Summary
סרטן היא מחלה קטלנית בשל יכולתה לעבור גרורות לאיברים שונים. קביעת היכולת של תאים סרטניים להגר ולפלוש תחת תנאי טיפול שונים חיונית להערכת אסטרטגיות טיפוליות. פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את היכולות גרורתית בזמן אמת של קו הסרטן הגלינובלסטומה.
Abstract
הסרטן מתעורר בשל התפשטות בלתי מבוקרת של תאים ביוזמת אי-יציבות גנטית, מוטציות, והסביבה גורמי מתח אחרים. אלה מומים שנרכשו ברשתות איתות מולקולריות מורכבות, לגרום להתפשטות והישרדות של תאים חריגה, השפלה מטריצה מרוכזת, גרורות לאיברים רחוקים. כ 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן מוערכים להיגרם על ידי אפקטים ישירים או עקיפים של הפצת גרורות. לכן, חשוב להקים מערכת מאוד אמינה ומקיפה כדי לאפיין את התנהגויות התא של הסרטן על מניפולציות גנטיות וסביבתיות. מערכת כזו יכולה לתת הבנה ברורה של הרגולציה המולקולרית של גרורות סרטן והזדמנות להתפתחות מוצלחת של אסטרטגיות מדויקות וטיפוליות. מכאן, קביעה מדויקת של התנהגויות תא סרטן כגון הגירה ופלישה עם רווח או אובדן של תפקוד של גנים (s) מאפשר הערכה של האופי האגרסיבי של תאים סרטניים. מערכת המדידה בזמן אמת מבוסס על עכבה התא מאפשר לחוקרים לרכוש ללא הרף נתונים במהלך ניסוי שלם ובאופן מיידי להשוות ולכמת את התוצאות בתנאים ניסיוניים שונים. שלא כמו שיטות קונבנציונליות, שיטה זו אינה דורשת קיבעון, כתמים ועיבוד לדוגמה לניתוח תאים העוברים או פולשים. נייר שיטה זה מדגיש הליכים מפורטים לקביעת זמן אמת של הגירה ופלישה של תאים הסרטניים gliנובלסטומה.
Introduction
סרטן היא מחלה קטלנית בשל יכולתה לעבור גרורות לאיברים שונים. קביעת גנוטיפים לסרטן ופנוטיפים הוא קריטי להבנת ולעצב אסטרטגיות טיפוליות אפקטיביות. עשורים של מחקר סרטן הובילו לפיתוח והסתגלות של שיטות שונות כדי לקבוע גנוטיפים הסרטן ופנוטיפים. אחת ההתפתחויות הטכניות העדכנית ביותר היא מדידה בזמן אמת של הגירה התא והפלישה מבוסס על עכבה תאים. הדבקה לתא לסובסטרטים ולאנשי קשר סלולריים ממלאים תפקיד חשוב בתקשורת ורגולציה של תא לתאים, פיתוח ותחזוקה של רקמות. חריגות בתא הדבקה להוביל לאובדן של מגע תא תא, השפלה של מטריקס מסחטות (ecm), ולהשיג יכולות נדידה והפולשים על ידי תאים, אשר כולם תורמים גרורות של תאים סרטניים לאיברים שונים1,2. שיטות שונות זמינים כדי לקבוע את הגירה התא (ריפוי פצע ו-boyden הלשכה הקאמרית) ואת הפלישה (שיטת מטריג'ל-boyden קאמרית)3,4,5. אלה שיטות קונבנציונליות הן חצי כמותית, כי התאים צריכים להיות מתויג עם צבע פלורסנט או צבעים אחרים או לפני או אחרי הניסוי כדי למדוד פנוטיפים תא. בנוסף, יש צורך בהפרעות מכניות במקרים מסוימים ליצירת פצע למדידת הגירה של תאים לאתר הפצע. יתר על כן, שיטות אלה קיימות צורכת זמן, אינטנסיבי עבודה, ולמדוד את התוצאות רק פעם אחת בלבד. בנוסף, שיטות אלה נוטות לבצע מדידות לא מדויקות עקב טיפול לא עקבי במהלך ההליך הניסיוני6.
שלא כמו שיטות קונבנציונליות, מערכת ניתוח התא בזמן אמת מודד העכבה התא בזמן אמת מבלי לדרוש טרום או כתמים ונזק מכני של תאים. וחשוב מכך, ניתן להאריך את משך הניסוי כך שניתן יהיה לקבוע את ההשפעות הביולוגיות באופן תלוי-זמן. ביצוע הניסוי הינו יעיל בזמן ולא מעמיק לעבודה. ניתוח נתונים הוא פשוט יחסית ומדויק. לעומת שיטות אחרות, שיטה זו היא אחת המידות הטובות ביותר בזמן אמת כדי למדוד הגירה תא ופלישה6,7,8,9.
Giaever ו Keese היו הראשונים לתאר את המדידה מבוססת עכבה של אוכלוסיית התא על פני השטח של אלקטרודות10. מערכת ניתוח התא בזמן אמת פועלת על אותו עיקרון. השטח של כל מיקרופלייט היטב הוא כ 80% מכוסה במערך של מיקרואלקטרודות זהב. כאשר שטח האלקטרודה משטח מאוכלס על ידי תאים בשל דבקות או התפשטות של התאים, העכבה החשמלית משתנה. עכבה זו מוצגת כאינדקס התא, אשר ביחס ישיר לתאים המכסים את שטח פני האלקטרודה לאחר שהם חודרים קרום מיקרונקבובי (גודל הנקבובית החציוני של קרום זה הוא 8 μm)11.
Crk ו crk הם מתאם חלבונים המכילים SH2 ו SH3 תחומים ולשחק תפקידים חשובים בפונקציות הסלולר השונות, כגון רגולציה השלד ציטותא, המרת תאים, התפשטות, הדבקה, אפיתל-mesenchymal מעבר, הגירה, פלישה, ו גרורות על-ידי מדיטינג אינטראקציות חלבון,17,14חלבון מסלולים15,16רבים איתות1,12,13 . שמונה עשרה לכן, חשוב לקבוע את Crk/Crk התלוי ביכולות הנדידה פולשנית של תאים סרטניים. בזמן אמת ניתוח התא בוצע כדי לקבוע את היכולות נדידה פולשנית של תאים גלינובלסטומה על הסתרה גן של Crk ו-Crk.
נייר שיטה זה מתאר מדידות מפורטות של הגירה Crk-ו-Crk-תיווך ופלישה של תאים גלינובלסטומה אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל חומרי התרבות התא צריך להיות סטרילי ואת הניסוי כולו יש לבצע בארון בטיחות ביולוגי בתנאים סטרילי.
1. תרבות ואלקטרופורציה של קו ה-U-118MG התאים גלינובלסטומה
- התרבות קו U-118MG ב 5% סרום העובר העוברי (FBS) המכיל בינונית נשר משתנה של Dulbecco (DMEM) (התרבות בינונית) ולשמור על 37 ° c באווירה לח המכיל 5% CO חממה2 (תנאי תרבות).
- השתמש ב-70 – 80% תאים בריאים בעלי שוטפת עבור אלקטרופורציה.
- למסיק התאים, שטוף את התאים הגדלים במנות התרבות עם 1x PBS ולהוסיף 2 מ ל 0.05% טריפסין-EDTA. מקום בחממה עבור 30 ולהסיר את טריפסין-EDTA. לאסוף תאים בתווך התרבות לתוך שפופרת 15 mL.
- לספור את התאים באמצעות מונה מחשב כף יד אוטומטי, תאים צנטריפוגה ב 100 x g עבור 5 דקות, ולמחוק את supernatant.
- להשעות את הגלולה התא במדיום התרבות ולקחת 600,000 תאים עבור כל תנאי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. כוונן את מספר התאים בהתאם לעיצובים וקצבי הצמיחה הניסיוניים.
- העבר את ההשעיה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 800 μL של מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). ספין למטה באמצעות minicentrifuge עבור 30 s ולהיפטר supernatant.
- הוסף 60 μL של מאגר ההשעיה R אל הגלולה התא ולהוסיף את siRNAs (כלומר, לא המיקוד Sirnas, Crk Sirnas, Crk Sirnas, או שניהם Crk ו-Crk siRNAs) בריכוז של 6 μM לצינור המיקרוצנטריפוגה המתאים. לערבב אותם בעדינות על ידי הקשה.
- אלקטרופורטה 10 μL של תאים עם מערכת אלקטרופורציה ב 1,350 V עבור 10 ms עם שלושה פולסים ולהעביר את התאים electroporate לתוך 5 מ ל של מדיום התרבות. חזור על האלקטרופורציה עבור שאר התאים המוכנים לכל תנאי.
- השלם את כל האלקטרופורציה המתאימה. העבר תאים electroporated לתוך 2 35 mm מנות לכל מצב ותרבות אותם בתנאי תרבות במשך 3 ימים.
- ביום השלישי, לטפל בכל התאים electroporated ב 0.5% FBS המכיל DMEM דיום (בינוני סרום נמוך) עבור 6 h לפני מדידת העכבה בפועל התא.
2. הכנת מערכת ניתוח תאים בזמן אמת, הפלישה תא והגירה (CIM) צלחות, ו Electroporated U-118MG תאים עבור ציפוי
- מניחים את מערכת ניתוח התא בזמן אמת בחממה של CO2 תחת מצבי תרבות 5 – 6 h לפני תחילת הניסוי כדי לייצב את המערכת לתנאי התרבות.
- עבור שיטת הפלישה, צלחת 50 μL של DMEM (רגיל בינוני) המכיל מטריצה החילוץ (ECM) ג'ל ב 0.1 μg/μL בכל הבאר של החדר העליון של הצלחת CIM. כדי למנוע בועות אוויר, השתמש בשיטת הליטוף ההפוכה. להסיר מיד 30 μL של ג'ל ECM, עוזב 20 μL בבאר.
- לאחר ציפוי ג'ל ECM, לשמור על הצלחת בחממה תחת תנאי התרבות עבור 4 h עם המכסה שלה. במהלך הציפוי והייבוש של ECM ג'ל, נקוט באמצעי מניעה כדי להימנע ממגע ישיר של האלקטרודות של החדר העליון של הצלחות עם הידיים, המשטחים של הקבינט הביובטיאלי, או החממה של CO2 .
- כדי להגדיר את תוכנית מדידת העכבה, לחץ פעמיים על סמל התוכנה המשויכת (ראה טבלת חומרים) כדי לפתוח את יישום תוכנת המערכת (יחידת בקרה). כל עריסה יש חלון יחיד עם כרטיסיות שונות כדי לקבוע את התנאים הניסיוניים, העכבה מרווח זמן ומשך, וניתוח נתונים.
- תחת הכרטיסיה פריסה , הגדר בארות מקוודלות עבור כל תנאי ביולוגי וקבע מדידות עכבה של שתי שלבים תחת הכרטיסיה תזמון . השלב הראשון הוא עבור מדידה בסיסית חד פעמי (בדיקה אחת עם מרווח של 1 דקות), והשלב השני הוא למדוד את העכבה של התא בעריסות בודדות המתאימות לניסוי בפועל. עבור הגירה, השתמש 145 מטאטא עם מרווח 10 דקות, ועבור פלישה, 577 מטאטא עם 10 דקות מרווח, בנפרד להגדיר) בעריסות בודדות בהתאמה.
- אחד h לפני תחילת מדידת העכבה התא, להוסיף 160 μL של DMEM עם 10% FBS כימוג בבארות של החדר התחתון של הצלחת. להרכיב את החדר העליון המכיל את הבארות מצופה ג'ל ECM או בארות בלתי מצופה עם החדר התחתון כדי למדוד את הפלישה והגירה, בהתאמה.
- למלא את הבארות בתא העליון עם 50 μL של מדיום סרום נמוך ולמקם אותם בעריסה של המערכת. בדוק אם כל הבארות מזוהות על-ידי יחידת הבקרה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה הודעה . אם ההודעה מוצגת כאישור, הצלחת בעריסה מוכנה לניסוי.
- לקדם את הצלחות ארוז לחלוטין בחממה תחת תנאי תרבות עבור 1 h לפני מדידות בעריסה בזמן אמת מערכת ניתוח תא, אשר חיוני להתרגל של צלחת ארוזה לתנאי תרבות התא.
- עבור התאים לאסוף שטופלו בינונית סרום נמוך, טריסיזציה התאים כמו בשלב 1.3, לאסוף אותם במדיום סרום נמוך, ולספור את התאים כמו בשלב 1.4.
- לאחר ספירה, בתאי צנטריפוגה ב 100 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
- השהה מחדש 800,000 תאים ב 800 μL של מדיום סרום נמוך עבור הגירה assays הפלישה. בנוסף, השעיה מחדש 300,000 תאים ב 2 מ ל של תרבות בינונית וזרע בצלחת 35 מ"מ עבור ניתוח כתמי המערבי כדי לאשר את הנוק מוסדר של Crk ו-Crk.
3. קריאה בסיסית, זריעת התאים ומדידת העכבה של התא והדמיה
- למדוד את הקריאה הבסיסית על ידי לחיצה על לחצן התחל עריסה. בסיס הבסיס צריך להיקרא לאחר לקדם את הצלחות עבור 1 h בעריסה של מערכת ניתוח התא בזמן אמת בתנאים התרבות בחממה2 CO ולפני זריעת התאים לבארות המתאימות בחדר העליון.
הערה: לאחר לחיצה על לחצן התחלת העריסה, יחידת הבקרה תשאל אם לשמור את הקובץ הניסיוני. לאחר שמירת הקובץ, מנתח העריסה מודד את העכבה של התא הבסיסי כפי שנקבע בתוכנית בתחילה ומזינה מצב השהיה עד שלחצן התחל העריסה נלחץ שוב כדי למדוד את העכבה של התא בשלב השני. - להוציא את שתי הצלחות עבור הגירה ופלישה מן העריסות לאחר מדידה בסיסית ולשמור אותם בארון בטיחות.
- הזרע 100 μL של תאים (100,000 תאים) ב quad, עבור כל תנאי ביולוגי בחדר העליון של לוחית CIM בבארות המתאימות כפי שתוכנתו ביחידת הבקרה של העריסה על ידי לאחור ליטוף כדי למנוע בועות אוויר.
- לאחר זריעה, לשמור את הצלחת תחת ארון בטיחות ביולוגי עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים באופן שווה להתיישב למטה. להעביר את הצלחת בחזרה את העריסה בהתאמה ולחץ על כפתור התחל העריסה כדי להתחיל למדוד את העכבה התא כפי שתוכנתו בשלב השני של 2.5.
- לאחר הסריקה האחרונה, הניסוי מסתיים והתוצאות נשמרות באופן אוטומטי.
- תחת הכרטיסיה ניתוח נתונים , דמיין את השינויים בעכבה של תאים כאינדקס תאים באופן תלוי-זמן במהלך או לאחר סיום הניסוי. כל אחד מהתנאים המתאימים של הקוורופליטים יכול להיות מדומה באופן אינדיבידואלי או כממוצע או כסטיות סטנדרטיות על-ידי לחיצה על תיבות האפשרויות עבור סטיית הממוצע והתקן.
- כדי לייצא נתוני אינדקס תאים לקובץ גיליון אלקטרוני, פתח קובץ גיליון אלקטרוני ריק, הצב את הסמן באמצע חלון ניתוח הנתונים ולחץ לחיצה ימנית. בתיבת הדו שמופיעה, בחר את האפשרות העתק נתונים לתבנית רשימהוהדבק את הנתונים בגיליון האלקטרוני הפתוח.
- כוונן את הזמן בנתונים הגולמיים כדי לייצג את שעת ההתחלה בפועל של מדידת העכבה של התא. שעת ההתחלה של השלב השני מוגדרת כאפס.
הערה: ליחידת הבקרה יש אפשרות להשיג את אינדקס התא עם או ללא נורמליזציה (כלומר, אינדקס תאים מנורמל) ולהמחיש את התוצאות כמצגת גרפית באופן תלוי-זמן. בדוגמה זו, נתוני אינדקס תאים מיוצאים ללא נורמליזציה לצורך עיבוד ומצגת גרפית. - שחררו את הניסוי על ידי לחיצה על לחצן השחרור בכל עריסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זה הוצע כי crk ו crk הם חשובים עבור הגירה תא ופלישה בתאי סרטן שונים13,17. למרות crk ו crk חלבונים הם בצורה מבנית ופונקציונלית דומה זה לזה ולשחק פונקציות חופפים חיוניים16,19,20,21, הרבה גנים המ, מחקרים עבור crk ו-crk לא התייחסו בבהירות אם הנוק-אין ספציפי או crk, crk, או שניהם. לכן לא ברור אילו מבין שני החלבונים תורמים להגירה ולפלישה של התאים. בתור מחקר הוכחת העיקרון, השתמשנו siRNAs ספציפי Crk או Crk ולמד את ההשפעות שלהם על הגירה ופלישה של קו U-118MG GBM. הנוק-פי של Crk ירד רמות החלבון CrkII ו Crk על ידי 85% ו 86%, בהתאמה, מבלי להפחית את רמת החלבון Crk. הנוק-אין של CrkL הפחיתו את רמת החלבון CrkL על ידי 85% (איור 1). CrkL למטה מעט מופחתת את רמות CrkII ו Crkl, מדי. שימוש משולב של siRNAs עבור Crk ו Crk מופחתת CrkII, Crk, ו Crk רמות על ידי יותר מ 80% (איור 1B). מצד שני, מנוק של Crk ו-Crk לא השפיעו על vinculin ו α-טובולין רמות (איור 1).
התאים U-118MG הועברו לסרום גבוה (10% FBS), להגיע לרמה המקסימלית של הגירה ב -13 שעות, אשר שימש כניסוי שליטה פנימית (איור 2A). עם הנוק-קרט, העברת התאים נדחתה, והתאים המשיכו לנדוד עד 23 בבוקר. U-118MG תאים איבדו את יכולת הנדידה שלהם על הנוק הן Crk ו Crk (איור 2A), הרומז כי crk ו crk לשחק תפקידים חופפים חיוניים הגירה תא סרטן. עם זאת, מסקנה זו אינה ברורה בבירור אם העברת תאים נבדקת בנקודת זמן קבועה. כאשר העברות תאים ב 6 או 13 h הושוו, עכבות על ידי Crk ו Crk החיקויים היו ברורים (איור 2B,C). לעומת זאת, Crk בנוק אין השפעה מעכבות על הגירה התא ב 18 h (איור 2D), המובילה לתוצאות סותרות בהתאם לנקודת הזמן שנבחרה להשוואה. ההשפעות מעכבות של מיקוד CrkL ו Crkl/CrkL כפול למטה היו גלויים בבירור בכל שלוש נקודות הזמן. תוצאות אלה בבירור להדגים כי הגירה התא חייב להיות מוערך על התקופה כולה של הגירה התא כדי לנתח במדויק את ההשפעות של מניפולציות גנטיות או סמים.
התאים U-118MG פלשו סרום גבוה, להגיע לרמה המקסימלית של הפלישה ב 52 h, אשר שימש כניסוי שליטה פנימית (איור 3A). עם הנוק-קרט, הפלישה לתא נדחתה, אך היא הגיעה לרמה מקסימלית דומה ב-60 h. עם השליטה CrkL, U-118MG תאים הראה מתעכב ומופחת הפלישה בהשוואה לתאי הבקרה. משולב למטה של Crk ו Crk נוסף הפלישה התא העכבות (איור 3A). השוואה של פלישת התאים ב 36 h, כאשר התאים בקרה היו באופן פעיל בפלישה, הפגינו בבירור עיכוב על ידי הסתרה בודדים של Crk ו Crk עיכוב הסינגיסטי על ידי Crk/Crk כפול הסתרה (איור 3B). עם זאת, השוואה של פלישת התאים ב 52 או 60 h הציגו השפעה קלה או לא מעכבות על ידי הסתרה Crk (איור 3C,D). תוצאות אלו תומכות בבירור בהצעה כי יש לנתח את הפלישה לתא במשך כל תקופת הניסוי.
תוצאות אלה מציגות כי הן crk ו-crk לתווך תא הגירה ופלישה, וכי מערכת ניתוח התא בזמן אמת יש יתרון ברור על פני שיטות מסורתיות בהבנת הקינטיקה השונים של הגירה התא הפלישה ואת ה אפקטים ספציפיים על פנוטיפים לתא באופן תלוי-זמן.
איור 1: sirna-בתיווך הסתרה של Crki, crkii, ו-crki ב-U-118mg תאים. (א) תא סך lysates הוכנו 4 ימים לאחר U-118mg תאים היו electroporated עם מיקוד שליטה SIRNA (NT), Crk Sirna, Crk sirna, או שניהם crk ו-Crk sirna, ורמות החלבון נקבעו על ידי ניתוחים מערביים כתמי כמתואר בעבר1. (ב) עוצמות האות של הלהקות המתאימות השתמשו במערכת הדמיה וחושבו כאחוזים של NT. הממוצע שלהם ± ערכי SD מוצגים בגרף. Vinculin ו-טובולין שימשו כפקדים פנימיים. ניתוח סטטיסטי של נתונים בוצעו באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט להשוואה בין שתי הקבוצות הנסיוניות. * p < 0.05 ו * * p < 0.01, לעומת NT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השפעות Crk/crk הסתרה על הגירה תא U-118mg: (א) שלושה ימים לאחר U-118mg תאי mg היו electroporated עם שליטה ללא המיקוד siRNA (NT), crk sirna, Crk sirna, או שניהם crk ו crk sirna, תאים נקצרו הגירה התא נבדק באמצעות מערכת ניתוח בזמן אמת. הגירה של תאים U-118MG היה מעוכב עם נוק בודד של Crk או Crk באופן תלוי זמן. הנוק-אין משני הצדדים של Crk ו-Crk שנחסמו לחלוטין להעברת תאים. ערכי אינדקס תאים ב-6 (ב), 13 (ג) ו-18 h (ד) מוצגים כדי להשוות העברת תאים בנקודות זמן שונות (חיצים). בשעה 13 h תאי הבקרה (NT) הגיעו להעברה המקסימלית. ב 18 h שני שליטה ו Crk מפריח תאים הראה רמות דומות של הגירה התא. ניתוח סטטיסטי של נתונים בוצעו באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט להשוואה בין שתי הקבוצות הנסיוניות. * * p < 0.01, לעומת NT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ההשפעות של Crk/crk למטה על הפלישה U-118mg תא: (א) שלושה ימים לאחר U-118mg תאים היו electroporated עם שליטה ללא המיקוד siRNA (NT), crk sirna, Crk sirna, או שניהם crk ו crk sirna, תאים נקצרו והפלישה התא נבדק במשך 4 ימים באמצעות מערכת ניתוח בזמן אמת. הפלישה של תאים U-118MG היה מעוכב עם מילה אחת למטה Crk או Crk באופן תלוי זמן. הנוק של שני Crk ו-Crk בשורה U-118MG קו הופחת קיבולת פולשנית עד 48 h לעומת NT. המדד של התאים ב 36 (ב), 52 (ג), ו 60 h (ד) מוצגים כדי להשוות הפלישה התא בנקודות זמן שונות (חיצים). בשעה 52 h, תאי הבקרה (NT) הגיעו לשיא הפלישה הראשונית. ב 60 h, Crk הנוק תאים הגיעו לשיא הראשון של פלישה. ניתוח סטטיסטי של נתונים בוצעו באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט להשוואה בין שתי הקבוצות הנסיוניות. * p < 0.05 ו * * p < 0.01, לעומת NT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המדידה בזמן אמת של הגירה התא והפלישה באמצעות מערכת ניתוח התא בזמן אמת הוא תהליך פשוט, מהיר, ניטור רציף עם מספר רב, יתרונות משמעותיים על השיטות המסורתיות המספקים נתונים בנקודה אחת בזמן. כמו בשיטות המסורתיות, התנאים הניסיוניים חייבים להיות ממוטבים עבור כל קו תאים עבור מערכת ניתוח התא בזמן אמת, מכיוון שכל קו תא עשוי להיות שונה מבחינת הדבקה שלה למצע, צמיחה, תא לאנשי קשר, ו נדידה ו יכולות פלמיות. בשל הבדלים אלה, כל קו תא עשוי להציג קינטיקה תאית שונה ומחולות התאבל תא. עכבה מושפע מאוד על ידי מספר התאים שנזרע היטב, הזמן הדבקה התא, זמן השהיה לפני התאים להתחיל להגר או לפלוש, ואת הריכוז של ג'ל ECM על לוחיות CIM. תחילה, ניתוח תא בזמן אמת הופך את המיטוב לקל יותר מכיוון שהוא מספק תוצאות בזמן אמת במהלך תקופת זמן מסוימת, ומאפשר לחוקרים לזהות את נקודת הזמן כאשר תאי הבקרה מציגים הגירה ופלישה של תאים פעילים וכאשר הפקד תאים מגיעים לרמות המקסימלית של הגירה ופלישה. שנית, גנים חוץ רחמי ביטוי יתר או הגן הסתרה מחקרים עשויים להזדקק למיטובים נוספים, כי התאים צריכים לאמץ את הפנוטיפים מן השינויים genotypic שונה. בנוסף, ריכוזים יעילים של סמים ויעילות של תרופות ניתן לקבוע בשילוב עם תנאים גנטיים נורמליים או שונה באמצעות מערכת ניתוח התא בזמן אמת.
שיטות מסורתיות כגון ריפוי הפצע, באגר רך, הגירה קאמרית boyden, או בחני הפלישה שימשו כדי לקבוע כי הנוק של או crk או crk מוביל הגירה מופחתת הפלישה של שורות תאים סרטניים שונים13,17. במחקר זה, אנו המושרה בודד או כפול הסתרה של Crk ו-Crk ב-U-118MG קו התא וחקר הגירה התא ופלישה. מדידה בזמן אמת של מחולות העיכוב התא על הניסוי כולו סיפק מידע מעמיק על קינטיקה של הגירה התא ופלישה, המאפשר לנו לזהות שני מצבים שונים של עיכוב. ואילו Crk מנוק הגירה מושהית ופלישה, Crk מנוק הגירה ופלישה עכבות על כל תקופת הזמן. יתר על כן, הנוק כפול של שניהם Crk ו Crk חסום לחלוטין הגירה התא ומשמעותית הפלישה התא.
מחקר זה מספק הוכחה של קונספט המשלב גישה שיטתית למטה כדי לגרום לאחד וכפול הסתרה של crk ו-crk עם ניתוחים בזמן אמת של הגירה התא ופלישה על התקופה כולה של הניסויים הוא הכרחי ל ניתוחים מקיפים של Crk-ו Crk-תיווך פונקציות בתאים סרטניים. הנתונים המוצגים במחקר זה מראים כי שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לבדוק את התרופות המועמדים עבור השפעות העכבות שלהם על Crk ו Crk. בסך הכל, מערכת ניתוח התא בזמן אמת שימושי בהגדרת ניסויים עבור הגירה תא או הפלישה התא ועושה ניתן לנתח בזמן אמת, מעמיק ומקיף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לאוליביה פאנק על הסיוע הטכני שלה עם נתוני מערכת ניתוח תאים בזמן אמת. כמו כן אנו מודים למרכז הכתיבה הרפואית של מרסי הילדים בקנזס סיטי על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן טום Ke, מוענק לחקר הסרטן ילדים (כדי TP) ועל ידי מרסי לילדים החולים המערב התיכון סרטן הברית שותף המייעצת המועצה מימון (כדי TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
