Summary
軸索輸送は運動ニューロンの健康にとって重要なメカニズムです。このプロトコルでは、マイクロ流体室を用いた運動ニューロン軸索における酸性コンパートメントおよびミトコンドリアの軸索輸送を追跡するための詳細な方法を提供する。
Abstract
運動ニューロン(MNs)は非常に長い軸索を持つ極偏光細胞です。軸索輸送はMNの健康にとって重要なメカニズムであり、神経の成長、発達、生存に寄与する。MN軸索における蛍光標識されたオルガネラの軸索輸送を追跡するためのマイクロ流体室(MFC)の使用法について詳細に説明する。この方法は、迅速で、比較的安価であり、空間および時間における細胞内の手がかりの監視を可能にする。我々は、ステッププロトコルをステップごとに記述する:1)ポリジメチルシロキサン(PDMS)の製造;2) MFCにおける腹側脊髄外植体およびMN解心培養のめっき;3)ミトコンドリアと酸性コンパートメントの標識後に生きた共焦点想像;4)手動および半自動軸索輸送分析。最後に、HB9:::GFP腹側脊髄外型軸索の輸送におけるHB9::GFP腹側脊髄の輸送の違いをシステムの有効性の証拠として示す。全体として、このプロトコルは、様々な軸索成分の軸索輸送を研究するための効率的なツールと、空間的実験的可能性を発見するのに役立つMFCの使用のための簡略化されたマニュアルを提供します。
Introduction
MNsは長い軸索を持つ非常に偏光細胞であり、成人の人間では最大1メートルに達する。この現象は、MN 接続性と機能の維持に重要な課題を生み出します。その結果、MNsは、細胞体からシナプスおよび背中への軸索に沿った情報、オルガネラ、および材料の適切な輸送に依存しています。タンパク質、RNA、オルガネラなどの様々な細胞成分は、軸索を介して定期的にシャトルされます。ミトコンドリアは、日常的にMNsで輸送される重要なオルガネラである. ミトコンドリアは、ATPの提供、カルシウムバッファリング、およびシグナリングプロセス11、22を担当するMNsの適切な活動および機能に不可欠である。ミトコンドリアの軸索輸送は、よく研究されたプロセス33、44です。興味深いことに、ミトコンドリア輸送における欠陥は、いくつかの神経変性疾患、特にMN疾患5に関与することが報告された。酸性コンパートメントは、MN軸索に沿って移動する固有のオルガネラの別の例として機能します。酸性コンパートメントは、リソソーム、エンドーソーム、トランスゴルジ装置、および特定の分泌小胞6を含む。酸性コンパートメントの軸索輸送の欠陥は、いくつかの神経変性疾患にも7で発見され、最近の論文はMN疾患におけるその重要性を強調した8。
効率的に軸索輸送を研究するために、体性および軸索コンパートメントを分離するマイクロ流体室は、多くの場合、9、10を10使用しています。マイクロ流体システムの2つの大きな利点と、区分化と軸索の単離は、細胞内プロセス11の研究に理想的である。神経細胞体と軸索の間の空間的分離は、異なる神経区画(例えば、軸索対ソーマ)の細胞外環境を操作するために使用することができる。生化学的、神経細胞の成長/変性、免疫蛍光アッセイはすべてこのプラットフォームから恩恵を受けます。MFCはまた、骨格筋12、13、14,13,14などの他の細胞タイプとニューロンを協調させることによって、細胞間コミュニケーションの研究を支援することができる。
ここでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメント輸送を監視するための、シンプルでありながら正確なプロトコルについて述べています。さらに、逆行性および前向き移動小器官の相対的な割合と輸送速度の分布を比較することによって、この方法の使用を示す。
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Protocol
このプロトコルでの動物のケアと治療は、テルアビブ大学動物倫理委員会の監督と承認の下で行われました.
1. MFCの準備
- 一次金型での PDMS 鋳造 (図 1)
- 詳細なプロトコル9に従って、一次金型(ウェーハ)を購入または作成します。
- 加圧空気を使用して、コーティングステップに進む前にウェハプラットフォームからあらゆるタイプの汚れを取り除きます。ウエハーの表面は滑らかで明確に見えるはずです。
- 容器に50mLの液体窒素を充填します。10 mLの注射器と23G針を準備します。
注:このステップの手順はすべて、化学フードで行う必要があります。 - 化学フードには、注射器と針を使用して2 mLの液体窒素をプールします。空気が引かれたように見えるかもしれませんが、注射器は窒素で満たされています(図1A)。ウェハ含有プレートを密封可能な容器に入れます。
- クロロトリメチルシランボトルを開け、窒素で満たされたシリンジを使用してゴムキャップを突き刺し、注射器の内容物全体をボトルに注入します。針を引き出さずに、ボトルを逆さまにして2mLのクロロトリメチルシランを引き戻します。
注:注射器の圧力のために、少量のクロロトリメチルシランが針から噴霧されます。危険を避けるために、フードの内壁に針を向けます(図1B)。 - クロロトリメチルシランを容器内に均一に広げる(ステップ1.1.4から)、ウエハまたはウエハ含有プレート上では直接入れられていない。容器を閉め、ウエハー1回につき5分間インキュベートします。
注:ウエハーがクロロトリメチルシランでコーティングされるのが初めての場合、ウエハごとに1時間のインキュベーションを許可する必要があります。 - ウェハと容器を化学フードから30分間取り出さないで下さいます。
注意:クロロトリメチルシランは揮発性が高い。 - PDMSベース(材料表を参照)を50 mLチューブに計量し、それぞれ16:1の比率でPDMS硬化剤を添加します(例えば、47.05gの塩基および2.95gの硬化剤)。低速回転器を使用して10分間混ぜます。
- 各ウェハ含有プレートにPDMSを所望の高さに注ぎます(図1C)。
注:薄いマイクロ流体室(3-4 mmまで)を使用すると、培養皿への付着性が向上し、漏れを防ぎます。 - すべてのプレートを真空デシケータ内に2時間置きます(図1E)。このプロセスはPDMS内に閉じ込められた空気を取り除き、気泡を除去し、明確で均一な型を形成する。
- オーブン内にプレートを3時間(または一晩)70°C(図1E)に入れます。
注:オーブンに置くとき、プレートはレベルにする必要があります。
- エポキシモールドでのPDMS鋳造
注意:ウエハの準備は高価であり、特別な装置を必要とし、壊れやすいウェーハを損傷する可能性があるので、ウエハのエポキシレプリカを生成することが可能です。レプリカは安価で耐久性があり、マイクロ流体室の大量生産に使用できます。- PDMS(1.1.8-1.1.11に記載)を元のウエハーにキャストして硬化させる。
- PDMSの余分な部分を取り除き、マイクロ流体要素とマイクロ流体室に加工するために必要な機能領域だけを残します。
- すぐにPDMSを厚くて粘着テープで包み、ほこりが溜まるのを防ぎます。
- 内部のPDMS全体に適合する組織培養グレードのプラスチック皿を選択し、その周りにエポキシのための余地を残します。PDMS からプラスチック皿までの距離は 5 mm 未満でなければなりません。
- 10:1の比率で混合された少量のPDMSを調製(塩基:硬化剤)。新鮮な液体PDMSは、プラスチック板の底に固体PDMSを接着するために使用されます。
- プラスチックプレートの中央底に液体PDMSの最小量を適用し、PDMSから粘着テープを取り外し、プラスチック皿底に接着します。マイクロ流体要素が上向きになっていることを確認します。
- PDMSは70°Cのオーブンで30分間硬化させましょう。
- 試験管内でそれぞれ100:45の比率で塩基と硬化剤を混合してエポキシ樹脂を調製する。異なるエポキシ樹脂は、異なる混合比を有し得る。通常の100mmプレートに必要な体積は約40mLです。
- エポキシは、混合物が目に見えて均質になるまで、回転子で10分間よく混合させましょう(すなわち、液体中に目に見える繊維状のアーチファクトがない)。
- エポキシ混合物を400xgで5分間g遠心し、内部に捕捉された気泡を除去する。
- 遠心分離の間に、シリコーングリースの薄い層を壁の周りに広げ、培養皿の他のすべての露出プラスチック部分。これにより、エポキシが皿のプラスチックで重合するのを防ぎ、プロトコルの終わりに容易に硬化したエポキシの除去を可能にする。
- エポキシをゆっくりと皿に注ぎ、PDMSを完全に覆い、それを超えて少なくとも5mmで進む。プレートを安全な場所に置き、次の48時間は移動しません。
- 48時間後にエポキシは完全に治癒する必要があります。プレートを80°Cの予熱したオーブンに3時間挿入して最終硬化します。
- プレートから硬化したエポキシを取り除き、プレートのプラスチック壁を壊すまで軽くヤンキングして元のPDMSモールドを取り除きます。その後、簡単にエポキシから分離し、剥離する必要があります。
- 抽出したら、新しいエポキシレプリカから残りのグリースを拭き取り、それを逆さまに(すなわち、複製されたマイクロ流体要素を上に向けて)新しい培養皿に差し込みます。エポキシレプリカは PDMS 鋳造の準備が整いました。
- 加圧空気またはN2を使用して、PDMSの残骸やエポキシモールの汚れを吹き飛ばし、イソプロパノールで2倍すすいでください。3回目に充填し、軌道シェーカープレートで10分間インキュベートします。イソプロパノールで金型を再び3倍すすいで、残りの液体を捨てます。空気またはN2で乾燥するか、乾燥するまで70°Cのオーブンに入れます。
メモ:イソプロパノールを使用して廃棄する場合は、安全手順に従ってください。 - 鋳造までモールドプレートを閉じておきます。手順 1.1.8.-1.1.11 に従ってください。
- PDMS を MFC に打ち抜いてスカルプトする (図 2)
- メスを使用してウエハーの(+)マークに従って、プレートからPDMS金型をカットして取り外します。金型が壊れやすいので、武力を行使しないでください(図2A)。
- 実験用の設定に応じて、スケッチに描かれた指示に従ってチャンバーをパンチし、カットします(図2B-F)。
- 脊髄外植培養(図2C,E)では、大きなMFCの遠位側に7mmウェルを2つパンチします。ウェルがチャネル エッジと重なるように見つけます。近位側では、チャネルの中央に7mmのパンチを入れ、必要なスペースが外植に残るように、最小限のオーバーラップを行います。近位チャネルの 2 つのエッジに 2 つの追加の 1 mm の穴をパンチします。上向きのマイクロ流体要素でMFCを回し、20Gの針を使用して、パンチ7ミリメートルによく3つの小さな外植洞窟を彫ります。
- MN カルチャの解化 (図 2D,F)では、小さな MFC の 2 つのチャネルの端に 4 つの 6 mm ウェルをパンチします。
- 組織培養用の MFC の殺菌
- ベンチに50センチの長い粘着テープバンドを広げます。チャンバーを押して引き戻して粘着テープ(上下両方の面)に向かい、粗い汚れを取り除きます。新しい15cmプレートに清潔なチャンバーを置きます。
注: マイクロ流体要素が上向きの場合は、直接押さないでください。 - 分析グレード70%エタノールでチャンバーを軌道シェーカーで10分間インキュベートします。
- エタノールを処分し、チャンバーを組織培養フードまたはオーブン中で70°Cで乾燥させます。
- ベンチに50センチの長い粘着テープバンドを広げます。チャンバーを押して引き戻して粘着テープ(上下両方の面)に向かい、粗い汚れを取り除きます。新しい15cmプレートに清潔なチャンバーを置きます。
- MFC をガラス底皿に置く
- チャンバーを組織培養グレード35mm/50mmガラス底皿の中央に置き、エッジに軽微な力を加えてPDMSと皿底を結合させます。ガラス底部を壊さないように、固体表面の上に力を加える。
- 70°Cで10分インキュベート。プレートへの付着を強化するためにチャンバーを押してください。
- UV光の下で10分間インキュベートします。
- コーティングと培養
- 両方のコンパートメントに1.5 ng/mLポリL-オルニチン(PLO)を加えます。コーティングメディアをチャネルの入り口で数回直接ピペット処理して、PLOがチャネルを通って動かしていることを確認してください。
- マイクロ流体室を10倍の拡大率で光学顕微鏡で調べ、気泡の存在を確認します。気泡がマイクロ溝をふさいでいる場合は、2分間真空デシケータにMFCを置きます。その後、それらを通してコーティングメディアをピペット化することによって、チャネルに巻き込まれた余分な空気を除去します。一晩インキュベート。
- 同じ方法で一晩インキュベーションのためにPLOをラミニン(DDWで3 μg/mL)に置き換えてください。
- めっきする前に、ラミニンを神経細胞培養培地で洗浄してください。
2. 神経培養めっき
- 解別運動ニューロン培養
- ストレートハサミと細かい鉗子を使用して、E12.5 ICR-HB9::GFPマウス胚から脊髄を解剖する。1% ペニシリンストレプトマイシン (P/S) を使用した 1X HBSS ソリューションでの作業 (図 3A-C)。
- マイクロディションハサミを使用して、髄膜と後角を取り除く(図3D)。
- 脊髄片を収集し、1 mL HBSS + 1% P/Sでチューブ(#1)に移します。
- 湾曲したはさみを使用して小片に脊髄をカットし、ピースが落ち着くのを待ちます。
- トリプシンを2.5%10μL加え、37°Cの水浴に10分間入れます。5分後、チューブをタップして混ぜます。ピースはらせんのような塊を形成する必要があります。
- 塊を、800 μLのプレウォームL-15、BSA 4%の100 μL、10mg/mL DNaseの100 μLを含む新しいチューブ(#2)に移します。2倍を挽き、2分待って解き放たれない部分を落ち着かせる。上清を新しいチューブ(#3)に移す。
- BSA 4%の100 μL、10 mg/mL DNaseの20 μL、および900 μLの完全な神経基底培地を加える(CNB、材料表および表1を参照)。8倍を挽いて2分待つ. 管#3に上清を集める.
- ステップ 2.1.7 を繰り返し、10 倍の粉砕を行います。チューブ#3に上清を収集します。少量の組織は、チューブの底部に残す必要があります。
注: 大きな束がチューブ#2の下部に残っている場合は、手順 2.1.8 を繰り返します。 - BSA 4%クッションの1 mLをチューブ#3の底に加えます。
- 400 x gで遠心分離機 5分間. 上清を捨てます。
- 細胞ペレットを軽くタップして再懸濁し、CNB培地を1mL加えます。ピペット6倍、10mg/mL DNaseの20 μLを加えます。
- CNB培地の追加5 mLを補い、新しいチューブに3 mLを移す(#4)。
- 各チューブの底部に10.4%の濃度勾配媒体(表2を参照)を1mLずつ加える(#3と#4)。2 つのインターフェイス間の急激な位相分離が表示されます。
- 室温(RT)で20分間775 x gで遠心分離機。遠心分離は、位相分離の分解を避けるために低レベルに設定する必要があります。
- セルは浮動し、メディア間の曇りの間で表示されます。両方のチューブから細胞を新しいチューブ(#5)に収集し、すでに既に1mL CNB培地を含んでいる。
- CNB培地の4〜6 mLを追加します。
- チューブの底部にBSA 4%クッションの1 mLを加えます。
- 400 x gで 5 分間の遠心分離機 RT. 上清を捨て、CNB培地の 1 mL でペレットを穏やかに再懸濁します。
- セルをカウントします。脊髄当たり0.75-1 x 106 MNの収率が期待される。
注意:腹側脊髄には、運動ニューロン(例えば、インターニューロン)以外の他の神経亜型も含まれています。MNの純度は、解剖中の後部領域の除去およびMN濃縮されたrostral領域に到達する能力に大きく依存する。画像化されたニューロンがMNsであることを保証するために、HB9::GFPマウスのような内因性MNマーカーを持つマウス株の使用をお勧めします。純粋なMN培養(しかし細胞収量の低下に伴う)を達成するために、FACS精製15の使用が可能である。 - MFC で MN 文化を解剖しためっき
- 400 x gで 5 分間遠心して、チャンバーあたり 150,000 MNs を濃縮します。
- 上清を吸引し、リッチな神経基底培地(RNB)で細胞をMFCあたり4μLで穏やかに再懸濁する。RNB は CNB を追加 2% B27 および 25 ng/mL BDNF を補充します。
- 両方のコンパートメントから媒体を取り出し、遠位コンパートメントのウェルに約10 μL相当の少量を残します。それは井戸の周囲の媒体の薄いリングとして現れる。
- 4 μLの細胞をゆっくりとチャンネルにロードします。チャネルの反対側にあるウェルの4 μLを取り出し、ゆっくりとそれらをチャネルに直接ロードして電流を逆にし、チャネル内の細胞密度を最大化します。
- 細胞が10x光顕微鏡を使用してチャネルに入っていることを確認し、さらに培地を添加することなく30分間インキュベーターにチャンバーを入れます。
- 近位および遠位の井戸にRNBの〜10-15 μLをゆっくりと加え、さらに15分間インキュベーターにチャンバーを入れる。
- このインキュベーションに続いて、各ウェルに約75〜80μLのRNBをゆっくりと加えます。
- 解剖されたMN培養の維持
- めっき(DIV1)の翌日、1 μMのシトシンアラビノシド(Ara-C)を添加したRNBで培地を交換し、グリアの成長を阻害する。
- Ara-Cアプリケーション(DIV3)の2日後に、近位コンパートメント(Ara-Cなし)の新鮮なCNB培地で培地を交換します。
- マイクログルーブを介して軸索の交差を強化するために、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)の25 ng/mLおよび25ng/mLの脳由来神経栄養因子(BDNF)を遠位コンパートメントにのみ加える。軸索遠位ウェル(高い体積)と近位井戸の間のウェルあたり少なくとも10 μLの体積勾配を維持します。
- 2 日ごとにメディアを更新します。軸索は遠位で交差するのに4-6日かかる場合があります。
- 脊髄外植培養
- ストレートハサミと細かい鉗子を使用して、E12.5 ICR-HB9::GFPマウス胚から脊髄を解剖する。1% ペニシリンストレプトマイシン (P/S) を使用した 1X HBSS ソリューションでの作業 (図 3A-C)。
- マイクロディションハサミを使用して、髄膜と後角を取り除く(図3D)。
- 脊髄を1mmの厚さの横切り部分に切り取ります(図3E)。MFC の近位コンパートメントからすべてのメディアを廃棄します。
- ピペットを含む単一の脊髄外植を4μLの総体積で拾い上げ、洞窟にできるだけ近い外植体を注入し、側面出口(1mmパンチ)を介して近位から余分な液体を引き出します。外植は近位チャネルに吸い込むべきである。
- 150 μLの脊髄外植培地(SCEX、材料表および表3を参照)を近位ウェルにゆっくりと加えます。
- 脊髄外植培養の維持
- 近位コンパートメントにSCEX培地を追加し、遠位コンパートメントに豊富なSCEX培地(BDNFおよびGDNFの50 ng /mLを有するSCEX)を加えます。遠位ウェル(高い体積)と近位井戸の間のウェルあたり少なくとも15 μLの体積勾配を維持する。
- 2 日ごとにメディアを更新します。軸索が遠位で交差するのに3〜5日かかる場合があります。
3. 軸索輸送 (図 4A)
- ミトコンドリアおよび酸性コンパートメントの標識
- 100 nMミトトラッカーディープレッドFMと100 nMリソトラッカーレッドを含む新鮮なSCEX培地(または解約MNのためのCNB)を準備します。37°Cで30〜60分間インキュベートします。他の色は、蛍光色素が重ならない限り使用できます。
- 3倍の温かいCNB/SCEX培地で洗います。プレートはイメージングの準備ができています。
- ライブイメージング
- 3秒間隔で軸索輸送の100タイムラプス画像シリーズを取得し、映画1つにつき合計5分。
注:この研究で使用されたイメージングシステムには、プロプライエタリセルイメージングソフトウェア、60xオイルレンズ、NA = 1.4、EMCCDカメラを介して制御された回転ディスク共焦点を搭載した反転顕微鏡が含まれていました。映画は37°Cと5%CO2で制御された環境で2取得しました。
メモ:実験に応じて、より長いまたは短いタイムラプスムービーを画像化することができます。一晩でも映画は必要に応じて記録することができます。しかし、映画の撮影中に光毒性と漂白を減らすために、露出時間とレーザーパワー、および総画像数を減らすことが重要です。
- 3秒間隔で軸索輸送の100タイムラプス画像シリーズを取得し、映画1つにつき合計5分。
4. 画像解析(図4-5)
- キモグラフ解析による粒子輸送分布と密度の解析
- フィジーでファイルを開きます。画像を押すチャンネルを分離する |スタック |ツール |デインターリーブ.
- [イメージ|プロパティ:
- 線分のアイコンを右クリックして、セグメント線ツールを選択します。[線アイコン] をダブルクリックして幅を 8 ~10 に設定します。解析全体を通して同じ線幅と一致する。
- 軸索のパスに沿って、遠位から近位までのセグメント線をマークします。ダブルクリックして、ライン マーキングを停止します。
- [T]をクリックして、新しいライン領域 (ROI) をROI マネージャに追加します。スプレッドシート分析テーブルに追加します。
- 軸索の面積と長さを測定するには、mをクリックします。これを分析テーブルに追加します。
- プラグインをクリックして、キモグラフを生成する |キモツールボックス |キモを描く.あるいは、利用可能な他のカイモグラフ生成プラグインを使用することもできます。
- 手動で移動(逆行または進入)および非移動粒子をカウントし、正しい列のテーブルに追加します。
注:パーティクルは、移動する移動方向(すなわち、キモグラフで左に移動する)または逆行(すなわち、右に移動)に分類されます(すなわち、移動は、特定の方向に10μmよりも高い場合)。線アイコンで水平線をマークし、mを押すだけで変位を測定することができます。不移動粒子または変位基準を満たさない粒子は、非移動と定義される(図4B)。
- 単一粒子追跡: 手動追跡
- フィジーソフトウェア(ファブリスP.コーデレールによって開発された)のマニュアル追跡プラグインをhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlからダウンロード
- フィジー/イメージJでファイルを開きます。MFC の溝を水平方向に配置するには、[回転]オプションを使用します。
- 必要に応じて信号対雑音比を改善するには、プロセス |背景を減算する 。
- 手動追跡プラグインを開きます。イメージングに使用する特定の顕微鏡に従って、パラメータ(例えば、ピクセルサイズ、時間間隔など)を設定します。ここに示す結果については、顕微鏡とレンズの比率は0.239μm/ピクセルで、フレーム間隔は3秒でした。
- トラック X 座標と Y 座標を取得し、テキストをスプレッドシートにコピーして結果を保存します。
- [画像|色 |チャンネルを結合してチャンネルをマージし、その後、一部のパンクのみを追跡します。
- 単一粒子追跡: 半自動追跡 (図 5)
- 解析ソフトウェアを開きます。この研究では、ビットプレーンイマリスソフトウェアバージョン8.4.1を使用しました。
- トップメニューで「超える」に切り替えます。
- [画像処理 |スワップ時間とZ |OK.
- [編集 |イメージプロパティ (Ctrl+I) |ジオメトリ |ボクセル サイズ行.使用する顕微鏡の設定に従って、イメージプロパティを設定します。
注:ここに表示されるデータの場合、顕微鏡とレンズの比率は0.239 μm/ピクセルでした。 - [すべての等距離] をクリックし、[時間間隔] を変更します。たとえば、間隔として 3 s を使用します。右下の [リセット] ボタンをクリックするか、Ctrl + Bキーを押します。
- 左上に小さな黄色いスポットのアイコンをクリックしてスポットのレイヤーを追加します。左下に、スポットを編集するための新しいメニューが開きます。
- スポット検出が始まるまで、右青矢印を押します。
メモ:ウィンドウの左下にあるフィルタを使用して、いくつかのドットを除外することが重要です。ムービーを数回チェックして、十分な数のドットが選択されていることを確認します。 - 実験ニーズに合わせてパラメータを検証または設定します。たとえば、最大距離= 12 μm(2つの異なるスポット間の最大許容距離は、同じ単一のトラックに含まれる)。最大ギャップサイズ= 1 (トラックが見逃し、まだ1トラックと見なされるフレームの数)。
- [設定]をクリックし、[スタイルのトラック ] をクリックします 。 Points = Sphere
- フィルターバーを使用して、調整用に別のフィルターを選択します。たとえば、ここで提供されるデータでは、トラックの継続時間= 9 は、3 フレーム未満のすべてのトラックを削除します。すべてのパラメータを設定したら、右緑の矢印をクリックします。この手順の後、それ以上の編集はできません。
- [ドット付きの小さな鉛筆]をクリックすると、すべてのトラックを手動で編集できます。
- ムービーを表示します (図 5B)。エラーが発生した場合、いくつかのオプションが考えられます。
- トラックを切断するには、[オブジェクト] オプションをクリックし、Ctrl キーを押したまま切断する必要がある 2 つのスポットを選択し、[切断] を選択します。
- トラックを接続するには、[オブジェクト] オプションをクリックし、Ctrl キーを押したまま接続する必要がある 2 つのスポットを選択し、[接続] を選択します。
- トラックまたはスポットを削除するには、右のオプション (トラック/オブジェクト) を使用して、標準の鉛筆アイコンで画面に切り替え、削除を選択します。
- スポットを手動で追加するには、標準の鉛筆アイコン画面に切り替えます。画面の下部には、手動追跡マークがあります。[自動接続] チェックボックスがVであることを確認します。ムービー自体でスポットを追加するには、Shiftキーを押しながら左クリック を押します。
- 既存のトラックにスポットを追加するには、目的のトラック(黄色)とフレームを選択し、通常の鉛筆アイコンスクリーンに切り替えて、スポットを手動で追加します。ムービー全体が完成したら、赤いグラフに似たアイコン (統計)に切り替えます。解析されたパラメータは後で編集できます。編集するには、画面左下のスウェーデンのキーアイコンを押します。たとえば、位置 X、位置 Y。
- いくつかのフロッピーディスクのように見えるアイコンを押して、すべての統計をエクスポートします。
注: スプレッドシートの出力は、直接処理するか、または要求時に共有されるこの分析に使用される公開コード9を使用して、さらに分析することができます。解析から抽出されるパラメータは、速度、変位の追跡、実行の長さ、速度(方向を含む)、ストップ数、平均ストップ期間、アルファ、方向の変化、および瞬時速度です。各パラメータの詳細な説明はGluskaら9に記載されています。
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Representative Results
記載されたプロトコルに従って、マウス胚性HB9::GFP脊髄外植体をMFCで培養した(図4A)。エクスプラントは、軸索が完全に遠位コンパートメントに交差したときに、7日間成長しました。ミトトラッカーディープレッドとライソトラッカーレッド染料は、ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付けるために遠位および近位コンパートメントに追加されました(図4C)。遠位溝の軸索を画像化し、動画を次のように分析した:まず、キモグラフ解析を用いて一般的な動き分布を比較した(図4B,D)。この分析は、酸性コンパートメントでのみ逆行方向のバイアスを明らかにしました(非移動 = 77.1 ± 9.5%;逆行= 16.9 ±8.3%、前向性= 6 ± 5%;図4E)がミトコンドリア輸送(非移動=83.4±6.8%;逆行=10.5±6.9%;前向き=6.8±5.1%;図4F)。キモグラフ分析は粒子密度を定量化するために使用され、HB9の酸性コンパートメントと比較してミトコンドリア粒子の数が多いことが明らかになりました::GFP脊髄外植軸索(ミトコンドリア= 0.46 ± 0.13;酸性コンパートメント = 0.3 ± 0.07粒子/μm軸索、図4G)。
次に、半自動化ソフトウェアを使用した単一粒子輸送解析を行い、その後に社内コードを使用します(図5A-B)。この分析は、一般的に同様の粒子速度を有する(図5C)にもかかわらず、速度の分布を観察する場合(図5D)酸性コンパートメントのみであり、ミトコンドリアは逆行運動に対する偏りを示さなかったことを明らかにした。
図1:シリコーンモールド調製。クロロトリメチルシランウエハクレンジングの手順を説明する模式図。(A)まず、50mLの液体窒素を適当な容器に添加した。化学フードで働く注射器と針を使用して8 mLの液体窒素を引き出しました。シリンジの全含有量をクロロトリメチルシランボトルに注入した。ボトルはキャップを下に向けて回し、8mLのクロロトリメチルシランが引き戻されました。(B)クロロトリメチルシランが容器内に広がる(ウエハ上に直接ない)。容器は、各金型のための5分のインキュベーションに続いて、閉じる必要があります。(C)液体PDMSを所望の高さまで各ウエハに注いだ。(D)全てのプレートを真空デシケーター内に2時間一緒に置き、続いて70°Cのオーブンで3時間ずつ置いた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: MFC 専用デザイン(A)金属メスを使用して金型から取り出したポリマーPDMSテンプレート。(B)実験用の設定に応じて、PDMSテンプレートのパンチングには6mm、7mm、または1mmのパンチャーが使用されました。(C)MFCの外植培養用に7mm、1mmのパンチャーを使用し、20Gシリンジを用いて「洞窟」を作り、外植を容易に挿入した。(D) 解き分け MN 培養 MFC では、チャネルエッジで 4 つのウェルを作成するために 6 mm パンチャーを使用しました。(E-F)CとDに記述されている最終的な MFC 図形の図をそれぞれ示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:神経細胞培養(A)E12.5マウス胚を、神経管を露出させるために頭、尾、および皮膚を取り除いた後の位置に配置した。A(B)脊髄全体の解剖。(C) 優しい鉗子を使って髄を脊髄から剥がした。(D)左パネル: より良いMN精製を得るために腹側脊髄から脊髄側セグメントを除去する。右パネル: MFC で解像された MN カルチャの代表的なイメージ。HB9::GFP軸索は遠位コンパートメント(緑)に交差した。Hoechst染色は、神経核(青色)を示す。(E)腹側脊髄の厚さ1mmの横切片を解剖して発生する脊髄外植。HB9::GFP(緑)脊髄外型軸索の代表的な画像をMFCで示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MNsにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメントの軸索輸送(A) 軸索輸送エッセイの図リソトラッカーレッドとマイトトラッカーディープレッドは、HB9::GFP腹側脊髄外植を含むMFCの近位および遠位コンパートメントの両方に追加されました。(B)キモグラフ分析。移動粒子は、その方向に10μm以上の変位後の移動前行または逆行と定義された。回転粒子または不移動粒子は非移動としてカウントされた。スケールバー= 10 μm. (C) プライマリHB9を表示するタイムラプス映画の最初のフレーム::GFPマウスマウス脊髄は、酸性コンパートメントにタグを付けるためにリソトラッカーレッドで染めたマウス脊髄外葉軸索とミトトラッカーディープレッドにタグ付けミトコンドリア。スケールバー=10μm(D)酸性コンパートメントとミトコンドリアの典型的な軸索運動を示す代表的なキモグラフ。Dスケールバー= 10 μm(E)ミトコンドリア軸索輸送のキモグラフ分析, ****p < 0.0001, ホルムシダック補正付きアノバ (n = 77 軸索).スケールバー= 10 μm(F)酸性コンパートメント軸索輸送のキモグラフ分析, ** p < 0.01, ****p < 0.0001, ホルムシダック補正付きアノバ (n = 77 軸索).(G) ミトコンドリア及び酸性コンパートメントの軸索粒子密度分析、****p< 0.0001、学生のt検定(n = 77軸索)エラー バーは SD の値を表します。
図5:オルガネラ速度を測定する半自動単一粒子分析。(A) 半自動単一粒子輸送解析のスケマティック ワークフロー。(B)腹側脊髄外葉軸索を単一粒子追跡について分析した。分析ソフトウェアは、ミトコンドリア(黄色の点、上パネル)および酸性コンパートメント(緑色のドット、下部パネル)に示されるように、タイムラプスムービー内の単一の軸索粒子を追跡することができます。(C)ミトコンドリアと酸性コンパートメントの間で平均速度が変化しなかった、マンホイットニー試験(n = 417ミトコンドリア、n = 371酸性コンパートメント)。誤差範囲は、SD(D)Dミトコンドリアと酸性コンパートメントの逆行および前向きの速度の分布を持つ値を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 完全な神経基底培地 - 50mL | ||
| 成分 | ボリューム | 濃度 |
| 神経基底 | 47mL | |
| B27 | 1 mL | 2% |
| 馬の血清 | 1 mL | 2% |
| P/S | 0.5 mL | 1% |
| L-グルタミン (グルタマックス) | 0.5 mL | 1% |
| ベータ-メルカプトエタノール (50mM) | 25 μL | 25μM |
| BDNF (10ug/mL) | 5 μL | 1ng/mL |
| GDNF (10ug/mL) | 5 μL | 1ng/mL |
| CNTF (10ug/mL) | 2.5 μL | 0.5ng/mL |
表1:完全な神経基底(CNB)溶液の調製のためのレシピ。
| オプティプレップソリューション – 10mL用 | ||
| 成分 | ボリューム | 濃度 |
| DDW | 5.27 mL | |
| 密度グラデーション培地(オプティプレップ) 60% | 1.73 mL | 10.4% (w/v) |
| トリシン100mM | 1 mL | 2% |
| グルコース 20% (w/v) | 2 mL | 2% |
表2:密度勾配培地溶液の調製のためのレシピ。
| 脊髄外植培地 (SCX) – 20mL | ||
| 成分 | ボリューム | 濃度 |
| 神経基底 | 19.5 mL | |
| B27 | 200 μL | 2% |
| P/S | 100 μL | 1% |
| L-グルタミン (グルタマックス) | 100 μL | 1% |
| Bdnf | 50 μL | 25ng/mL |
表3:脊髄外植(SCEX)溶液の調製のためのレシピ。
| MNカルチャー | 脊髄外植 |
| めっき前の手続きが長くなる | 短いプロシージャ – 解剖とプレート |
| MFC でのめっきに必要な特別な注意 | MFC でのプレートの作成が容易 |
| グリア細胞のない運動ニューロンの高濃度 – より正確 | グリア細胞および他の神経細胞タイプの存在 – より生理学的 |
| 相馬と軸索の両方で無制限の操作の可能性 | 細胞体に対する限定的な操作の可能性 |
| 細胞体と軸索の両方に対する容易な免疫染色 | 外植体内の細胞体の免疫染色時の効率が低い。 |
| ウイルス感染の高効率 | ウイルス感染の非常に低い効率 |
表4:速度、実現可能性、グリア存在、操作可能性、免疫染色、およびウイルス感染の周囲に基づく脊髄外植と解剖MN培養の比較。
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Discussion
本プロトコルでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメントの軸索輸送を追跡するシステムについて述べている。この簡素化されたin vitroプラットフォームにより、細胞下の神経区画の精密な制御、監視、操作が可能になり、運動ニューロン局所機能の実験的解析が可能になります。このプロトコルは、ALSなどのMN疾患を研究するのに有用であり、疾患10,16,16における軸索輸送機能障害の基礎的なメカニズムを理解することに焦点を当てる。また、このシステムは、栄養因子99、16、microRNA1610、mRNA8、および健康および疾患を有するMNsまたは感覚9または交感神経軸索などの他のニューロンにおける標識タンパク質の輸送の研究に適用することもできる。同様の方法は、骨格筋細胞12で培養されたMNや心筋細胞14と共培養した交感神経のような共培養系におけるオルガネラ輸送の研究にも適用できる。MFCシステムを利用して、アクティブNMJ17、18を18生成し、軸索輸送16に対するシナプス形成の効果を研究することができる。
このプロトコルは、MFCでニューロンを培養し、軸索輸送を分析するためにライブイメージングを使用する他のプロトコルと比較していくつかの利点を有する:1)MFCは、いくつかのメーカーによって市販されている。しかし、MFCの自己製造は、商業的な代替手段に比べて非常に費用対効果が高い。1つのPDMSウエハは、PDMS樹脂自体に対して数米ドルの費用を最小限に抑え、4つの大きなMFCまたは9つの小さなMFCを生成します。2)自己製造されたMFCは、特定の実験ニーズに答えるために変更することができます(例えば、ウェルのサイズと位置を変更し、MFC PDMSの厚さを増やします)。3)MFCは(プラズマ結合によって)プレートに取り付け不可逆的にすることができるが、また、汚染の可能性を減らすために複数回リサイクルすることができる。4)PDMS MFCは透明であり、信号対雑音の区別が制限要因となり得る軸索輸送アッセイにとって重要な背景を減らすことによってライブイメージングに最適です。5)脊髄外植培養は非常に効率的かつ迅速である。1つの胚性脊髄は、10個のMFCに十分な30の外植を生み出すことができる。これは時間と材料を節約するのに役立ち、胚の少ない妊娠中のマウスでさえ実験を成功させることができます。表4の脊髄外植と解別MN培養の詳細な比較を参照してください。
このプロトコルは比較的簡単で安価です。しかし、いくつかの技術的な問題に関する専門知識が必要です。MFC の製造と取り扱いは、構造上の欠陥や、例えば必須の真空ステップ (1.1.10) で気泡が発生するのを避けるために、正確で、穏やかである必要があります。オプションの真空ステップ(1.6.2)では、すべての空気をクリアすることが重要であるか、軸索交差をブロックしますが、また、ガラスからMFCの切り離しを避けるために真空を短く保ちます。髄膜と後ろ目の角を適切に取り除くこと、および物理的な力を使わずにMFCの洞窟に挿入するために、適切なサイズに作品をカットすることが重要であるため、解剖プロトコルの手順に細心の注意を払ってください。MFC に適用される過度の物理的な力は、簡単に溝や MFC 全体をデタッチできます。Mは、メッキ工程の中量が少ないなどのストレス条件下で凝集し、すぐに生存率を失う傾向にあるため、MNsの培養とMFCでのめっきは比較的迅速である必要があります。MFCのメッキは、MFCチャネル内のニューロンの適切なアタッチメントを可能にするために少量で行われるべきであり、30分以下の温め培地の後は、MNsの剥離を防ぐために非常に穏やかに添加する必要があります。
培養で数日後、軸索が遠位コンパートメントに拡張されると、培養物はオルガネラ染色を受け、続いて軸索輸送映画の取得と画像分析のための特定の手順を受ける準備が整いました。分析は、時間の経過に伴う単一のパーティクル トラッキング、または自動または半自動の追跡アルゴリズムを使用して実行できます。今回の経験では、自動化された方法は時間のかかる時間は少なくなりますが、いくつかの欠点があります。主に、自動追跡の信頼性は、パスを横断する混雑した軸索で、減少します。さらに、自動化されたアルゴリズムは、重複する粒子を区別する能力が低下しています。したがって、手動または半自動追跡を実行することをお勧めします。一般に、半自動追跡は時間のかかる時間が少ないことから望ましいですが、利用可能な有料ソフトウェアがない場合は手動追跡が適しています。手動分析と自動分析の完全な比較はGluskaら9. にあります。
結論として、この単純なプロトコルを採用することは、様々な細胞成分の軸索輸送の研究のための重要なデータを得ることができます。これは、イメージングセットアップとニューロンサブタイプの多様性に適合するように、ならびに他の細胞とニューロンの共存培養に適応することができる。また、神経の健康の基本的なメカニズムを理解し、変わった軸索輸送を伴う疾患の薬剤開発を改善するために、細胞体または軸索の明確な空間的薬理学的操作を可能にする。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、イスラエル科学財団(ISF、561/11)と欧州研究評議会(ERC、309377)からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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