indtil den løber over udgangen.
    BEMÆRK: Udfør dette trin, så snart du flytter enheden til RT. For at undgå tilbageløb inde i kanalen må du ikke lade tommelfingeren stå fra stemplet, før tætningsolien løber over udgangen. Skylleolien fordamper umiddelbart efter flytning ud af kanalens udløb, mens følgende tætningsolie ophobes i stikkontakten på grund af dens ekstremt lave fordampningstab.
  6. Sæn pipetten fra pipettespidsen, og fjern derefter pipettespidsen fra enheden. Rengør PDMS-overfladen med et stykke af den rene visker, og påfør derefter en ny dråbe tætningsolie på henholdsvis indløb og udløb. Femtoliterdråberne forsegles i individuelle mikrokammer af olien.
    BEMÆRK: Brug en pincet til at fastgøre (men holdes væk fra kanalområdet) PDMS-kanalen på underlaget i den periode, hvor mikropipettespidsen fjernes.
  7. Tør fugten op på dækglassets nedre overflade. Den as-forberedt FemDA enhed er nu klar til inkubation og mikroskopi billeddannelse.

6. Billeddannelse af mikroskopi

  1. Start et omvendt fluorescensmikroskop. Vent på stabilisering (køling) af kameraet. Brug en 60x eller 100x olie nedsænkning objektiv. Indstil FemDA-enheden på det motoriserede stadie. Indstil billedparametrene.
    BEMÆRK: Billedparametrene omfatter filstien, billedkanaler, filtre, eksponeringstider (generelt er 100 ms nok; kortere eller længere tid er også mulig i henhold til kameraets specifikation) og lysintensitet.
  2. Find fokalplanet. Juster z-akse positionen af målet linse og fastsætte brændplanet ved hjælp af en intern autofokus system. Angiv det interesseområde (ROI, dvs. x, y-akse), der skal afbildes.
    BEMÆRK: De store mikroskop producenter (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) alle giver mulighed for at integrere autofokus system med mikroskop. Dette autofokussystem er nødvendigt for at holde brændplanet konstant under den automatiske billeddannelse i flere områder. De ropi'er dækker FemDA-området i PDMS-kanalen.
  3. Optag fluorescensbillederne. Optag en enkelt ramme med et defokuseret BF-billede (Bright-Field) for hver ROI. Du må IKKE ændre rækkefølgen og koordinaterne for ROI'erne, når de forskellige kanaler afscannes.

7. Analyse af billeddata

BEMÆRK: Analysere billeddata ved hjælp af en hjemmelavet plugin (med navnet "FemDA") baseret på Fiji (http://fiji.sc) for at udtrække fluorescens intensitet af hver dråbe43. Installer den korrekte version af Fiji i henhold til operativsystemet. Fiji understøtter de fleste billedfilformater (f.eks. nd2-filen fra Nikon-mikroskop, czi-fil fra Zeiss mikroskop) ved hjælp af et indbygget plugin "Bio-Formater".

  1. Installation af plugin
    1. Kopier og indsæt plugin-filen (som er tilgængelig ved forespørgsel til den tilsvarende forfatter eller via følgende institutionelle link: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) i Fijis "plugins" mappe.
    2. Start Fiji-softwaren. plugin "FemDA" kan findes i drop-down menuen "Plugins" i Fiji.
  2. Forbehandling af billeddata
    1. Åbn det defokuserede BF-billede (se trin 6.3). Klik på Proces | Træk baggrund fra... for at fjerne jævne kontinuerlige baggrunde i hver ramme i billeddataene (Figur 4B). Klik på Proces | Filtre | Median for at reducere støjen fra hver ramme af billeddataene (Figur 4C).
    2. Klik på Billede | Juster | Tærskel for at kontrollere og adskille forgrunden (med angivelse af mikrokammerene) fra baggrunden (der angiver området uden for mikrokammerene) for hver ramme af billeddataene (forstørrede skær i figur 4A-C).
      BEMÆRK: Vælg en korrekt algoritme på Threshold rullelisten i tærskelvinduet, så kun mikrokammerområderne samt kanterne af hvert mikrokammer kan identificeres og fremhæves som forgrundsviden. Især skal de fleste af de fremhævede kanter være kontinuerlige uden mellemrum.
  3. Bestemmelse af dråbekoordinat
    1. Klik plugins | FemDA | FemDA Analyse for at åbne den grafiske brugergrænseflade (GUI) af den tilpassede plugin (øverste halvdel af Figur 4D).
    2. Indtast det omtrentlige minimum og maksimum antal pixels i et enkelt mikrokammer. Input den forventede minimum og maksimal cirkularitet (0: vilkårlig form; 1: perfekt cirkel) af mikrokammerene. Input til rammenummeret på startrammen og slutrammen.
    3. Klik på Generer investeringsafkast på GUI for at registrere alle mikrokammer, og de fundne rodi'er, der blev registreret, vises i et popup-vindue ROITable.
    4. Gå tilbage til vinduet FemDA Analyse og klik på knappen Anvend ROI maske for at kontrollere, om mikrokammer over rammerne blev korrekt opdaget (nederst til venstre i figur 4D). Hvis nej, skal du ændre nogle af dem og gentage klikke på Generer investeringsafkast og Anvend INVESTERINGSAFKAST-maske. Hvis ja, gå til næste trin.
      BEMÆRK: Der kan være meget få mikrokammer, der ikke kan identificeres som investeringsafkastet (se den nederste halvdel af figur 4D)af en algoritme af tærsklen på grund af den utilstrækkelige kontrast mellem forgrunden og baggrunden. Det er ikke problematisk i det statistiske synspunkt.
  4. Udvinding af fluorescensintensitet
    1. Åbn fluorescensbilledet, og bring det forrest. Klik på Anvend ROI-maske igen for at anvende de bestemte ROI'er på fluorescensbilledet (nederst til højre på Figur 4D).
    2. Vælg enten One-Shot til analyse af et slutpunktsbillede (som eksemplificeret ved mNeonGreen-dataene) eller Time-Lapse til analyse af tidsforløbsdata (som eksemplificeret ved alkaliske fosfatasedata).
    3. Input 100 i boksen Antallet af øverste pixel betyder, at kun de øverste 100 pixel af hvert investeringsafkast vil blive brugt til at beregne gennemsnitsintensiteten for den tilsvarende dråbe. Hvis input 0 i antallet af øverste pixel, vil alle pixels i hvert investeringsafkast blive brugt til at beregne den gennemsnitlige intensitet af den tilsvarende dråbe.
      BEMÆRK: Der kan være en afdrift på flere pixels mellem BF og fluorescens billeder, hvilket betyder, at nogle pixels i ROI'erne kan tilhøre baggrunden af fluorescensbilledet. Derfor plugin giver en mulighed for at angive antallet af top intensitet-rangerede pixels til beregning af den gennemsnitlige intensitet af hver dråbe.
    4. Til analyse af slutpunktsbilledet (dvs. One-Shot ved trin 7.4.2) skal du klikke på knappen Mål intensitet for at beregne middelintensiteten for alle fundne dråber. ROITable opdateres med de nye data fra fluorescensbilledet. I mellemtiden vises et histogram i et nyt popup-vindue Histogram (Figur 4E).
      BEMÆRK: Hvis du ændrer placeringsstørrelsen i feltet Placeringsnummer, kan visningen af histogrammet optimeres. En tilpasning til en sum af Gaussiske distributioner kan opnås i den udviklede GUI. Popup Log-vinduet i Fiji viser tilpasningsresultaterne. Alternativt kan du eksportere dataene ved at klikke på knappen gem som tekst og udføre forskellige statistiske analyser med anden software ( Figur4F, G).
    5. Til analyse af tidsforløbsbilledet (dvs. valg af time-lapse på trin 7.4.2) er pop op-vinduet Intensitetstidskursus i stedet for Histogram, som indeholder et histogram svarende til et bestemt tidspunkt og et tidsintensitetsplot (Figur 5). Tekstdataene kan også eksporteres ved hjælp af menuen Filer i pop op-vinduet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikrofabrikationsprocessen består af substratrengøring, overfladefunktionalisering, CYTOP-belægning, fotolitografi, tøræt ætsning, fotoresistens stripning og slutrengøring. Det er vigtigt, at den fremlagte protokol tillod fuldstændig fjernelse af den hydrofobe CYTOP polymer inde i mikrokammeret Figur 3A),der producerer en meget parallel hydrofil-i-hydrofob struktur på et standarddækselglas substrat. Ved hjælp af olieforseglingsprotokollen blev den ensartede dimension af de resulterende dråber verificeret ved at indkapsle fluorescerende opløsning i mikrokammerene (figur 3B). Fluorescensintensiteten, der udvindes ved hjælp af den udviklede software, er en god indikator for dråbestørrelsen. Cv'et for fluorescensintensiteten, 3%, afspejlede den smalle fordeling af dråbestørrelsen over hele arrayet (Figur 3C). Det rekonstruerede 3D-billede fra konfokal mikroskopi viste også den ensartede dråbevolumen over tid (Figur 3D, Supplerende film 1)44. Til sammenligning genererede en meget udbredt FC-40 olie dråberne udviser en flere gange forskel i fluorescens intensitet45. De dannede dråber i FemDA var stabile ved RT i mindst 24 timer (Figur 3E). Den høje kvalitet af dråberne i sidste ende dannede grundlag for kvantitative målinger.

