Det övergripande målet med protokollet är att förbereda över en miljon beställda, enhetliga, stabila och biokompatibla femtoliterdroppar på ett 1 cm2 planarsubstrat som kan användas för cellfri proteinsyntes.
Framsteg inom rumslig upplösning och detektionskänslighet för vetenskaplig instrumentering gör det möjligt att tillämpa små reaktorer för biologisk och kemisk forskning. För att möta efterfrågan på högpresterande mikroreaktorer utvecklade vi en femtoliterdroppsystem (FemDA) och exemplifierade dess tillämpning i massivt parallella cellfria proteinsynteser (CFPS) reaktioner. Över en miljon enhetliga droppar genererades lätt inom ett finger-storlek område med hjälp av en tvåstegs olja-tätning protokoll. Varje droppe var förankrad i en femtoliter microchamber består av en hydrofil botten och en hydrofoba sidovägg. Hybrid hydrofil-i-hydrofoba struktur och dedikerade tätningsoljor och ytaktiva ämnen är avgörande för att stabilt behålla femtoliter vattenlösning i femtoliter utrymmet utan avdunstning förlust. Femtolatorkonfigurationen och den enkla strukturen hos FemDA-enheten tillät minimal reagensförbrukning. Den enhetliga dimensionen av droppreaktorerna gjorde storskaliga kvantitativa och tidsloppsmätningar övertygande och tillförlitliga. FemDA-tekniken korrelerade proteinutbytet för CFPS-reaktionen med antalet DNA-molekyler i varje droppe. Vi effektiviserade förfarandena om mikrotillverkning av enheten, bildandet av femtoliterdropparna och förvärvet och analysen av mikroskopiska bilddata. Det detaljerade protokollet med optimerad låg driftskostnad gör FemDA-tekniken tillgänglig för alla som har standardrenrumsfaciliteter och ett konventionellt fluorescensmikroskop på sitt eget ställe.
Forskare använder reaktorer för att utföra bio/kemiska reaktioner. Det finns betydande ansträngningar som har gjorts för att minska reaktorns storlek och öka den experimentella genomströmningen för att minska reagensförbrukningen och samtidigt förbättra arbetseffektiviteten. Båda aspekterna syftar till att befria forskare från en tung arbetsbelastning, minska kostnaderna och påskynda forskning och utveckling. Vi har en tydlig historisk färdplan för utvecklingen av reaktortekniken med tanke på reaktionsvolymer och genomströmning: enstaka bägare/kolv/provrör, milliliterrör, mikroliterrör, mikroliter 8-rörsremsor, mikroliter 96/384/1536-brunnsplatta och mikrofluidisk nanoliter/picoliter/femtoliterreaktorer1,,2,,3,,4,,5,,6,7. Analogt med nedskärningar av funktionen storlek transistorer på integrerade kretschips i halvledarindustrin under de senaste decennierna, bio / kemiska mikroreaktorer går igenom volymminskning och systemintegration. Sådana småskaliga verktyg har haft en djupgående inverkan på cellbaserad eller cellfri syntetisk biologi, biotillverkning och prototyper med hög genomströmning8,,9,10,11,12. Detta dokument beskriver vår senaste insats för utveckling av en unik droplet array teknik och visar dess tillämpning i CFPS13, en grundläggande teknik för syntetisk biologi och molekylär screening samhällen14. I synnerhet tillhandahåller vi avsiktligt ett optimerat och billigt protokoll för att göra FemDA-enheten tillgänglig för alla. Det billiga och lätthanterliga protokollet för den miniatyriserade enheten skulle bidra till universitetens utbildningsändamål och bidra till att sprida tekniken.
FemDA förbereder femtolter droppar på en ultrahigh densitet på 106 per 1 cm2 på en plana glassubstrat. Vi belagda en hydrofoba polymer, CYTOP15, på glassubstratet och selektivt etsade (bort) CYTOP vid fördefinierade positioner för att generera en mikrokammare array på substratet. Således består den resulterande mikrokammaren av en hydrofoba sidovägg (CYTOP) och en hydrofil botten (glas). När sekventiellt rinner vatten och olja över den mönstrade ytan, kan vattnet fångas och förseglas i mikrokammare. Den hydrofila-i-hydrofoba strukturen är avgörande för att stöta bort vatten utanför mikrokammare, isolera enskilda mikroreaktorer, och behålla en liten vattenlösning inne i femtolter utrymmet. Den unika egenskapen tillämpades framgångsrikt för beredning av vatten-i-olja droppar och lipid bilayer mikrokompar16,17. Jämfört med prototypenheten16optimerade vi först mikrotillverkningsprocessen för att förverkliga ett fullständigt avlägsnande av CYTOP-polymeren samt en fullständig exponering av glasbotten. CYTOP är en speciell fluorpolymer med extremt låg ytspänning (19 mN/m) lägre än för konventionella mikroreaktormaterial som glas, plast och silikon. Dess goda optiska, elektriska och kemiska prestanda har redan utnyttjats vid ytbehandling av mikrofluidiska enheter18,,19,20,21,22,23,24. I FemDA-systemet, för att uppnå god vätning av oljan på CYTOP-ytan, måste oljans ytspänning vara lägre än den fastaytans 25. Annars tenderar den flytande oljan som kommer i kontakt med den fasta ytan att bli sfärisk snarare än att sprida sig över ytan. Dessutom fann vi att vissa populära perfluorkolväten oljor (t.ex., 3M FC-40)16 och fluororoether oljor (t.ex., 3M Novec-serien) kan lösa cytop som ett resultat av amorf morfologi av CYTOP, vilket är dödligt för kvantitativ mätning och skulle ifrågasättas i form av korskontaminering bland droppar. Lyckligtvis identifierade vi en biokompatibel och miljövänlig olja uppvisar lägre (< 19 mN / m) ytspänning13. Vi hittade också ett nytt ytaktivt företag som kan lösas upp i den valda oljan och funktion i en låg koncentration (0,1%, minst 10 gånger lägre än tidigare rapporterats populära26,27)13. Det resulterande vatten-/oljegränssnittet kan stabiliseras av ytaktivt. På grund av oljans höga avdunstningshastighet, efter spolningen med oljan, applicerade vi en annan biokompatibel och miljövänlig olja för att ersätta den första för att täta mikrokammare. Vi kallar den första oljan (ASAHIKLIN AE-3000 med 0,1 wt % SURFLON S-386) “spololja” och den andra oljan (Fomblin Y25) “tätningsoljan”, respektive.
Den tvåstegs oljetätningsstrategin kan förverkliga en robust bildning av femtolterdropparsystemet inom några minuter och utan sofistikerad instrumentering. På grund av avdunstningsproblemet har det ansetts vara svårt att generera mikroreaktorer som är mindre än picolitervolymerna28. FemDA tog upp denna fråga genom att systematiskt optimera de material och processer som används för beredning av mikroreaktorer/droppar. Flera anmärkningsvärda funktioner i de resulterande dropparna inkluderar hög enhetlighet (eller monodispersitet), stabilitet och biokompatibilitet på femtoliterskalan. Variationskoefficienten (CV) för droppvolymen är endast 3 % (utan vinjetteringskorrigering för mikroskopiska bilder), det minsta CV:t bland droppplattformar i världen, vilket säkerställer en mycket parallell och kvantitativ mätning. Femtoliterdroppen är stabil i minst 24 timmar utan korskontaminering bland droppar vid rumstemperatur, vilket är värdefullt för en tillförlitlig tidsförloppsmätning. När det gäller biokompatibilitet lyckades vi syntetisera olika proteiner från en enda kopia mall DNA i femtoliter droppen, som tidigare hade ansetts svårt eller ineffektiv29,30. Det skulle vara värt att belysa varför vissa proteiner som kan syntetiseras i FemDA inte kan syntetiseras i andra droppsystem. FemDA var inte bara ett tekniskt framsteg, men också insåg