Summary

Ein Femtoliter Droplet Array für massive parallele Proteinsynthese aus einzelnen DNA-Molekülen

Published: June 20, 2020
doi:

Summary

Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, über eine Million geordnete, einheitliche, stabile und biokompatible Femtolitertröpfchen auf einem 1 cm2 planaren Substrat herzustellen, das für die zellfreie Proteinsynthese verwendet werden kann.

Abstract

Fortschritte bei der räumlichen Auflösung und Detektionsempfindlichkeit wissenschaftlicher Instrumente ermöglichen die Anwendung kleiner Reaktoren für die biologische und chemische Forschung. Um der Nachfrage nach Hochleistungs-Mikroreaktoren gerecht zu werden, haben wir ein Femtoliter-Tröpfchen-Array (FemDA)-Gerät entwickelt und seine Anwendung in massiv parallelen zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) veranschaulicht. Über eine Million gleichmäßige Tröpfchen wurden mit einem zweistufigen Ölabdichtungsprotokoll problemlos in einem fingergroßen Bereich erzeugt. Jedes Tröpfchen wurde in einer Femtoliter-Mikrokammer verankert, die aus einem hydrophilen Boden und einer hydrophoben Seitenwand besteht. Die hybride hydrophil-in-hydrophobe Struktur und die speziellen Dichtöle und Tenside sind entscheidend, um die femtoliter wässrige Lösung im Femtoliter-Raum ohne Verdunstungsverlust stabil zu halten. Die Femtoliter-Konfiguration und die einfache Struktur des FemDA-Geräts ermöglichten einen minimalen Reagenzverbrauch. Die einheitliche Dimension der Tröpfchenreaktoren machte großflächige quantitative und Zeitverlaufsmessungen überzeugend und zuverlässig. Die FemDA-Technologie korrelierte den Proteinertrag der CFPS-Reaktion mit der Anzahl der DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen. Wir rationalisierten die Verfahren über die Mikrofertigung des Geräts, die Bildung der Femtolitertröpfchen und die Erfassung und Analyse der mikroskopischen Bilddaten. Das detaillierte Protokoll mit den optimiertniedrigen Betriebskosten macht die FemDA-Technologie für jeden zugänglich, der über Standard-Reinraumeinrichtungen und ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop an seinem eigenen Platz verfügt.

Introduction

Die Forscher verwenden Reaktoren, um biochemische Reaktionen durchzuführen. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Größe des Reaktors zu verringern und den experimentellen Durchsatz zu erhöhen, um den Reagenzienverbrauch zu senken und gleichzeitig die Arbeitseffizienz zu verbessern. Beide Aspekte zielen darauf ab, Forscher von einer hohen Arbeitsbelastung zu befreien, die Kosten zu senken und Forschung und Entwicklung zu beschleunigen. Wir haben eine klare historische Roadmap über die Entwicklung der Reaktortechnologien aus der Sicht der Reaktionsvolumina und des Durchsatzes: Einzelbecher/Kolben/Teströhren, Milliliter-Röhren, Mikroliter-Röhren, Mikroliter 8-Röhren-Streifen, Mikroliter 96/384/1536-Well-Platte und mikrofluidische Nanoliter/Picoliter/Femtoliter-Reaktoren1,2,3,4,5,6,,7. Analog zur Verkleinerung der Funktionsgröße von Transistoren auf integrierten Schaltungschips in der Halbleiterindustrie in den letzten Jahrzehnten durchlaufen bio-chemische Mikroreaktoren Volumenreduktion und Systemintegration. Solche kleinen Werkzeuge haben einen tiefgreifenden Einfluss auf die zellbasierte oder zellfreie synthetische Biologie, Biomanufacturing und High-Throughput-Prototyping und Screening8,9,10,11,12. Dieses Papier beschreibt unsere jüngsten Bemühungen um die Entwicklung einer einzigartigen Tröpfchen-Array-Technologie und demonstriert ihre Anwendung in CFPS13, einer grundlegenden Technologie für synthetische Biologie und molekulare Screening-Gemeinschaften14. Insbesondere stellen wir bewusst ein optimiertes und kostengünstiges Protokoll bereit, um das FemDA-Gerät für jedermann zugänglich zu machen. Das kostengünstige und einfach zu handhabende Protokoll für das miniaturisierte Gerät würde zu den Bildungszwecken der Universitäten beitragen und zur Verbreitung der Technologie beitragen.

FemDA bereitet Femtolitertröpfchen mit einer ultrahohen Dichte von 106 pro 1 cm2 auf einem planaren Glassubstrat vor. Wir beschichteten ein hydrophobes Polymer, CYTOP15, auf dem Glassubstrat und selektiv geätzt (entfernt) CYTOP an vordefinierten Positionen, um ein Mikrokammer-Array auf dem Substrat zu erzeugen. So besteht die resultierende Mikrokammer aus einer hydrophoben Seitenwand (CYTOP) und einem hydrophilen Boden (Glas). Wenn wasser und öl nacheinander über die gemusterte Oberfläche fließen, kann das Wasser eingefangen und in die Mikrokammern versiegelt werden. Die hydrophil-in-hydrophobe Struktur ist entscheidend für die Abstoßung von Wasser außerhalb der Mikrokammern, die Isolierung einzelner Mikroreaktoren und die Beibehaltung einer winzigen wässrigen Lösung im Femtoliterraum. Die einzigartige Eigenschaft wurde erfolgreich für die Herstellung von Wasser-in-Öl-Tröpfchen und Lipid-Doppelschicht-Mikrokompartimenten16,17angewendet. Im Vergleich zum Prototypgerät16haben wir zunächst den Mikrofertigungsprozess optimiert, um eine vollständige Entfernung des CYTOP-Polymers sowie eine vollständige Belichtung des Glasbodens zu realisieren. CYTOP ist ein spezielles Fluorpolymer mit extrem niedriger Oberflächenspannung (19 mN/m) niedriger als herkömmliche Mikroreaktormaterialien wie Glas, Kunststoffe und Silikon. Seine gute optische, elektrische und chemische Leistung wurden bereits in der Oberflächenbehandlung von mikrofluidischen Geräten18,19,20,21,22,23,24eingesetzt. Im FemDA-System muss die Oberflächenspannung des Öls niedriger sein als die der festen Oberfläche25. Andernfalls neigt das flüssige Öl, das mit der festen Oberfläche in Berührung kommt, dazu, kugelförmig zu werden, anstatt sich über die Oberfläche auszubreiten. Außerdem fanden wir heraus, dass einige beliebte Perfluorkohlenstofföle (z. B. 3M FC-40)16 und Fluorentöle (z. B. 3M Novec-Serie) CYTOP als Folge der amorphen Morphologie von CYTOP auflösen können, was für die quantitative Messung tödlich ist und in Bezug auf die Kreuzkontamination unter Tröpfchen fragwürdig wäre. Glücklicherweise haben wir ein biokompatibles und umweltfreundliches Öl mit niedrigerer (< 19 mN/m) Oberflächenspannung13identifiziert. Wir fanden auch ein neues Tensid, das sich im ausgewählten Öl auflösen und in geringer Konzentration (0,1%, mindestens 10-mal niedriger als zuvor berichtetbeliebte 26,27)13funktionieren kann. Die resultierende Wasser-Öl-Schnittstelle kann durch das Tensid stabilisiert werden. Aufgrund der hohen Verdunstungsrate des Öls, nach dem Spülen mit dem Öl, haben wir ein weiteres biokompatibles und umweltfreundliches Öl eingesetzt, um das erste zu ersetzen, das die Mikrokammern versiegelt. Wir nennen das erste Öl (ASAHIKLIN AE-3000 mit 0,1 Gew.-SURFLON S-386) das “Flush Oil” und das zweite Öl (Fomblin Y25) das “Dichtungsöl”.

Die zweistufige Ölabdichtungsstrategie kann innerhalb von Minuten und ohne ausgeklügelte Instrumentierung eine robuste Formation des Femtoliter-Tröpfchen-Arrays realisieren. Aufgrund des Verdampfungsproblems wurde es als schwierig angesehen, Mikroreaktoren zu erzeugen, die kleiner als Pikolitervolumen28sind. FemDA befasste sich mit diesem Problem, indem sie die Materialien und Verfahren zur Herstellung von Mikroreaktoren/Tröpfchen systematisch optimierte. Einige bemerkenswerte Merkmale der resultierenden Tröpfchen sind die hohe Gleichmäßigkeit (oder Monodispersität), Stabilität und Biokompatibilität auf der Femtoliter-Skala. Der Variationskoeffizient (CV) des Tröpfchenvolumens beträgt nur 3% (ohne Vignettierungskorrektur für die mikroskopischen Bilder), der kleinste CV unter den Tröpfchenplattformen der Welt, der eine hochparallele und quantitative Messung gewährleistet. Das Femtolitertröpfchen ist mindestens 24 Stunden stabil ohne Kreuzkontamination unter Tröpfchen bei Raumtemperatur, was für eine zuverlässige Zeitverlaufsmessung wertvoll ist. In Bezug auf die Biokompatibilität ist es uns gelungen, verschiedene Proteine aus einer Einzelkopie-Vorlagen-DNA im Femtoliter-Tröpfchen zu synthetisieren, die zuvor als schwierig oder ineffizient galt29,30. Es wäre wert, aufzuklären, warum einige Proteine, die in der FemDA synthetisiert werden können, nicht in anderen Tröpfchensystemen synthetisiert werden können. FemDA war nicht nur eine technische Weiterentwicklung, sondern realisierte auch eine beispiellose quantitative Messung, die den Proteinertrag (wie durch die Fluoreszenzintensität des Tröpfchens reflektiert) mit der Anzahl der Vorlagen-DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen korrelieren kann. Infolgedessen zeigte das Histogramm der Fluoreszenzintensität von Tröpfchen aus FemDA-basiertem CFPS eine diskrete Verteilung, die durch eine Summe von Gaußschen Verteilungen gleicher Peak-to-Peak-Intervalle gut angepasst werden kann. Darüber hinaus passte die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Tröpfchen, die unterschiedliche Dna-Moleküle enthielten, perfekt zu einer Poisson-Verteilung31. So kann der unterschiedliche Proteinertrag in jedem Tröpfchen auf der Grundlage der diskreten Verteilung normalisiert werden. Diese kritische Funktion ermöglicht es uns, die enzymatischen Aktivitätsinformationen von der scheinbaren Intensität zu trennen, die bei anderen Mikroreaktorplattformen noch nicht verfügbar war. Bestehende mikrofluidische Zell-/Tröpfchensortiersysteme sind in der vollautomatischen Sortierung und gut in der Konzentration von Proben ausgebildet, können aber manchmal nur ein relativ breites oder langschwanzes Histogramm im analytischen Aspekt32,33ausgeben. Unser hochquantitatives und biokompatibles FemDA-System setzt neue Maßstäbe und einen hohen analytischen Standard im Bereich der Mikroreaktorentwicklung.

Die Öle und Tenside, die zur Herstellung von Tröpfchen verwendet werden könnten, sind noch sehr begrenzt34. Die Kombination von ASAHIKLIN AE-3000 und SURFLON S-386 mit Sitz in FemDA ist ein neues Mitglied des wachsenden Arsenals der physiochemischen Schnittstelle zwischen wässriger Phase und Ölphase13. Die neue Schnittstelle in FemDA ist physikalisch stabil, chemisch inert und biologisch kompatibel mit der komplexen Transkriptions-, Übersetzungs- und posttranslationalen Modifikationsmaschinerie für viele Arten von Proteinen13. Es wäre ziemlich attraktiv, ein Protein zu finden, das nicht stattdessen in den Tröpfcheneinstellungen synthetisiert werden kann. Außerdem ist die Kostenersparnis von Reagenzien im Femtoliter-Tröpfchensystem deutlicher als bei Nanoliter- und Picoliter-Reaktorsystemen35,36. Insbesondere würde es oft ein großes Totvolumen geben, das hauptsächlich durch Schläuche oder externe Vorräte in mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungssystemen verursacht wird, aber nicht in unserer FemDA. Das Array-Format wird auch durch wiederholte und detaillierte mikroskopische Charakterisierung (ähnlich der sogenannten High-Content-Analyse) für jeden einzelnen Reaktor37begünstigt, anstatt nur durch einen einzigen Schnappschuss für ein schnell bewegliches Objekt. Die Femtoliter-Skala ermöglichte die Integration von über einer Million Reaktoren auf einer fingergroßen Fläche, während die gleiche Anzahl von Nanoliter-Reaktoren (falls vorhanden) eine Fläche von über einer Quadratmeterfläche erfordert, was zweifellos unpraktisch wäre, um ein solches System herzustellen oder zu nutzen.

Protocol

1. Mikrofertigung des Femtoliter-Mikrokammer-Arraysubstrats HINWEIS: Führen Sie die folgenden Mikrofabrikationsexperimente in einem Reinraum durch. Tragen Sie Handschuhe und einen Reinraumanzug, bevor Sie den Reinraum betreten. Reinigung Abdeckung Glassubstrat Stellen Sie das Deckglas auf eine Abdeckung Glas-Färbung Rack. Beschallen Sie das Deckglas in 8 M Natriumhydroxid (NaOH) für 15 min bei Raumtemperatur (RT).VORSICHT: NaOH in hohen Konzentrationen ist sehr gefähr…

Representative Results

Der Mikrofertigungsprozess besteht aus Substratreinigung, Oberflächenfunktionalisierung, CYTOP-Beschichtung, Photolithographie, Trockenätzung, photoresist-Abisolieren und Endreinigung. Wichtig ist, dass das vorgestellte Protokoll die vollständige Entfernung des hydrophoben CYTOP-Polymers in den Mikrokammern ermöglichte Abbildung 3A, wodurch eine hochparallele hydrophil-in-hydrophobe Struktur auf einem Standard-Abdeckungsglassubstrat hergestellt wurde. Mit Hilfe des Ölversiegelungsprotok…

Discussion

Die hochquantitative Messung auf Basis der hochgleichmäßigen, stabilen und biokompatiblen Tröpfchen in FemDA ermöglichte die diskrete Verteilung, das einzigartige Merkmal unserer Studie unterscheidet sich von anderen. In diesem Papier haben wir die Mikroherstellungs- und Tröpfchenbildungsprozesse systematisch optimiert und detailliert beschrieben. Es gibt mehrere kritische Schritte im etablierten Protokoll.

Zunächst bestimmt die gleichmäßige Beschichtung des hochviskosen CYTOP-Polymers…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Nummer JP18K14260 und dem Budget der Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology unterstützt. Wir danken Shigeru Deguchi (JAMSTEC) und Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) für die Bereitstellung der Charakterisierungsmöglichkeiten. Wir danken Ken Takai (JAMSTEC) für die kommerzielle Software-Unterstützung. Die Mikrofabrikation wurde in Takeda Sentanchi Supercleanroom, Der Universität Tokio, durchgeführt, unterstützt vom “Nanotechnology Platform Program” des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

View Video