Summary

Transport axonal des Organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé des neurones moteurs. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode détaillée pour suivre le transport axonal des compartiments acides et des mitochondries dans les axones des neurones moteurs à l’aide de chambres microfluidiques.

Abstract

Les neurones moteurs (MNs) sont des cellules fortement polarisées avec de très longs axones. Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé de MN, contribuant à la croissance neuronale, au développement, et à la survie. Nous décrivons une méthode détaillée pour l’utilisation des chambres microfluidiques (MFC) pour le suivi du transport axonal des organites étiquetés fluorescents dans les axones MN. Cette méthode est rapide, relativement peu coûteuse, et permet la surveillance des indices intracellulaires dans l’espace et le temps. Nous décrivons un protocole étape par étape pour : 1) Fabrication de MFC en polydiméthylsiloxane (PDMS); 2) Le plating des explantations ventrales de moelle épinière et de la culture dissociée de MN dans les CFC ; 3) Étiquetage des mitochondries et des compartiments acides suivis de l’imagination confocale vivante; 4) Analyse de transport axonal manuelle et semi-automatique. Enfin, nous démontrons une différence dans le transport des mitochondries et des compartiments acides de HB9::GFP ventrale moelle épinière explant axones comme une preuve de la validité du système. Au total, ce protocole fournit un outil efficace pour étudier le transport axonal de divers composants axonaux, ainsi qu’un manuel simplifié pour l’utilisation de MFC pour aider à découvrir les possibilités expérimentales spatiales.

Introduction

Les MN sont des cellules fortement polarisées avec de longs axones, atteignant jusqu’à un mètre de long chez les humains adultes. Ce phénomène crée un défi critique pour le maintien de la connectivité et de la fonction MN. Par conséquent, les MN dépendent d’un bon transport d’informations, d’organites et de matériaux le long des axones de leur corps cellulaire à la synapse et au dos. Divers composants cellulaires, tels que les protéines, l’ARN et les organites, sont transportés régulièrement à travers les axones. Les mitochondries sont des organites importants qui sont systématiquement transportés dans les MN. Les mitochondries sont essentielles pour une activité et une bonne fonction des MN, responsables de la fourniture de l’ATP, de la mise en mémoire tampon du calcium et des processus de signalisation1,,2. Le transport axonal des mitochondries est un processus bien étudié3,4. Intéressant, des défauts dans le transport mitochondrial ont été rapportés pour être impliqués dans plusieurs maladies neurodégénératives et spécifiquement dans les maladies de MN5. Les compartiments acides servent d’autre exemple pour les organites intrinsèques qui se déplacent le long des axones MN. Les compartiments acides comprennent les lysosomes, les endosomes, l’appareil trans-Golgi, et certaines vésicules sécrétrices6. Des défauts dans le transport axonal des compartiments acides ont été trouvés dans plusieurs maladies neurodégénératives aussi bien7, et les articles récents soulignent leur importance dans les maladies de MN8.

Pour étudier efficacement le transport axonal, les chambres microfluidiques qui séparent les compartiments somatiques et axonaux sont fréquemment utilisées9,10. Les deux avantages significatifs du système microfluidique, et la compartimentation et l’isolement des axones, le rendent idéal pour l’étude des processus subcellulaires11. La séparation spatiale entre les corps des cellules neuronales et les axones peut être utilisée pour manipuler les environnements extracellulaires de différents compartiments neuronaux (p. ex., axones vs soma). Les essais biochimiques, neuronaux de croissance/dégénérescence et d’immunofluorescence bénéficient tous de cette plate-forme. Les IMF peuvent également aider à étudier la communication de cellule à cellule en cocultant des neurones avec d’autres types de cellules, tels que les muscles squelettiques12,13,14.

Ici, nous décrivons un protocole simple mais précis pour surveiller les mitochondries et le transport de compartiment acide dans les neurones moteurs. Nous montrons en outre l’utilisation de cette méthode en comparant le pourcentage relatif d’organites mobiles rétrogrades et antérgrades, ainsi que la répartition de la vitesse de transport.

Protocol

Les soins et le traitement des animaux dans ce protocole ont été effectués sous la supervision et l’approbation du Comité universitaire d’éthique animale de l’Université de Tel Aviv. 1. Préparation MFC PDMS coulé dans les moules primaires (Figure 1) Acheter ou créer des moules primaires (gaufrettes) suivant un protocole détaillé9. Utilisez de l’air pressurisé pour enlever tout type de saleté…

Representative Results

Suivant le protocole décrit, souris embryonnaire HB9::GFP épidullaires explants ont été cultivés dans MFC (figure 4A). Les explantations ont été cultivées pendant 7 jours, quand les axones ont complètement traversé dans le compartiment distal. Mitotracker Deep Red et Lysotracker Des colorants rouges ont été ajoutés aux compartiments distal et proximal afin d’étiqueter les mitochondries et les compartiments acides<strong class=…

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons un système pour suivre le transport axonal des mitochondries et des compartiments acides dans les neurones moteurs. Cette plate-forme in vitro simplifiée permet un contrôle précis, la surveillance et la manipulation des compartiments neuronaux subcellulaires, permettant l’analyse expérimentale des fonctions locales des neurones moteurs. Ce protocole peut être utile pour étudier les maladies de MN telles que la SLA, pour se concentrer sur la compréhension du mécanisme sous-jac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation israélienne pour la science (ISF, 561/11) et du Conseil européen de recherches (ERC, 309377).

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

References

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Cite This Article
Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

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