en aldrig tidigare skådad kvantitativ mätning som kan korrelera proteinavkastningen (vilket återspeglas av fluorescensintensiteten hos droppen) till antalet mall-DNA-molekyler i varje droppe. Som ett resultat visade histogrammet av fluorescensintensiteten hos droppar från FemDA-baserade CFPS en diskret fördelning som fint kan monteras av en summa gaussiska fördelningar av lika topp-till-topp intervall. Dessutom var sannolikheten för förekomst av droppar som innehåller olika antal DNA-molekyler en perfekt passform till en Poisson fördelning31. Således kan de olika proteinavkastningen i varje droppe normaliseras baserat på den diskreta fördelningen. Denna kritiska funktion gör det möjligt för oss att skilja den enzymatiska aktivitetsinformationen från den skenbara intensiteten, som ännu inte har varit tillgänglig med andra mikroreaktorplattformar. Befintliga mikrofluidiska cell-/droppsorteringssystem är skickliga på helautomatisk sortering och bra på att koncentrera prover, men ibland kan bara produktionen av ett relativt brett eller långstjärtat histogram i den analytiska aspekten32,33. Vårt mycket kvantitativa och biokompatibla FemDA-system sätter ett nytt riktmärke och en hög analytisk standard inom mikroreaktorutveckling.
De oljor och ytaktiva ämnen som kan användas för framställning av droppar är fortfarande mycket begränsade34. Kombinationen av ASAHIKLIN AE-3000 och SURFLON S-386 etablerade i FemDA är en ny medlem av den växande arsenalen av det fysiokemiska gränssnittet mellan vattenfasen och oljefasen13. Det nya gränssnittet i FemDA är fysiskt stabil, kemiskt inert, och biologiskt kompatibel med komplexa transkription, översättning och post-translationell modifiering maskiner för många typer av proteiner13. Det skulle vara ganska attraktivt att hitta ett protein som inte kan syntetiseras i droplet inställningar istället. Dessutom är kostnadsbesparingen av reagenser tydligare i femtolterdroppsystemet än i nanoliter- och picoliterreaktorsystem35,36. I synnerhet skulle det ofta finnas en stor död volym, som huvudsakligen orsakas av slangar eller externa leveranser, i mikrofluidiska droplet generation system men inte i vår FemDA. Matrisformatet gynnas också av upprepad och detaljerad mikroskopisk karakterisering (liknande så kallad höginnehållsanalys) för varje enskildreaktor 37, snarare än bara en enda ögonblicksbild för ett snabbrörligt objekt. Femtoliterskalan möjliggjorde integration av över en miljon reaktorer på ett fingerstort område, medan samma antal nanoliterreaktorer (om sådana finns) kräver ett område med kvadratmeter, vilket utan tvekan skulle vara opraktiskt att tillverka eller använda ett sådant system.
Den mycket kvantitativa mätningen baserad på de mycket enhetliga, stabila och biokompatibla dropparna i FemDA möjliggjorde den diskreta fördelningen, det unika inslaget i vår studie som skiljer sig från andra. Vi optimerade och detaljerade systematiskt mikrotillverknings- och droppbildningsprocesserna i detta dokument. Det finns flera kritiska steg i det etablerade protokollet.
För det första bestämmer den enhetliga beläggningen av mycket trögflytande CYTOP-polymer på det rektangul…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI stipendienummer JP18K14260 och budgeten för Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology. Vi tackar Shigeru Deguchi (JAMSTEC) och Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) för att de tillhandahåller karakteriseringsanläggningarna. Vi tackar Ken Takai (JAMSTEC) för kommersiell programvara stöd. Mikrofabricationen genomfördes vid Takeda Sentanchi Supercleanroom, University of Tokyo, med stöd av “Nanotechnology Platform Program” från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), Japan, Grant Number JPMXP09F19UT0087.
(3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
Air blower | Hozan | Z-263 | |
Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |