암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정
Summary
암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.
Abstract
암은 유전 불안정성, 돌연변이 및 환경 및 그밖 긴장 요인에 의해 시작된 세포의 통제되지 않는 증식 때문에 생깁니다. 복잡한, 다층 분자 신호 네트워크에서 이 취득한 이상은 비정상적인 세포 증식 및 생존, 세포외 매트릭스 분해 및 먼 기관에 전이를 유도합니다. 암 관련 죽음의 대략 90%는 전이성 보급의 직접 또는 간접적인 효력에 기인하기 위하여 추정됩니다. 따라서 유전 적 및 환경 적 조작에 따라 암 세포 행동을 특성화하는 매우 신뢰할 수있는 포괄적 인 시스템을 구축하는 것이 중요합니다. 이러한 시스템은 암 전이의 분자 조절에 대한 명확한 이해와 계층화 되고 정확한 치료 전략의 성공적인 개발을위한 기회를 제공 할 수 있습니다. 그러므로, 유전자의 기능의 이득 또는 손실과 가진 이동 및 침략과 같은 암세포 행동의 정확한 측정은 암세포의 공격적인 본질의 평가를 허용합니다. 세포 임피던스를 기반으로 한 실시간 측정 시스템을 통해 연구원은 전체 실험 중에 지속적으로 데이터를 수집하여 다양한 실험 조건에서 결과를 즉시 비교및 정량화할 수 있습니다. 기존의 방법과 달리 이 방법은 마이그레이션하거나 침입하는 셀을 분석하기 위해 고정, 염색 및 샘플 처리를 필요로 하지 않습니다. 이 방법 논문은 교모 세포종 암세포의 이동 및 침입의 실시간 측정을위한 상세한 절차를 강조한다.
Introduction
암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 암 유전자형 및 표현형을 결정하는 것은 효과적인 치료 전략을 이해하고 설계하는 데 매우 중요합니다. 암 연구의 수십 년은 암 유전자형 및 표현형을 결정하기 위하여 다른 방법의 발달 그리고 적응으로 이끌어 냈습니다. 최신 기술 개발 중 하나는 세포 임피던스에 기초한 세포 이동 및 침입의 실시간 측정입니다. 기질 및 세포 세포 접촉에 대한 세포 접착은 세포 간 통신 및 조절, 개발 및 조직의 유지 보수에 중요한 역할을 합니다. 세포 접착의 이상은 세포 접촉의 손실로 이끌어 내고, 세포외 매트릭스 (ECM)의 저하, 세포에 의한 철새 및 침입 능력의 이득, 모두는 다른 기관에 암세포의 전이에기여1,,2. 세포 이동(상처 치유 및 보이든 챔버 분석)과 침략(Matrigel-Boyden 챔버 분석)3,,4,,5를결정하는 다양한 방법이 사용 가능하다. 이러한 종래의 방법은 세포 표현형을 측정하기 위해 실험 전후에 형광 염료 또는 기타 염료로 표지되어야 하기 때문에 반정적이다. 또한, 기계적 중단은 상처 부위로세포의 이동을 측정하기 위한 상처를 만들기 위한 경우에 필요하다. 또한 이러한 기존 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 한 번에 결과를 측정합니다. 또한, 이러한 방법은 실험절차6 동안 일관되지 않은 취급으로 인해 부정확한 측정을 하는 경향이 있다.
기존의 방법과 달리 실시간 세포 분석 시스템은 세포의 사전 또는 포스트 염색 및 기계적 손상없이 실시간으로 세포 임피던스를 측정합니다. 더 중요한 것은 생물학적 효과가 시간에 따라 결정될 수 있도록 실험 기간을 연장할 수 있다는 것입니다. 실험을 실행하는 것은 시간 효율적이며 노동 집약적이지 않습니다. 데이터 분석은 비교적 간단하고 정확합니다. 다른 방법에 비해,이 방법은 세포 이동 및 침입을측정하는 가장 좋은 실시간 측정 중 하나입니다6,7,,8,,9.
Giaever 및 Keese는전극(10)의표면에 대한 세포 집단의 임피던스 기반 측정을 최초로 기술했다. 실시간 셀 분석 시스템은 동일한 원리로 작동합니다. 각 마이크로 플레이트의 면적은 약 80%가 금 마이크로 전극으로 덮여 있습니다. 전극 표면적이 셀의 준수 또는 확산으로 인해 셀에 의해 점유되면 전기 임피던스가 변경됩니다. 이러한 임피던스는 전극 표면적을 덮는 세포에 정비례하는 세포 지수로서 표시되며, 이는 미세다공성 멤브레인을 관통한 후(이 멤브레인의 중간 기공 크기는 8 μm)11.
Crk 및 CrkL은 SH2 및 SH3 도메인을 포함하는 어댑터 단백질이며 세포골격 조절, 세포 변형, 증식, 접착, 상피-중간엽 전이, 이동, 침략 및 전이와 같은 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 하며 많은 신호 경로에서 단백질-단백질 상호작용을 많이 중재함으로써,,14,1,,,12,,14, 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14, 14 , 14 , 14 , 14 ,14,1614 18. 따라서, 암세포의 Crk/CrkL 의존적 철새 및 침습적 능력을 결정하는 것이 중요하다. 실시간 세포 분석은 Crk 및 CrkL의 유전자 녹다운 시 교모세포종 세포의 철새 및 침습 능력을 결정하기 위해 수행되었다.
이 방법 논문은 Crk- 및 CrkL 매개 이동 및 인간 교모세포종 세포의 침입의 상세한 측정을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
실시간 셀 분석 시스템을 사용하여 세포 이동 및 침입의 실시간 측정은 단일 시점에서 데이터를 제공하는 기존의 방법에 비해 여러 가지 중요한 장점을 가진 간단하고 빠르며 지속적인 모니터링 프로세스입니다. 기존의 방법과 마찬가지로, 각 세포주들은 기질, 성장, 세포 간 접촉, 및 철새에 대한 접착측면에서 다를 수 있기 때문에 실시간 세포 분석 시스템을 위한 각 세포주마다 실험 조건을 최?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 실시간 세포 분석 시스템 데이터에 대한 그녀의 기술 지원에 대한 올리비아 펑크 에게 감사드립니다. 우리는 또한이 원고를 편집 어린이 자비 캔자스 시티의 의료 쓰기 센터에 감사드립니다. 이 작품은 소아암 연구를위한 톰 Keaveny 부여 기금에 의해 지원되었다 (TP에) 어린이 자비 병원 중서부 암 얼라이언스 파트너 자문 위원회 자금 (TP에).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
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