Axonal transport er en avgjørende mekanisme for motor neuron helse. I denne protokollen gir vi en detaljert metode for sporing av aksonaltransport av sure rom og mitokondrier i motorneuronaksoner ved hjelp av mikrofluidiske kamre.
Motorneuroner (MN) er svært polariserte celler med svært lange aksoner. Axonal transport er en avgjørende mekanisme for MN helse, bidrar til nevronal vekst, utvikling, og overlevelse. Vi beskriver en detaljert metode for bruk av mikrofluidiske kamre (MfCer) for sporing av aksonal transport av fluorescerende merkede organeller i MN-aksoner. Denne metoden er rask, relativt billig, og gjør det mulig å overvåke intracellulære signaler i rom og tid. Vi beskriver en trinnvis protokoll for: 1) Fabrikasjon av polydimethylsiloxane (PDMS) MfCer; 2) Plating av ventral ryggmarg eksplanter og MN dissosiert kultur i MfCer; 3) Merking av mitokondrier og sure rom etterfulgt av live confocal imagining; 4) Manuell og halvautomatisk aksonal transportanalyse. Til slutt viser vi en forskjell i transport av mitokondrier og sure rom av HB9::GFP ventral ryggmargutplante aksoner som et bevis på systemets gyldighet. Til sammen gir denne protokollen et effektivt verktøy for å studere aksonaltransport av ulike aksonale komponenter, samt en forenklet håndbok for MFC-bruk for å bidra til å oppdage romlige eksperimentelle muligheter.
MN er svært polariserte celler med lange aksoner, og når opptil en meter lang hos voksne mennesker. Dette fenomenet skaper en kritisk utfordring for vedlikehold av MN-tilkobling og funksjon. Følgelig er MN-er avhengige av riktig transport av informasjon, organeller og materialer langs aksonene fra cellekroppen til synapse og tilbake. Ulike cellulære komponenter, som proteiner, RNA og organeller blir transportert regelmessig gjennom aksonene. Mitokondrier er viktige organeller som rutinemessig transporteres i MN. Mitokondrier er avgjørende for riktig aktivitet og funksjon av MN, ansvarlig for ATP-bestemmelse, kalsiumbufring og signalprosesser1,2. Aksonaltransport en mitokondrier er en godt studert prosess3,4. Interessant, feil i mitokondrietransport ble rapportert å være involvert i flere nevrodegenerative sykdommer og spesielt i MN sykdommer5. Sure rom tjener som et annet eksempel for iboende organeller som beveger seg langs MN-aksoner. Sure rom inkluderer lysosomer, endosomer, trans-Golgi apparat, og visse sekretoriske vesikler6. Defekter i aksonal transport av sure rom ble funnet i flere nevrodegenerative sykdommer samt7, og nyere papirer fremhever deres betydning i MN sykdommer8.
For å effektivt studere aksonal transport, mikrofluidiske kamre som skiller somatiske og aksonale rom er ofte brukt9,,10. De to betydelige fordelene med det mikrofluidiske systemet, og compartmentalization og isolering av aksoner, gjør det ideelt for studiet av subcellulære prosesser11. Den romlige separasjonen mellom nevronale cellelegemer og aksoner kan brukes til å manipulere de ekstracellulære miljøene i forskjellige nevronale rom (f.eks. aksoner vs. soma). Biokjemisk, nevronal vekst/degenerasjon, og immunofluorescens analyser er alle fordeler fra denne plattformen. MfCer kan også hjelpe til med å studere celle-til-celle-kommunikasjon ved å coculturing nevroner med andre celletyper, for eksempel skjelettmuskler12,,13,14.
Her beskriver vi en enkel, men presis protokoll for overvåking av mitokondrier og sur romtransport i motornevroner. Vi viser videre bruken av denne metoden ved å sammenligne den relative prosentandelen av retrograd og anterograde bevegelige organeller, samt fordelingen av transporthastighet.
I denne protokollen beskriver vi et system for å spore aksonal transport av mitokondrier og sure rom i motoriske nevroner. Denne forenklede in vitro-plattformen tillater nøyaktig kontroll, overvåking og manipulering av subcellulære nevronale rom, noe som muliggjør eksperimentell analyse av motorneuron lokale funksjoner. Denne protokollen kan være nyttig for å studere MN sykdommer som ALS, for å fokusere på å forstå den underliggende mekanismen for aksonal transport dysfunksjon i sykdommen10</…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Israel Science foundation (ISF, 561/11) og Det europeiske forskningsrådet (ERC, 309377).
35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
FIJI software | ImageJ | ||
GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
iQ software | Andor | ||
Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |