Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van het vermogen van kankercellen om te migreren en binnen te vallen onder verschillende behandelingsvoorwaarden is cruciaal voor het beoordelen van therapeutische strategieën. Dit protocol presenteert een methode om de real-time gemetastaseerde vermogens van een glioblastoom kanker cellijn te beoordelen.
Kanker ontstaat als gevolg van ongecontroleerde proliferatie van cellen geïnitieerd door genetische instabiliteit, mutaties, en milieu-en andere stressfactoren. Deze verworven afwijkingen in complexe, meerlaagse moleculaire signaleringsnetwerken veroorzaken afwijkende celproliferatie en overleving, extracellulaire matrixafbraak en metastase naar verre organen. Naar schatting wordt ongeveer 90% van de sterfgevallen ten gevolge van kanker veroorzaakt door de directe of indirecte effecten van de uitgezaaide verspreiding. Daarom is het belangrijk om een zeer betrouwbaar, uitgebreid systeem op te zetten om het gedrag van kankercellen te karakteriseren bij genetische en milieumanipulaties. Een dergelijk systeem kan een duidelijk inzicht geven in de moleculaire regulatie van kankermetastase en de mogelijkheid voor een succesvolle ontwikkeling van gelaagde, nauwkeurige therapeutische strategieën. Vandaar, nauwkeurige bepaling van kankercel gedrag zoals migratie en invasie met winst of verlies van functie van gen(en) maakt beoordeling van de agressieve aard van kankercellen. Het real-time meetsysteem op basis van celimpedantie stelt onderzoekers in staat om tijdens een heel experiment voortdurend gegevens te verzamelen en de resultaten direct te vergelijken en te kwantificeren onder verschillende experimentele omstandigheden. In tegenstelling tot conventionele methoden vereist deze methode geen fixatie, kleuring en monsterverwerking om cellen te analyseren die migreren of binnenvallen. Deze methode papier benadrukt gedetailleerde procedures voor real-time bepaling van migratie en invasie van glioblastoom kankercellen.
Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van kanker genotypes en fenotypes is van cruciaal belang voor het begrijpen en ontwerpen van effectieve therapeutische strategieën. Decennia van kankeronderzoek hebben geleid tot de ontwikkeling en aanpassing van verschillende methoden om kankergenotypes en fenotypes te bepalen. Een van de laatste technische ontwikkelingen is real-time meting van celmigratie en invasie op basis van celimpedantie. Celhechting aan substraten en celcelcontacten speelt een belangrijke rol bij cel-naar-cel communicatie en regulatie, ontwikkeling en onderhoud van weefsels. Afwijkingen in celhechting leiden tot het verlies van celcelcontact, afbraak van extracellulaire matrix (ECM) en winst van migratie- en binnenvallende vermogens door cellen, die allemaal bijdragen aan metastase van kankercellen naar verschillende organen1,2. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om celmigratie (wondgenezing en Boyden-kamertesten) en invasie (Matrigel-Boyden kamertest)3,4,5te bepalen. Deze conventionele methoden zijn semikwantitatief omdat cellen moeten worden gelabeld met een fluorescerende kleurstof of andere kleurstoffen, hetzij voor of na het experiment om celfenotypes te meten. Bovendien zijn mechanische verstoringen in sommige gevallen nodig voor het maken van een wond voor het meten van de migratie van cellen naar de wondplaats. Bovendien zijn deze bestaande methoden tijdrovend, arbeidsintensief en meten ze de resultaten op slechts één eenmalig punt. Bovendien zijn deze methoden gevoelig voor het maken van onjuiste metingen als gevolg van inconsistente behandeling tijdens de experimentele procedure6.
In tegenstelling tot conventionele methoden meet het real-time celanalysesysteem celimpedantie in real-time zonder pre- of poststaining en mechanische schade van cellen. Wat nog belangrijker is, kan de duur van een experiment worden uitgebreid zodat de biologische gevolgen op een tijd-afhankelijke manier kunnen worden bepaald. Het uitvoeren van het experiment is tijdefficiënt en niet arbeidsintensief. Het analyseren van gegevens is relatief eenvoudig en nauwkeurig. In vergelijking met andere methoden is deze methode een van de beste real-time metingen om celmigratie en invasie6,7,8,9te meten .
Giaever en Keese waren de eersten die de impedantie-gebaseerde meting van een celpopulatie op het oppervlak van elektroden10beschreven. Het real-time celanalysesysteem werkt volgens hetzelfde principe. Het gebied van elke microplaat put is ongeveer 80% bedekt met een array van gouden micro-elektroden. Wanneer het elektrodeoppervlak door cellen wordt bezet als gevolg van hechting of verspreiding van de cellen, verandert de elektrische impedantie. Deze impedantie wordt weergegeven als de celindex, die direct evenredig is met de cellen die het elektrodeoppervlak bedekken nadat ze het microporeuze membraan binnendringen (de mediane poriegrootte van dit membraan is 8 μm)11.
Crk en CrkL zijn adaptereiwitten die SH2- en SH3-domeinen bevatten en spelen een belangrijke rol in verschillende cellulaire functies, zoals cytoskeletregulatie, celtransformatie, proliferatie, hechting, epitheel-mesenchymale overgang, migratie, invasie en metastase door te bemiddelen eiwit-eiwit interacties in vele signaleringstrajecten1,12,1313,14,15,16,17, 18. Daarom is het belangrijk om de Crk /CrkL-afhankelijke migratie- en invasieve vermogens van kankercellen te bepalen. Real-time celanalyse werd uitgevoerd om de migratie- en invasieve vermogens van glioblastoomcellen te bepalen bij genknockdown van Crk en CrkL.
Deze methode paper beschrijft gedetailleerde metingen van Crk- en CrkL-gemedieerde migratie en invasie van menselijke glioblastoom cellen.
De real-time meting van celmigratie en -invasie met behulp van het real-time celanalysesysteem is een eenvoudig, snel en continu bewakingsproces met meerdere, significante voordelen ten opzichte van de traditionele methoden die gegevens op één enkel tijdspunt leveren. Net als bij de traditionele methoden moeten experimentele omstandigheden worden geoptimaliseerd voor elke cellijn voor het real-time celanalysesysteem, omdat elke cellijn kan verschillen in termen van hechting aan het substraat, de groei, de cel-naar-celc…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Olivia Funk voor haar technische hulp bij de real-time cel analyse systeem gegevens. We danken ook het Medical Writing Center van Children’s Mercy Kansas City voor het bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) en door Children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board financiering (to TP).
Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |