Summary
Målet med detta protokoll är att analysera celldelning i intakt vävnad genom levande och fast cellmikroskopi med drosophila meiotic spermatocyter. Protokollet visar hur man isolerar hela, intakta testiringar från Drosophila larver och tidiga puppor, och hur man bearbetar och monterar dem för mikroskopi.
Abstract
Experimentell analys av celler som delar sig i levande, intakta vävnader och organ är avgörande för vår förståelse av hur celldelning integreras med utveckling, vävnadhomeostas och sjukdomsprocesser. Drosophila spermatocyter som genomgår meios är idealiska för denna analys eftersom (1) hela Drosophila testier som innehåller spermatocyter är relativt lätt att förbereda för mikroskopi, (2) spermatocyternas stora storlek gör dem väl lämpade för högupplöst avbildning, och (3) kraftfulla Drosophila genetiska verktyg kan integreras med in vivo analys. Här presenterar vi ett lättillgängligt protokoll för beredning av hela testi, från Drosophila tredje instar larver och tidiga puppor. Vi beskriver hur man identifierar meiotiska spermatocyter i förberedda hela testiklarna och hur man bild dem lever genom time-lapse mikroskopi. Protokoll för fixering och immunfläckande hela testikel tillhandahålls också. Användningen av larvtestes har flera fördelar jämfört med tillgängliga protokoll som använder vuxna testiklar för spermatocyteanalys. Viktigast av allt, larv testiklar är mindre och mindre trångt med celler än vuxna testiklar, och detta underlättar kraftigt högupplöst bildbehandling av spermatocyter. För att visa dessa fördelar och tillämpningarna av protokollen presenterar vi resultat som visar omfördelningen av endoplasmatiska reticulum med avseende på spindelmikrotgranskar under celldelning i en enda spermatocyte avbildad av time-lapse confocal mikroskopi. Protokollen kan kombineras med uttryck för valfritt antal fluorescerande taggade proteiner eller organellmarkörer, samt genmutationer och andra genetiska verktyg, vilket gör detta tillvägagångssätt särskilt kraftfullt för analys av celldelningsmekanismer i det fysiologiska sammanhanget av hela vävnader och organ.
Introduction
Celldelning studeras ofta med hjälp av cellinjer som odlas i kultur1. Även om vi har fått en mängd ovärderlig insikt och förståelse för grundläggande mekanismer från dessa studier2,celler som odlas i kultur kan inte helt rekapitulera fysiologi celldelning som det förekommer i intakt, levande vävnad. Till exempel, i intakta vävnader och organ, celler måste dela på rätt plats och vid rätt tidpunkt så att avkomma celler är korrekt belägna i vävnaden, så att de kan genomgå lämplig differentiering eller funktionella program, och så att cellproliferation är ordentligt samordnad med vävnadstillväxt eller homeostas3. För celler som odlas i kultur å andra sidan regleras celldelning i allmänhet av tillväxtfaktorer i odlingsmediet4, och därför kan vi inte lära oss av dessa celler hur in vivo miljöfaktorer såsom vävnadsarkitektur eller utvecklingssignalering påverkar delningsprocessen. Det är också viktigt att notera att många av de cellinjer som används för att studera celldelning, såsom HeLa och U2OS celler, härstammar från ögonbevarande tumörer5. Därför har många aspekter av dessa cancercellers grundläggande fysiologi, såsom regleringsmekanismer för cellcykler och kromosomal stabilitet, sannolikt ändrats jämfört med friska celler. Fullständig förståelse av celldelning fysiologi, därför beror på vår förmåga att studera dela celler i sina inhemska, in vivo miljöer som bevarar fysiologiska regleringsmekanismer och vävnad arkitektur.
Framsteg när det gäller att förstå hur celldelningen fungerar inom intakta vävnader och organ hämmas av svårigheter som är inneboende i in vivo- eller ex vivo-analys. För det första kan det vara svårt eller omöjligt att komma åt dela celler för mikroskopisk analys inom stora organ eller tjocka vävnader. För det andra är det ofta svårt att förutsäga när enskilda celler kommer att dela in vivo. För det tredje kan vävnad fysiologi snabbt försämras under ex vivo kultur. I detta protokoll beskriver vi lättillgängliga metoder för levande och fast analys av Drosophila melanogaster spermatocyter som de genomgår meiotic cell divisioner inom helt intakta testiklarna. Dessa celler är idealiska för levande, ex vivo analys eftersom de är lättillgängliga med standard optiska metoder såsom konfokalmikroskopi, de delar på förutsägbara tider och platser, och intakta testiklar kan upprätthållas i ex vivo kultur i upp till ca 24 h. Dessutom är Drosophila spermatocyter stora runda celler (cirka 20–30 μm i diameter) som inte ändrar form när de delar sig, vilket gör dem idealiska för hög upplösning, time-lapse-avbildning av cellulära komponenter som spindelapparaten och cytoplasmatiska organeller. Även om dessa celler genomgår meios i motsats till mitos, många av de väsentliga celldelningsprocesser är mycket lika mellan dessa två celldelningsmekanismer6. Dessa fördelar, i kombination med kraftfulla Drosophila genetiska verktyg, har gjort Drosophila spermatocyter en omfattande modell för ex vivo analys av viktiga celldelning processer inklusive spindel bildning och reglering, cytokinesi, och organell remodeling och partitionering7,8,,9,10,11.
Spermatocyter är celler som är i det meiotiska stadiet av spermatogenes. I Drosophilabörjar spermatogenesen med en grupp stamceller som finns i en liten region eller "nav" vid en pol itestikot 12,13. Dessa celler delar sig av en asymmetrisk mitos, vilket ger upphov till ett enda differentierat spermatogonium. Spermatogonia genomgår sedan fyra synkrona mitoser att producera en grupp av 16 celler som förblir nära associerade inom en enda cysta. I detta skede, cellerna övergången från en mitotisk till en meiotisk cell cykel och kallas spermatocyter. Spermatocyter tillbringar ungefär två till tre dagar i ett utökat G2-steg i cellcykeln, under vilken de växer dramatiskt och genomgår cytologiska förändringar som förberedelse för de två meiotiska divisionerna och efterföljande spermiogenesis13,14. Hela gruppen av 16 spermatocyter inom en enda cysta går sedan in i den första meiotiska divisionen samtidigt. Således kan flera meiotiska spermatocyter avbildas samtidigt som de fortsätter genom celldelning. Den första meiotiska divisionen fortsätter för ca 1,5 h och följs nästan omedelbart av den andra meiotiska divisionen, vilket ger 64 totala spermatider som går på att skilja sig till mogna spermatozoa.
En unik fördel med att använda spermatocyter för att studera celldelning i levande, intakt vävnad är att grupper eller cystor av celler ständigt utvecklas genom de olika stadierna av spermatogenes, och celler i alla stadier av spermatogenes kan vanligtvis identifieras i en viss testis (se figur 3A). Därför är det relativt lätt att hitta meiotiska celler i hela testikor. Vi fokuserar i allmänhet våra analyser på den första i motsats till andra meios eftersom dessa celler är mycket större och mer mottagliga för högupplöst bildbehandling, men hela processen omfattar både meiotiska divisioner kan framgångsrikt avbildas. Det bör också noteras att det allmänna protokollet för testis beredning och kultur kan användas för att analysera andra processer av spermatogenes också, såsom tidigare mitotiska stamceller eller spermatoggonala divisioner eller cytologiska förändringar som uppstår som spermatider mogna till spermatozoa15. Många av dessa aspekter av spermatogenes är mycket bevarade mellan Drosophila och människor16.
Drosophila spermatocyter börjar nå den meiotiska fasen av spermatogenes under den tredje instar larvstadiet av Drosophila utveckling13. Därför kan testiklar som isolerats från livscykelstadier som börjar med tredje instarlarver och inklusive puppor och vuxna användas för analys av att dela spermatocyter. Flera utmärkta protokoll finns tillgängliga för extraktion av testiklar från vuxna manliga flugor för levande och fast analys av spermatogenes17,18,19. Dessa protokoll kan vara att föredra för att studera sena stadier av spermatogenes eller om genetiska markörer som endast är synliga hos vuxna måste användas. Protokollet fokuserar istället på testis beredning från larver och tidiga puppor, eftersom testiella i dessa stadier har flera fördelar som är särskilt relevanta för celldelning analys av hög upplösning, time-lapse mikroskopi. Först är testidon från larver och poppar mindre än de från vuxna, och cellerna i organet är mindre trånga. På grund av detta kan dela spermatocyter ofta avbildas nära den yttre ytan av larvtestes, utan att behöva tränga igenom flera lager av ljusspridning vävnad. För det andra, vuxna testiklar flytta rytmiskt på grund av sammandragningar av bifogade tillbehör organ, och dessa rörelser gör time-lapse imaging av enskilda celler utmanande. Och tredje, larv testiklar är fördelaktiga när man studerar genmutationer som orsakar pupal eller vuxen dödlighet. Våra metoder är optimerade för långsiktig odling av testikel på mikroskopstadiet, vilket möjliggör avbildning av flera omgångar av celldelning eller progression av enskilda celler genom flera stadier av spermatogenes i samma preparat. Vi beskriver också ett protokoll för fixering och immunstainning av hela testikel. Sammantaget är våra protokoll särskilt användbara för dem som är intresserade av att studera celldelning i intakt vävnad, och förmågan att kombinera spermatocyte analys med mycket tractable Drosophila genetiska verktyg gör detta till en särskilt kraftfull strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered djur, verktyg och media för dissekering
- Korsa manliga och kvinnliga flugor för att få avkomma av önskad genotyp. Användbara transgena markörer för identifiering och iscensättning av meiotiska spermatocyter inkluderar GFP-tubulin för att märka den meiotiska spindeln och RFP-histon 2A för att märka kromosomer8. Använd fem till tio honor per kors och håll kors på standardflugamat i injektionsflaska i en 25 °C-inkubator tills tredje instarlarver börjar krypa upp på injektionsflaskans sidor (4–5 dagar). Tidig vit puppor börjar bildas en dag senare.
- Få två par raka pincett med fina tips. Se till att spetsarna är skarpa, även i längd och rak (Bild 1A). Använd dessa pincett endast för dissektioner och lock med 10 μl pipettspetsar när de inte används.
-
Förbered ett skalpellverktyg.
- Sätt in den trubbiga änden av en svart anodiserad stål insektsnål i en stifthållare, och vrid skruven på hållaren för att säkra stiftet på plats. Med hjälp av ett par pincett och under ett dissekerande mikroskop, ta tag i insektsstiftet i mitten och böj den för att bilda en inre vinkel på 135° (figur 1B). Den skarpa änden är för skärning vävnad, medan kanten används för att överföra testiklarna mellan droppar av media.
- Lock med en 1 000 μL pipettspets när den inte används.
- Arbeta i en vävnad kultur huva, förbereda 5 ml alikvoter av Schneiders media och lagra på 4 °C fram till tidpunkten för användning. När du är redo att börja dissektioner, värm en 5 ml media aliquot till rumstemperatur. Överför sedan det uppvärmda dissekeringsmediet till en 10 ml-spruta och fäst ett 0,22 μm sprutfilter.
2. Dissekering av testiella medel från larver och tidig puppor
- Använd den mediefyllda filtersprutan för att driva ut tre droppar media (50 μL vardera) upptill, mitten och botten av en glasrutschbana.
- Använd en dissekerande sond för att överföra fem till tio tredje instar larver eller tidiga puppor (puppor som fortfarande är vita eller gula) till den övre droppen. Skaka försiktigt larverna och popparna i mediet med dissekera sonden för att avlägsna mat eller skräp.
- Under ett dissekerande mikroskop vrider du en enda larva eller puppa på sin sida med en dissekerande sond för att identifiera de två bilaterala testikelerna om sådana finns, som visas som ovala genomskinliga strukturer i den bakre tredjedelen av kroppen (figur 2A, B). Djur som saknar test är hondjur och bör kasseras.
- När en hanlarva eller puppa hittas och är ren, flytta den till den andra droppen av media. Upprepa tills 3 eller 4 hanlarver och/eller puppor har överförts till den andra droppen av media.
- Arbeta i den andra droppen av media, förstå en enda hanlarva eller puppa med ett par pincett i mitten av regionen, bara främre till testiklarna. Använd det andra paret pincett för att försiktigt riva djuret på mitten.
- Håll den bakre änden av larven eller puppan ner på glasbilden med ett par pincett. Börjar precis bredvid pincett, tryck ner på nagelbanden med hjälp av kanten av skalpell verktyget och flytta skalpellen mot den skurna änden av djuret. Detta kommer att utvisa djurets inre organ, som inkluderar tarmar, fett kroppar, och testiklar.
- Reta försiktigt isär testiklarna från resten av organen. Testiklen är tydliga, ovala organ inbäddade i band av fettkropp (figur 2C).
- Överför testiklarna en i taget till den tredje mediedroppe. För att åstadkomma detta, sätt in kanten av skalpellen under fettkroppen, lyft vävnaden ur mediet och flytta den snabbt till den tredje droppen.
- Alternativt, om det inte finns tillräckligt med fett kropp fortfarande fäst vid testiklarna för att framgångsrikt lyfta vävnaden, försiktigt överföra vävnaden med hjälp av ett glas Pasteur pipett som har pre-fuktad med dissektion media.
- Använd den skarpa änden av skalpelellverktyget för att försiktigt skära bort överflödig fettkropp från testikelerna och lämna bara en liten kant av fettkropp runt kanterna (figur 2C). Det är inte nödvändigt att ta bort alla fett kroppen, och försöker göra det kommer sannolikt att resultera i skada eller rupturing av testiklar.
- Upprepa ovanstående steg för alla manliga larver på glasbilden.
- Fortsätt antingen till steg 3 eller steg 5.
3. Monteringstest för live mikroskopisk avbildning
OBS: Denna montering förfarande har anpassats från ett nyligen publicerat protokoll för avbildning av Drosophila larv hjärnneuroblaster20. Ytterligare information finns i denna referens.
- Använd filtersprutan för att deponera en enda droppe Schneiders media (ca 30 μL) på mitten av en 50 mm gasgenomsläpplig odlingsskål.
- Använd en förvätgad Pasteur pipett för att överföra de förberedda testerna till droppen på den gasgenomsläppliga skålen. Testikarna kommer i allmänhet att flyta till ytan av droppen.
- Använd skalpelellverktyget för att försiktigt trycka ner testiklen på det gasgenomsläppliga membranet. Var noga med att inte brista gasgenomsläppliga membranet med den skarpa punkten i skalpellen. Tryck alla testikor till mitten av droppen.
- Använd en 1 ml spruta fylld med halocarbonolja för att göra fyra droppar olja, ca 30 μL vardera, på gasgenomsläppliga membranet. Avstånd droppar av olja runt droppe av media som innehåller testiklarna för att motsvara de fyra hörnen av en 22 mm glas täckglas.
- Rada upp hörnen på en 22 mm glas täckglas med fyra droppar halocarbon olja och försiktigt sänka täcket på media och olja. Låt täcket sedimentera och för att det medium som innehåller testiklarna ska spridas mellan oljedropparna.
- Ta bort överflödigt medium så att täcken kan bosätta sig på testiklarnas yta. Medan du observerar testiklarna under ett dissekerande mikroskop, sätt in hörnet av en känslig uppgift torka i media under täcket för att veka bort en liten mängd vätska. Wick bort tillräckligt med media tills glaset täcket bara kommer i kontakt med ytan av den största testiklarna. Det är viktigt att inte ta bort för mycket media och sänka täcken för långt, eftersom detta kommer att utöva tryck på testiklarna och få dem att brista (se figur 5).
4. Live Imaging av meiotiska spermatocyter
OBS: Spermatocyter kan avbildas med hjälp av en laserscanning eller spinning disk confocal mikroskop. Systemet måste ha tillräcklig hastighet och känslighet för att undvika fotobleaching av fluorescerande proteiner eller fotoskador i vävnaden.
- Placera en droppe nedsänkningsolja på glasskydden precis ovanför testikorna. Vänd över skålen och placera den på mikroskopstadiet och flytta mikroskopmålet (40x eller 60x) i oljan tills den är strax under testikelerna. Använd överfört ljus för att hitta en enda testikel och sätta den i fokus.
- Medan du tar snabba bilder med konfial, flytta testikjarna runt för att undersöka organisationen av cellerna. Ena änden av testiken kommer att ha många små, tätt packade celler. Detta ändamål innehåller sett stamceller och spermatogonia. Flytta mot den andra änden av organet, identifiera successivt större celler organiserade i diskreta kluster eller cystor. Dessa stora celler är spermatocyter (figur 3A).
- Om imaging GFP-tubulin, identifiera spermatocyter som kommer att påbörja meios inom 30-60 min med närvaro av två ljusa microtubule asters (dvs. centrosomes) ligger vid cortex av cellen (figur 3B, C).
- När en cysta av meiotiska spermatocyter har identifierats, inrätta förvärv parametrar för att fånga z-högar av bilder över tiden. Vanligtvis är förvärv av 15–20 bilder fördelade 1,5 μm isär i z-dimensionen tillräckligt för att fånga hela volymen av flera spermatocyter inom samma cysta.
- Skaffa full z-stackar var 2:e minut om hela den första meiotiska divisionen, som tar ca 1,5 timmar. Det är möjligt att använda snabbare förvärvsfrekvens, särskilt om endast en specifik händelse av meios ska analyseras. Var dock noga med att inte orsaka fotoblekning eller fotoskador på grund av upprepad exponering av provet till laser excitation.
- Använd ett kontinuerligt, automatiskt fokus styrsystem för att förhindra fokaldrift under den långa tiden-kurs av förvärv. Temperaturkontroll av provet på mikroskopstadiet är i allmänhet inte nödvändigt, förutsatt att rumstemperaturen är ca 22–23 °C. Om det finns temperaturkontroll, håll provet vid 25 °C på mikroskopstadiet.
- Om meiotiska spermatocyter inte hittas, förvara provet i flera timmar eller över natten i en 25 °C-inkubator och bild igen.
5. Fixering och immunfläckande
- Från steg 2.10 ovan, använd en pastörpipetett i glas för att överföra testiklar till en brunn i en 9-brunns glasdissekeringsskål innehållande 0,5 ml 8 % paraformaldehyd i PBSTx (fosfatbuffrad koksaltlösning med 0,3 % Triton X-100). Se till att testikarna ligger på botten av skålen.
OBS: Paraformaldehyd är giftigt och bör hanteras med handskar i en rökhuva. - Fixera testerna i 20 min vid rumstemperatur.
- Överför testiklen till en brunn som innehåller 0,5 ml PBSTx. Tvätta i 5 min med mild omrörning. Upprepa tvättsteget i nya brunnar med färsk PBSTx två gånger till.
- Späd primär antikropp till önskad koncentration i 0,5 ml PBSTx som innehåller 5% bovin serum albumin (BSA) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Överför testiklar från den 9-brunnsglasdissekerande skålen till röret av utspädd primärantikropp och inkubera över natten vid 4 °C med mild gungning eller nötning.
- Tvätta testikorna i 0,5 ml PBSTx i 5 min i en brunn av en 9-brunnsdissekeringsskål. Upprepa tvättsteget med färsk PBSTx två gånger till.
- Späd sekundär antikropp i 250 μl PBSTx som innehåller 5% BSA och fördela i en ren brunn av en 9-brunns glasdissekerande skål. Om så önskas, tillsätt DAPI för att färga DNA. Överför testiklar till brunnen som innehåller sekundär antikropp, täck med plastfolie och inkubera i mörker med mild agitation i 4 timmar vid rumstemperatur.
- Överför testikelerna till en ren brunn fylld med 0,5 ml PBSTx. Tvätta med färsk PBSTx två gånger i 5 min och en tredje gång i 30 min.
6. Montering fasta prov
- Överför testerna från den sista tvätten till en glasmikroskopibild med hjälp av en Pasteur-pipett. Använd vid behov skalpelellverktygets kant för att trycka ner testiklen på bildens yta.
- Använd hörnet av en delikat uppgift torka att veka bort överflödig vätska från testikarna. Ta bort så mycket vätska som möjligt.
- Applicera en 30–50 μL droppe mikroskopimonteringsmedium på testiklen.
- Placera ett 22 mm täckglas på monteringsmediet och låt täcket att sedimentera och monteringsmediet att sprida sig under täckslipen. Tryck försiktigt på täcket om det behövs för att pressa ut överflödigt monteringsmedium och låt täcket vila på testikelytan.
- Använd nagellack för att täta kanterna på täcket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När detta protokoll har utförts kommer testiella att förbli helt intakta för avbildning genom konfokalmikroskopi eller andra fluorescensmikroskopimetoder. Som framgår av figur 3Abevaras testiklarnas cellulära organisation, och utvecklingen av celldifferentiering från ena änden av testiklarna till den andra, inklusive spermatogonia, spermatocyter och haploida spermatider är synlig. GFP-tubulin är en användbar markör för att identifiera dela spermatocyter och för levande bildbehandling av utvecklingen av cellerna genom meios. Som visas i figur 3Bkan spermatocyter om den börja meiosen identifieras genom deras två framstående microtubule asters. Genom metafas är de stora meiotiska spindlarna vackert märkta av GFP-tubulin (figur 3C).
Drosophila spermatocyter stora storlek och deras relativa långsam progression genom meios gör dem idealiska för analys av dynamik och omorganisation av cellulära komponenter såsom cytoplasmatiska organeller under celldelning8,11,21. Figur 4 och Video 1 visar live imaging analys av den dynamiska omorganisationen av endoplasmatiska reticulum (ER) med avseende på mikrotubuli genom meios. Som beskrivits ovan, under sena interphase strax före uppkomsten av meios, två centrosomes ligger vid hjärnbarken i cellen är tydligt synliga med GFP-tubulin fluorescens. I detta skede, ER-riktade RFP (RFP-KDEL) fluorescens avslöjar att ER är jämnt fördelade över hela cytoplasman. Centrosomes börjar sedan migrera till motsatta sidor av kärnhöljet för att upprätta de två spindelstolparna. Under denna tid ackumuleras ER snabbt runt centrosomala mikrotubuli och rensas gradvis från resten av cytoplasma. Kärn- kuvertnedbrytning (NEB) avslöjs av uppkomsten av GFP-tubulinfluorescens inom den kärn- regionen. Det bör noteras att Drosophila celler dividera med halvöppen mitos eller meios, vilket innebär att nukleära kuvertkomponenter bryts ner och skingra och stora cytoplasmatiska molekyler kommer in i kärnkraftsregionen, men ett kuvert av ER-härledda membran omger spindeln och kromatider i hela celldelning22,23,24. Vid tiden för NEB och framåt genom metafas, är ER nästan helt förknippad med de astrala mikrotubuli som omger de två spindelpolen centrosomes. Dessa två astrala microtubule ansamlingar av ER sedan partitionera till de två dotterceller under anafas, säkerställa korrekt ER arv av de nybildade cellerna8,11.
Figur 5 visar effekterna av testis bristning på levande avbildning av spermatocyter. Som beskrivs i protokollet, måste stor försiktighet iakttas för att inte sänka täcket för långt på ytan av testerna under monteringsstegen, eftersom detta kommer att utöva tryck på testerna och orsaka dem att brista. Som framgår av figur 5 och Video 2, cystor av spermatocyter snabbt rinna ut ur brusten testikel, och denna rörelse av cellerna gör levande, time-lapse imaging extremt svårt.
Figur 1: Verktyg som krävs för lyckad dissekering. (A) Pincett som används för dissekering måste vara raka och ha skarpa, obrutna spetsar (indikeras med grön bock). Använd inte pincett med böjda eller trasiga spetsar (röda X-märken), eftersom de kommer att vara ineffektiva på att gripa larver och retas isär vävnader. (B)För att förbereda skalpelellverktyget, böj en svart anodiserad stålinsektstift till en inre vinkel på cirka 135°. Den skarpa punkten används som en kniv för att skära genom vävnad, och den raka kanten används för att flytta vävnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Identifiering av larv- och pupaltestes. (A) Bilder av manliga och kvinnliga larver. Testiklen kan identifieras hos hanen som de cirkulära eller ovala genomskinliga strukturerna i den bakre tredjedelen av djuret (pilspets). Observera bristen på en liknande struktur hos honan. B)Bild av en tidig hanepvin, med de två genomskinliga testiklen som indikeras med pilspetsar. C)Testerar med fästade fettkroppar efter dissekering. De två testikarna till vänster har alltför fett organ fortfarande fäst som måste trimmas bort. De två testikelerna till höger har trimmats ordentligt av sina feta kroppar och är redo för avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Identifiering av meiotiska spermatocyter i en framgångsrikt förberedd testiko. (A)Konfial bild av en framgångsrikt beredd levande, intakt testis uttrycker GFP-tubulin. Navet av stamceller ligger mot den nedre spetsen av testikels, även om det inte kan identifieras i denna beredning. Flera lager av små spermatogonia indikeras, och dessa följs av många cystor av spermatocyter. En cysta av spermatocyter i den första meiotiska divisionen kan identifieras baserat på den stora storleken på cellerna (cirka 20 – 30 μm i diameter) och förekomst av GFP-tubulin märkta meiotic spindlar. Spermatocyter i den andra meiotiska divisionen har på samma sätt spindlar, men dessa celler är ungefär hälften av storleken meios I celler. Post-meiotic spermatids är också synliga, liksom förlängning spermatozoa. (B) Spermatocyter som kommer att börja meios inom 30 - 60 min kan identifieras av sina två stora, mycket ljusa microtubule asters (indikeras av pilhuvuden) märkta av GFP-tubulin. Potatiscystna av pre-meiotic celler avgränsas av den streckade gula linjen. (C)Celler i meios kan identifieras genom sina stora meiotiska spindlar som lätt visualiseras med GFP-tubulin. Cysta av meiotiska celler avgränsas av den streckade gula linjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Time-lapse imaging av meios i en enda spermatocyt. En enda spermatocyte co-uttrycker GFP-tubulin och RFP riktade till ER (RFP-KDEL) avbildade varannan minut genom loppet av meiosis. Visas är representativa bilder av spermatocyter i specifika stadier av meios, med början i slutet av interfasen och fortskrider genom telophase. Tiderna är på några minuter. Varje bild är ett enda optiskt plan från en stapel med femton optiska skivor som förvärvats vid varje tidpunkt. Denna siffra ändrades från Karabasheva och Smyth, 20198. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa bilder av en testis före och efter rupturing. Bilden till vänster, märkt "Intakt", visar en GFP-tubulin uttrycker testikel strax före rupturing. Bilden till höger visar samma testikel efter rupturing. Cystor av spermatocyter kan ses strömma ut ur brusten testikel. Pilspetsarna indikerar en cysta av meiotiska spermatocyter; notera den betydande rörelsen av dessa spermatocyter efter testiklarna brister, vilket gör imaging dessa spermatocyter över tiden extremt utmanande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Fullständig meiotisk delning av en enda spermatocyt. Visas är heltidsförfall av GFP-tubulin och RFP-KDEL uttrycker spermatocyter i figur 4. Bilder togs varannan minut och uppspelningshastigheten är tre bildrutor per sekund. Denna video har ändrats från Karabasheva och Smyth, 20198. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Brusten testis. Time-lapse av en test är före och efter rupturing. Bristningen är uppenbar på grund av den plötsliga streaming av cystor av celler genom det nedre vänstra hörnet av testikel. Bilder togs varannan minut och uppspelningshastigheten är tre bildrutor per sekund. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett protokoll för beredning av larv eller tidiga pupal Drosophila testiklar, optimerad för långsiktiga, levande bildbehandling av spermatocyte cell division. Detta är en kraftfull metod för analys av celldelning i det fysiologiska sammanhanget intakt vävnad. Kraften i denna metod utökas ytterligare i kombination med Drosophila genetiska verktyg, såsom specifika genmutationer, vävnadsspecifika RNAi-medierad dämpning och fluorescerande märkta protein- och organellmarkörer. Dessutom, den liten storleken av larv och pupal testiklar, och förmågan till bild dela celler mycket nära glaset coverslip, gör metoden idealisk för högupplöst bildbehandling inklusive super-upplösning metoder. Mångsidigheten hos detta experimentella system framgår av de representativa resultat som beskriver den dynamiska omorganisationen av ER under celldelning. Drosophila spermatocyter är särskilt användbara för en sådan analys av organell dynamik under celldelning på grund av att dessa celler stora storlek och relativt långsam transitering genom meios. Vidare kan samma celler avbildas post-meiotically att förstå hur förändringar i organell dynamik eller celldelning mekanismer påverkar efterföljande händelser av spermatogenes. Således finns det stor potential med denna experimentella metod för att förstå fysiologi celldelning inom större sammanhang av vävnadsutveckling och celldifferentiering, resultat som är ouppnåeliga när man studerar celler som odlas i kultur.
Protokollet innehåller flera element som underlättar långsiktig ex vivo-odling av testikor i upp till ca 24 timmar. För det första innehåller Schneiders media, som utvecklades för underhåll av Drosophila vävnadsodlingsceller, lättillgängliga energikällor och är optimerat för att upprätthålla fysiologiskt pH i atmosfärisk luft. För det andra möjliggör det gasgenomsläppliga membran som används för monteringstestar snabb gasutbyte. En viktig fördel med långsiktig kultur är att om celler i önskat utvecklingsstadium eller meios inte hittas omedelbart efter provberedning, kan provet lagras och avbildas igen vid ett senare tillfälle. Vi har kontrollerat att testi försök som upprätthålls i en 25 °C inkubator över natten, för totalt 16-24 timmar, är livskraftiga och verkar friska baserat på rutinmässig närvaro av celler som aktivt genomgår meios och utvecklas genom senare stadier av spermier differentiering. Försiktighetsåtgärder bör dock vidtas vid odlingstest under längre tid än 2-3 timmar för att säkerställa att vävnadsfysiologi inte påverkas negativt. Viktigast av allt, testiklarna fortsätter att växa i kultur som celler föröka sig och mogna spermier förlänga. Detta kan leda till att testikarna förstoras till den grad att de brast på grund av det restriktiva utrymmet mellan membranet och täcken, vilket gör testerna olämpliga för levande bildbehandling av skäl som beskrivs nedan. Dessutom, om långsiktiga kulturer ska rutinmässigt användas i experiment, är det lämpligt att testa om lab-specifika utökade odling villkor resultera i meiotiska avvikelser såsom långvarig meiotic varaktigheter eller ökade frekvenser av eftersläpande kromosomer eller cytokinesi misslyckande.
För att avbilda enskilda celler under långa tidskurser är det viktigt att cellerna inte rör sig nämnvärt när de förberedda testikorna är på mikroskopstadiet. Det är därför viktigt att testikelerna förblir intakta och oskadade när de utför protokollet, eftersom celler spiller ut från skadade testibila sig och alla celler i organet rör sig som ett resultat (se figur 5 och Video 2). Det kan fortfarande vara möjligt att avbilda spermatocyter i skadade testiklar om cellerna så småningom bosätta sig och sluta röra sig, men när detta inträffar stadierna av meios som man avser att analysera kan redan ha inträffat. Dessutom kan effekterna av vävnadsskador på själva celldelningsprocessen inte diskonteras. Skador på testiklar kan uppstå när fettkroppar rensas bort efter avlägsnande av testiklarna från larver. Stor försiktighet måste därför iakttas för att undvika piercing eller rycka på organen under detta steg i protokollet. I själva verket är det ofta inte nödvändigt att ta bort mycket av de feta kropparna, så länge de inte skymmer visualisering av testikel. Mer vanligt är testis skada resultatet av att ta bort för mycket odlingsmedium efter placering av täcket under monteringsproceduren för levande bildbehandling (steg 3.6). När mediet avlägsnas faller täcket lägre och utövar tryck på testikelerna, och övertryck kommer att orsaka testikel att brista. Således, medan det är viktigt för coverslip att vara så nära som möjligt till testiklarna för att underlätta optimal avbildning av spermatocyter, är viss praxis nödvändig för att undvika att ta bort för mycket medium och sänka täcket för långt. Det är också bra att påpeka att för vissa tillämpningar, såsom akut exponering av spermatocyter till läkemedel eller andra små molekyler, kan det vara fördelaktigt att störa testiklarna och sprida cystor av spermatocyter för analys. Flera utmärkta protokoll finns tillgängliga för beredning och kultur av spridda spermatocyte cystor18,25.
En viktig faktor när man använder spermatocyter för celldelning analys är att dessa celler utföra meiotiska i motsats till mitotiska divisioner. Viktigt, många av de väsentliga aspekterna av celldelning mekanik, såsom spindel arkitektur och cytokinesi, liknar mellan manlig meios och mitos6. Således kan mekanistiska insikter som samlats in från att studera spermatocyte meios vara i stort sett tillämpliga på allmänna mekanismer i djurcell division7. Beroende på vilka mekanistiska frågor som tas upp kan dock viktiga skillnader mellan spermatocyter och mitotiska celler i processer som kromosomdynamik och cellcykelreglering behöva beaktas26. Samtidigt presenterar Drosophila spermatocyter den unika möjligheten att jämföra mitotiska och meiotiska celler inom samma vävnad och sett härstamning. Till exempel, samma testis beredning kan användas för att analysera sett stamceller eller spermatogonia genomgår mitos och spermatocyter genomgår meios. Vi försöker vanligtvis inte att avbilda sett stamceller eller spermatoggonial mitoser i levande testis preparat eftersom tidpunkten för dessa divisioner är svårt att förutsäga. Vi har dock slumpartat fångat dessa divisioner i våra experiment, vilket visar att det allmänna protokollet kan tillämpas på analys av mitotiska celler även inom testiklar.
Den metod som presenteras fokuserar på testis förberedelse för levande avbildning av spermatocyte meios, eftersom detta möjliggör realtidsanalys av cellulär och molekylär dynamik. Vi tillhandahåller också en metod för fixering och immunsormning av intakta testiklar, eftersom detta tillvägagångssätt kan vara att föredra om det krävs fluorescerande märkta uttryckskonstruktioner inte är tillgängliga eller för att undvika störande effekter av proteinöveruttryck. En viktig faktor är dock att fixering inte alltid troget bevara inhemska vävnad och cellulär arkitektur. Till exempel har vi och andra funnit att fixering ofta resulterar i fragmentering eller störningar av ER11,27. Några av dessa problem kan lindras med hjälp av olika fixativ eller vävnad beredningsmetoder, och vissa felsökning kan därför vara nödvändigt att identifiera den optimala fixering protokoll för bevarande av en viss cell komponent eller protein organisation. Lyckligtvis finns ett antal tilläggsprotokoll för Drosophila spermatocyte fixering också18,28,29.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit mångsidiga metoder för beredning av Drosophila testiklar för levande och fast cell analys av spermatocyte meios. Specifika styrkor i detta experimentella tillvägagångssätt inkluderar analys av celldelning i intakt vävnad, högupplöst avbildning av stora celler och integration med Drosophila genetiska verktyg. Experiment som använder metoden har potential att ge viktiga bidrag till vår förståelse för hur celldelning integreras med komplexa mekanismer för vävnadsutveckling och homeostas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Försvarsdepartementet start-up medel till JTS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