Data med højt gennemløb kræver dataanalyseværktøjer med høj overførselshastighed46,47. Den udviklede plugin stærkt forenklet og fremskyndet billeddata analyse. På grundlag af teorien om behandling af digitale billeder48kan det defokuserede BF-billede binariseres og bruges til at give koordinatoplysninger for hver dråbe efter baggrundskorrektion og støjreduktion (Figur 4A-C). Denne idé gjorde den præcise lokalisering af mørke dråber muligt.

Fluorescerende protein mNeonGreen blev syntetiseret i FemDA. Skabelon DNA med en koncentration på 0,05 molekyler pr dråbe blev tilfældigt fordelt i hver dråbe til at indlede proteinsyntesen med koblet cellefri transskription og oversættelse reaktioner. Da det gennemsnitlige antal DNA-molekyler pr. dråbe var mindre end 1, indeholdt nogle dråber nul skabelon-DNA, mens andre indeholdt et eller flere DNA-molekyler. Efter 6 timers inkubation på RT blev slutpunktsbilledet taget ved hjælp af mikroskopet. Stakken billede data blev analyseret af den udviklede software ved hjælp af den samtidige defokuserede BF billede (Figur 4A-E). Fluorescensintensiteten for hver dråbe er et mål for proteinudbyttet i den tilsvarende dråbe. Histogrammet af fluorescensintensiteten viste en diskret fordeling og var godt udstyret med en sum af gaussiske fordelinger med lige spidsbelastningsintervaller (figur 4F), hvilket kraftigt tydede på en belægning af forskellige antal DNA-molekyler pr. dråbe. I lighed med det gentagne mønt-flipping spil, er antallet af uafhængige tilfældige begivenheder, der opstår matematisk beskrevet af Poisson distribution. Sandsynligheden for forekomst af dråber indeholdende forskellige tal (op til 3 i dette eksempel) af DNA-molekyler var en perfekt pasform til en Poisson fordeling (P = e• λk / k!, hvor λ er det forventede gennemsnitlige antal DNA-molekyler pr. dråbe, og k er det faktiske antal DNA-molekyler i en dråbe) med et gennemsnit på 0,05 DNA-molekyler pr. dråbe (Figur 4G)31som forventet for en tilfældig fordeling af DNA-molekyler. Da belastningskoncentrationen af skabelon-DNA-opløsningen var den samme som den endelige montering λ (dvs. 0,05), var den fælles fiskeripolitiks reaktionseffektivitet i vores FemDA 100% (eller næsten 100%). Med andre ord er et enkelt DNA-molekyle nok til at udløse den fælles fiskeripolitiks reaktion i femtoliterdråben effektivt.

Den fælles fiskeripolitiks reaktion af alkalisk fosfatase blev registreret hvert femte minut. Den udviklede software understøtter også analyse af tidsforløbsdata (Figur 5). Den koblede fluorogene reaktion viste en lignende diskret fordeling af dråbernes fluorescensintensitet ved tidligere tidspunkter. Histogrammet resultater også verificeret en belægning af forskellige antal DNA-molekyler i dråben. Fluorescensintensiteten konvergerede til sidst til en værdi sammen med den gradvise udtynding af fluorogene substrat DiFMUP.

Figure 1
Figur 1: Mikrofabrikation proces af ultrahøj-density mikrokammer array substrat. (A) Teknisk tegning af den tilpassede vakuumpatron. Enhed: mm. (B) CYTOP filmtykkelse vs. centrifugeringshastighedsdata. cC) Spin-coating af perfluoropolymer CYTOP på et silaniseret glasunderlag. Fotografierne viste et godt eksempel på homogen belægning og et dårligt eksempel på inhomogen belægning, henholdsvis. Den sorte pil angav den specifikke position af den inhomogene CYTOP-film. (D) Spin-belægning af fotoresistens på cytop-belagt substrat. Efter spin-belægningen skal fotoresisten i nærheden af substratets kant fjernes ved hjælp af en ethanol-gennemblødt ren visker (midterste fotografi). Fotografierne viste et godt eksempel på homogen belægning og et dårligt eksempel på inhomogen belægning, henholdsvis. Den hvide pil angav den specifikke position af den uforidede fotoresistskende film. (E) Eksponering af den belagte fotoresist ved hjælp af en maske aligner. (F) Udvikling af udsatte fotoresist i en udvikler. Den eksponerede del af fotoresisten er opløselig i udviklerløsningen. (G) Reaktiv-ion ætsning af CYTOP. Den udækkede CYTOP blev fjernet af O2 plasma. (H) Fjernelse af den fotoresisten maske. Den fotoresisten blev fjernet af acetone. Underlaget blev renset ved hjælp af 2-propanol og H2O. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse og brug af mikrokammerarrayenheden. (A) Afvejning af skurremidlet og prepolymer af PDMS. (B) Hælde den blandede og deaerated blandingen i en tape-mønstret petriskål. Der var nogle nygenererede luftbobler i polymerblandingen. (C) Deaerating blandingen igen i et vakuumkammer. Luftboblerne steg og brast på den øverste overflade. (D) Deaerated og hærdet PDMS harpiks. (E) Afskalning af den hærdede PDMS elastomer fra petriskålen. (F) Afskæring hvert stykke PDMS kanal blokke ved hjælp af en flad-kabel cutter. (G) Stansning huller i hver ende af PDMS kanal ved hjælp af en biopsi punch. (H) Den samlede enhed. PDMS-harpiksen kan holde sig til CYTOP-overfladen. (I) Gennemskinnelige mikrokammerarrayområde inde i PDMS-kanalen fyldt med den vandige opløsning før nedkøling. (J) Gennemsigtigt mikrokammerarrayområde inde i PDMS-kanalen efter nedkøling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Ultrakonsensaerede og ultrastabile femtoliterdråber. (A) 3D laserscanning konfokal mikroskopi billeddannelse for det fabrikerede substrat. De cylindriske mikrokammer i eksempelbilledet viste en højde på 3 μm og en diameter på 4 μm. (B)Ensartede femtoliterdråber over et stort område af planærarrayet. Kun et delvist område af hele matrixen blev vist heri. En fluorescerende opløsning (10 μM ATTO-514) blev forseglet i hver dråbe. (C) Størrelsen fordeling af dråberne over en hel enkelt array. Fluorescensintensiteten blev anvendt som indikator for dråbestørrelsen. CV'et var kun 3%. (D) Volumetrisk måling ved hjælp af konfokale z-stack time-course data. Mængden af dråber over array blev givet af mikroskop software (NIS-Elements, Nikon). (E) Fluorescens opsving efter fotobleaching. Efter den første ramme, flere dråber blev helt fotobleached ved hjælp af en begrænset laserstråle af en konfokal mikroskop. Deres fluorescensintensitet blev registreret i 24 timer, og der blev ikke observeret nogen fluorescensgenvinding (rød linje). Fluorescensintensiteten for andre dråber, der ikke er fotoblege, i samme synsfelt, blev registreret i den sorte linje. Fejllinjer (gennemsigtige farver) var 1 SD for hvert klokkeslæt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Analyseprocedure for slutpunktsmikroskopiske billeddata. Det defokuserede bright-field billede blev brugt til at udtrække koordinaten for hver mikrokammer / dråber. Baseret på intensitetsforskellen mellem kanten af mikrokammer (som forgrund) og andre områder (som baggrund) kan den kontinuerlige og næsten cirkulære kant udtrækkes fra baggrunden. På grund af den ujævne baggrundsfordeling på tværs af synsfeltet (A) kræves der generelt en del forbehandling af billeder for at forbedre kvaliteten af binarizing-outputtet. Efter at have fratrukket baggrund (B) blev baggrunden for hver ramme uniformeret. Empirisk var inputværdien i "Rullende kugleradius" (trin 1) 20-50 for 2048 pixel × 2048 pixel billeder og 10-20 for 512 pixel × 512 pixel billeder. Jo større værdien er, jo kortere er behandlingstiden. Hvis du vil reducere støjen i det baggrundstrækkede billede, skal du anvende et medianfilter på billedet (C). Generelt var inputværdien i Radius (trin 3) 1-2 pixel. Som vist i den forstørrede indsats, kan baggrunden-fratrukket og filtreret billede være pænt binarized ved hjælp af indbygget tærskel plugin, således at forgrunden svarer til kanterne samt området for interesser (ROIs) kan genkendes nøjagtigt. RoIs afsløring for alle rammer af billedet blev udført ved hjælp af den installerede hjemmelavede plugin FemDA Analyse (D). Pixelstørrelsen (trin 5 og 6) og cirkularitet (trin 7 og 8) af ROI'er, de rammer, vi ønsker at indsætte i beregningen (trin 9 og 10), blev manuelt defineret i henhold til de faktiske data. Efter at have klikket på Generer investeringsafkast (trin 11) og venter, blev koordineringen af hvert investeringsafkast på tværs af inputrammerne bestemt. Når du har klikket på rød investeringsafkastmasken (trin 12), blev alle fundne investeringsafkast omsluttet og fremhævet af en gul linje. Efter åbning af fluorescensbilledet og klikket på Afgræns ROI-masken igen blev den bestemte ROI-maske anvendt på fluorescensbilledet. Antallet af toppixel (trin 14) angav antallet af topintensitetsrangerede pixel for hvert investeringsafkast til beregning af gennemsnitsintensiteten for de respektive dråber. Efter at have klikket på målintensitet (trin 15) og ventetid blev histogrammet genereret (E). Histogrammet kan udstyres med en sum gaussiske fordelinger ved hjælp af de parametre, der er tilgængelige i histogrammet. Alternativt kan gennemsnitsintensitetsdataene eksporteres til en tekstfil (trin 16) og analyseres af anden software (F). (G) Sandsynligheden for forekomst af dråber, der indeholder forskellige antal DNA-molekyler i den givne matrix. Histogrammet (grå farve) var pænt monteret af en Poisson fordeling (rød stiplet linje) med et gennemsnit på 0,05 DNA-molekyler pr dråbe, som forventet for en tilfældig fordeling af DNA-molekyler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Analyse af tidsforløbsmikroskopiske billeddata. De fundne ROI'er (efter trin 1-12 i figur 4) blev anvendt direkte på tidsforløbsdataene. I trin 13 i figur 4skal du vælge Time-lapse og indtaste det faktiske tidsinterval (i minutter) mellem tilstødende rammer i tidsinterval [min]. Efter at have klikket på målintensitet (trin 15 i figur 4) og ventetid blev tidsintensitetsafbildningen og histogrammet (det samme som figur 4E) genereret. Hist-positionen angav tidspunktet for histogrammet, som blev vist som en lodret rød linje. Plugin'et understøtter også angivelse af farver for hver sporingslinje. Gul: 0 DNA; blå var 1 DNA; rød: 2 DNA; sort: 3 DNA. Tidsforløbsdataene kan også eksporteres til en tekstfil. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Film 1. Klik her for at downloade denne film. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den meget kvantitative måling baseret på de meget ensartede, stabile og biokompatible dråber i FemDA gjorde det muligt for diskret distribution, det unikke ved vores undersøgelse adskiller sig fra andre. Vi optimerede og detaljeret mikrofabrikations- og dråbedannelsesprocesserne i dette dokument. Der er flere kritiske trin i den etablerede protokol.

For det første bestemmer den ensartede belægning af meget tyktflydende CYTOP polymer på det rektangulære tynde glassubstrat i høj grad kvaliteten af det resulterende substrat. I betragtning af den generelt korte arbejdsafstand af objektivet med høje forstørrelser (se trin 6.1) skal det tynde dækglas anvendes. En høj kvalitet spin-belægning på en tynd og fleksibel substrat er generelt vanskelig. Vi har endnu ikke testet alle mulige designs, men har konstateret, at multi-hullers vakuum chuck med samme rektangulære dimension fungerede godt for spin-belægning. Det er vigtigt at tabe CYTOP-polymeren i midten af dækglassubstratet og straks starte centrifugeringsbelægningen (se trin 1.3.2). Sværhedsgraden er mindre relateret til formen af substratet, men viskositeten af polymeren. CYTOP-produktlinjen tilbyder flere forskellige koncentrationer af den kommercielt tilgængelige pakke. Det medfølgende fortyndingsmiddel i emballagen kan også bruges til at fortynde det oprindelige produkt til en lavere viskositet, hvis det er nødvendigt. CYTOP 816, som vi brugte i forsøget, er det kommercielle produkt med den højeste koncentration, der kan opløse polymeren i opløsningsmidlet. Den tykkere belægning kræver lavere centrifugeringshastighed eller flere runder belægning og hærdning. Et plot af karakteristisk tykkelse vs spin hastighed kurve anbefales stærkt, når du bruger en ny spin coater i et nyt miljø.

For det andet er den passende fugtighed i renrummet afgørende for ideel fotolitografi samt fuldstændig fjernelse af fotoresisten på den angivne position. Den fotokemiske reaktion i fotolitografi bruger H2O som en af de reaktanter. Softbake ved den temperatur, der er højere end kogepunktet på H2O, fjerner dog H2O-indholdet fra den overtrukne fotoresistens. Den "tørrede" fotoresisten skal tage sig tid til at absorbere H2O igen fra luften (se trin 1.4.6). Dette punkt er ofte overset. I betragtning af at mange laboratorier kun kan have nogle forenklede renrum faciliteter uden fugtighed kontrol, ville luftfugtigheden svinge dramatisk i løbet af sæsonen eller blive påvirket af vejret. En billig løsning er at bruge en brugsfugter eller affugter i renrummet. Det fuldt eksponerede CYTOP-lag efter udvikling kan fjernes selektivt og helt af RIE, hvilket fuldstændig udsætter glasbunden. Til sidst, den hybride struktur af den hydrofile glas bund og hydrofobe CYTOP sidevæg er vigtigt for stabilt fældefangst vandig opløsning til femtoliter rummet.

For det tredje viste de nyfundne olier (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) og overfladeaktivt stof (SURFLON S-386) hidtil uset forsegling ydeevne for fluoropolreaktoren13. Injektionen af skylleolien skal foretages på den kølede flade metalblok (se trin 5.2). Ellers kan dråber i nærheden af kanalens indløb ikke dannes. Injektionen af den anden tætningsolie kan udføres ved RT (se trin 5.5). Disse olier og overfladeaktive stoffer har aldrig været brugt i biologisk forskning før. Der er ikke fundet bedre alternativer for nu. For at udvide arsenalet af den nyttige kombination af olier og overfladeaktive stoffer til dråbeforberedelse, er det nye medlem af olierne (eller lignende i samme produktlinje) og det overfladeaktive stof (eller lignende i samme produktlinje) værdig til at forsøge at blive anvendt i mikrofluidiske dråbesystemer.

Her er yderligere to punkter at bemærke. Den ene er, at der er en tidsforskydning blandt ROI'er under mikroskopibilledet. Den samlede billedbehandlingstid for en cyklus afhænger hovedsageligt af arraystørrelsen og forstørrelsen af objektivets objektiv. Eksponeringstiden, lukkertiden og den motoriserede fases bevægelseshastighed er også mindre faktorer. Som en tommelfingerregel, ville billeddannelse 106 dråber ved 60 × forstørrelse mindst kræve 10-20 minutter. Denne uundgåelige tidsforskydning indfører nogle fejl i dataanalyse, som altid bør tages i betragtning. Den anden er, at det samlede antal dråber på et enkelt substrat ikke ville overstige 108-109,selv øge tætheden af dråberne eller reducere den individuelle størrelse af dråben. Dette skyldes, at størrelsen af glasset substrat, der kan håndteres af masken aligner (for 4-tommer vafler) er begrænset. Yderligere at øge størrelsen af dækglasset er ikke anbefalelsesværdig, fordi et stort, tyndt og skrøbeligt glas substrat er svært at håndtere.

FemDA kan betragtes som en super miniaturiseret mikrotiter plade. Alle biokemiske reaktioner, der er blevet udført i 96-brønd mikrotiter plader kunne forsøgte at udføre ved hjælp af FemDA. Det kan helt sikkert bruges til enzym aktivitet måling uden kompliceret protein rensning. Det kunne også være kompatibelt med digital polymerase kædereaktion (digital PCR) og digital enzym-forbundet immunosorbent analyse (digital ELISA)31,49. Den lille volumen, store array, og høj stabilitet ville bringe nogle fordele i forhold til eksisterende digitale bioassay metoder. FemDA-systemet, der er i stand til at løse forskellige antal skabelon-DNA-molekyler i femtoliterdråber, har allerede vist kraften i nøjagtig proteinscreening13. FemDA er et nyt in vitro-opdelingssystem, der kan udvikle en række enzymer hurtigt. Med de fremskridt inden for bioinformatik og bibliotek byggeteknikker, æra af en hurtig on-demand skabelse af højtydende proteiner vil helt sikkert komme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI tilskud nummer JP18K14260 og budgettet for Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology. Vi takker Shigeru Deguchi (JAMSTEC) og Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) for at levere karakteriseringsfaciliteterne. Vi takker Ken Takai (JAMSTEC) for kommerciel softwaresupport. Den mikrofabrikation blev gennemført på Takeda Sentanchi Supercleanroom, University of Tokyo, støttet af "Nanotechnology Platform Program" af Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (MEXT), Japan, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81, (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12, (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17, (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24, (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46, (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9, (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8, (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10, (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5, (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18, (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10, (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28, (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21, (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16, (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303, (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150, (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8, (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24, (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57, (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8, (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16, (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81, (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55, (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89, (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8, (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9, (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12, (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12, (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5, (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79, (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4, (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7, (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. Pearson. New York, NY. (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10, (1), 345-363 (2017).
En Femtoliter dråbe array for massivt parallel proteinsyntese fra single DNA molekyler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).More

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter