Summary

Axonaler Transport von Organellen in Motorneuronenkulturen mit Mikrofluidic Chambers System

Published: May 05, 2020
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Summary

Der axonale Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die Gesundheit des motorischen Neurons. In diesem Protokoll bieten wir eine detaillierte Methode zur Verfolgung des axonalen Transports von sauren Kompartimenten und Mitochondrien in motorischen Neuronaxonen mit mikrofluidischen Kammern.

Abstract

Motorneuronen (MNs) sind hochpolarisierte Zellen mit sehr langen Axonen. Axonaler Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die MN-Gesundheit und trägt zu neuronalen Wachstum, Entwicklung und Überleben bei. Wir beschreiben eine detaillierte Methode zur Verwendung von mikrofluidischen Kammern (MFCs) zur Verfolgung des axonalen Transports von fluoreszierend markierten Organellen in MN-Axonen. Diese Methode ist schnell, relativ kostengünstig und ermöglicht die Überwachung intrazellulärer Hinweise in Raum und Zeit. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für: 1) Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) MFCs; 2) Beschichtung von ventralen Rückenmarksexaten und MN dissoziierte Kultur in MFCs; 3) Kennzeichnung von Mitochondrien und sauren Kompartimenten, gefolgt von einer lebendigen konfokalen Vorstellung; 4) Manuelle und halbautomatische axonale Transportanalyse. Schließlich zeigen wir einen Unterschied im Transport von Mitochondrien und sauren Kompartimenten von HB9::GFP ventrale Rückenmarks-Explantationsaxone als Beweis für die Systemgültigkeit. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung des axonalen Transports verschiedener axonaler Komponenten sowie ein vereinfachtes Handbuch für die MFC-Nutzung, um räumliche experimentelle Möglichkeiten zu entdecken.

Introduction

MNs sind hochpolarisierte Zellen mit langen Axonen, die bei erwachsenen Menschen bis zu einem Meter lang sind. Dieses Phänomen stellt eine kritische Herausforderung für die Aufrechterhaltung der MN-Konnektivität und -Funktion dar. Folglich sind MNs auf den richtigen Transport von Informationen, Organellen und Materialien entlang der Axone von ihrem Zellkörper zur Synapse und zurück angewiesen. Verschiedene zelluläre Komponenten, wie Proteine, RNA und Organellen werden regelmäßig durch die Axone transportiert. Mitochondrien sind wichtige Organellen, die routinemäßig in MNs transportiert werden. Mitochondrien sind essentiell für die richtige Aktivität und Funktion von MNs, verantwortlich für ATP-Versorgung, Kalziumpufferung und Signalisierungsprozesse1,2. Der axonale Transport von Mitochondrien ist ein gut untersuchter Prozess3,4. Interessanterweise wurden Defekte im mitochondrialen Transport berichtet, dass sie an mehreren neurodegenerativen Erkrankungen und speziell an MN-Erkrankungen beteiligt waren5. Saure Fächer dienen als weiteres Beispiel für intrinsische Organellen, die sich entlang von MN-Axonen bewegen. Saure Kompartimente umfassen Lysosomen, Endosomen, Trans-Golgi-Apparate und bestimmte sekretole Vesikel6. Defekte im axonalen Transport von sauren Kompartimenten wurden bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen sowie7gefunden, und neuere Papiere unterstreichen ihre Bedeutung bei MN-Erkrankungen8.

Zur effizienten Untersuchung des axonalen Transports werden häufig mikrofluidische Kammern verwendet, die somatische und axonale Kompartimente trennen9,10. Die beiden wesentlichen Vorteile des mikrofluidischen Systems und die Abschottung und Isolierung von Axonen machen es ideal für die Untersuchung subzellulärer Prozesse11. Die räumliche Trennung zwischen den neuronalen Zellkörpern und Axonen kann verwendet werden, um die extrazellulären Umgebungen verschiedener neuronaler Kompartimente (z. B. Axone vs. Soma) zu manipulieren. Biochemische, neuronale Wachstum/Degeneration und Immunfluoreszenz-Assays profitieren alle von dieser Plattform. MFCs können auch bei der Untersuchung der Zell-zu-Zell-Kommunikation helfen, indem sie Neuronen mit anderen Zelltypen kokultieren, wie Skelettmuskeln12,13,14.

Hier beschreiben wir ein einfaches, aber präzises Protokoll zur Überwachung von Mitochondrien und sauren Kompartimententransporten in motorischen Neuronen. Wir zeigen die Anwendung dieser Methode weiter, indem wir den relativen Prozentsatz der retrograden und anterogradbewegten Organellen sowie die Verteilung der Transportgeschwindigkeit vergleichen.

Protocol

Die Pflege und Behandlung von Tieren in diesem Protokoll wurden unter der Aufsicht und Genehmigung des Tel Aviv University Committee for Animal Ethics durchgeführt. 1. MFC-Vorbereitung PDMS-Guss in Primärformen (Abbildung 1) Kauf oder Erstellung von Primärformen (Wafern) nach einem detaillierten Protokoll9. Verwenden Sie Druckluft, um jede Art von Schmutz von der Waferplattform zu entfernen, bevor Sie mit dem…

Representative Results

Nach dem beschriebenen Protokoll wurden Mausembryonale HB9::GFP Rückenmarksexplantationen in MFC kultiviert (Abbildung 4A). Die Explants wurden 7 Tage lang angebaut, als Axone vollständig in das distale Fach gelangten. Mitotracker Deep Red und Lysotracker Rote Farbstoffe wurden den distalen und proximalen Fächern hinzugefügt, um die Mitochondrien und sauren Fächer zu kennzeichnen (Abbildung 4C</stron…

Discussion

In diesem Protokoll beschreiben wir ein System zur Verfolgung des axonalen Transports von Mitochondrien und sauren Kompartimenten in motorischen Neuronen. Diese vereinfachte In-vitro-Plattform ermöglicht eine präzise Steuerung, Überwachung und Manipulation subzellulärer neuronaler Kompartimente und ermöglicht eine experimentelle Analyse der lokalen Funktionen des motorischen Neurons. Dieses Protokoll kann nützlich sein, um MN-Erkrankungen wie ALS zu studieren, um sich auf das Verständnis des zugrunde liegenden Mec…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Israel Science Foundation (ISF, 561/11) und des Europäischen Forschungsrates (ERC, 309377) unterstützt.

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

References

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Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

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