En flaskehals i den “design-build-test” cyklus af mikrobiel teknik er den hastighed, hvormed vi kan udføre funktionelle skærme af stammer. Vi beskriver en høj-throughput metode til stamme screening anvendes til hundreder til tusindvis af gær celler pr eksperiment, der udnytter dråbe-baserede RNA sekventering.
De kraftfulde værktøjer til rådighed til at redigere gær genomer har gjort denne mikrobe en værdifuld platform for teknik. Selv om det nu er muligt at konstruere biblioteker med millioner af genetisk adskilte stammer, er screening for en ønsket fænotype fortsat en væsentlig hindring. Med eksisterende screeningsteknikker er der en afvejning mellem informationsoutput og gennemløb, hvor screening med høj overførselsmængde typisk udføres på ét produkt af interesse. Derfor præsenterer vi en tilgang til at fremskynde stamme screening ved at tilpasse enkelt celle RNA sekventering til isogene picoliter kolonier af genetisk manipuleret gær stammer. For at løse de unikke udfordringer ved at udføre RNA-sekvensering på gærceller, dyrker vi isogene gærkolonier i hydrogels og spheroplast, før vi udfører RNA-sekvensering. RNA-sekventeringsdata kan bruges til at udlede gærfænotyper og sortere manipulerede veje. Skalerbarheden af vores metode adresserer en kritisk obstruktion inden for mikrobiel teknik.
Et primært mål for mikrobiel teknik er at ændre mikrober for at få dem til at producere værdifulde forbindelser1,2. S. cerevisiae har været den primære organisme for mikrobiel teknik på grund af sin lethed af kultur og bredden af værktøjer til rådighed til engineering af sit genom3,4,5. Men en forhindring forbliver i at udføre funktionelle skærme på den modificerede gær: screening gennemløb halter bagefter genom teknik ved størrelsesordener. Screening indebærer typisk isolering af stammer i mikrobrøndplader og fænotypebestemmelse ved måling af produktionen af en bestemt forbindelse6,7. Gennemløbet af denne proces er begrænset af de store mængder reagens, der er nødvendige for at beregne individuelle stammer i hundrede mikroliterreaktioner. Dråbemikrofluidics giver en attraktiv løsning til at øge gennemløbet af gærscreening ved størrelsesordener ved nedskaleringsreaktioner, der normalt udføres i godt plader8. Men, som med godt plade skærme, dråbe skærme typisk opdage enkelt produkt forbindelser, som giver begrænset information i den globale funktion af manipuleret vej9,10,11.
RNA-sekventering (RNA-seq) kan muliggøre en mere omfattende karakterisering af vejdriften ved at tillade, at udtryksniveauer for alle relevante gener vurderessamtidigt 12,13. Desuden tillader dråbemetoder, at tusindvis af celler profileres pr. eksperiment, hvilket giver det nødvendige gennemløb til at screene biblioteker af manipulerede varianter14,15. RNA-seq-metoder er dog optimeret til pattedyrceller; gær, til sammenligning, har mindre mRNA per celle og en celle væg, der er vanskeligt at fjerne16,udelukker deres sekventering af eksisterende metoder. Hvis en høj-gennemløb dråbe metode kunne udformes for at aktivere gær RNA-seq, ville det give en skalerbar, omkostningseffektiv, og informations-rige fænotastering platform for gær engineering.
Vi præsenterer en detaljeret protokol over vores nyligt udviklede metode til sekventering gær celler ved hjælp af høj-throughput dråbe microfluidics17. For at overvinde udfordringen fra begrænset RNA indkapsler vi og kulturerer enkelte gærceller i picoliter hydrogelkugler. Kultur duplikerer cellerne og giver hundredvis af kopier, der deler den samme manipulerede vej; dette reducerer variationen på grund af encellede genekspression, samtidig med at mængden af RNA, der er tilgængelig til sekvensering, øges betydeligt. Efter kulturbaseret forstærkning spheroplast vi cellerne, fjerne cellevæggen via bulk enzymatisk fordøjelse. Cellemembraner forbliver intakte, således at hver isogen koloni og dens tilknyttede mRNA forbliver indkapslet i deres hydrogel kugler. Dette giver os mulighed for at parre de enkelte kolonier med mRNA capture reagenser og lysis buffer, og mRNA, der skal fanges, stregkodet, og sekvenseret efter Drop-Seq workflow14. Vores metode tillader transskription-dækkende screening af tusindvis af isogene gær kolonier pr eksperiment.
Vores metode til isogen gærkoloni RNA-sekvensering (ICO-seq) tilpasser en offentliggjort enkeltcelleRNA-sekventeringsplatform, Drop-Seq, til screening af manipulerede gærstammer med høj gennemløb. Gærceller indeholder mindre end 10% af kopierne af mRNA af en typisk pattedyrcelle og har en cellevæg, der skal nedbrydes før mRNA-opsamling16. Disse to faktorer udelukker direkte anvendelse af gær på Drop-Seq eller andre dråbebaserede scRNA-seq platforme. For at løse disse problemer indkapsler vi enkelte celler i hydrogels og dyrker dem til kolonier for at give nok inputmateriale til RNA-sekventering, og vi fordøjer gærcellevæggen for at generere spheroplasts før lysis og mRNA-opsamling. Disse ændringer tilføjer yderligere kompleksitet i ICO-seq-arbejdsprocessen sammenlignet med den oprindelige Drop-Seq-arbejdsproces og er vigtige trin, som brugerne skal sikre, at de forløber problemfrit.
Korrekt drift af enhed A er nødvendig for indkapsling af enkelte gærceller i agarose hydrogels. Korrekt optælling af input gær suspension skal følges for at minimere antallet af hydrogels med mere end én gær celle, samtidig med at sikre, at nok hydrogels indeholder en enkelt celle for at sikre en rimelig celle opsamling effektivitet under mRNA-opsamling. Under mikrofluidisk anordning ser agarosegelblandingen godt ud i opløsning og føres gennem et sprøjtefilter for at minimere risikoen for tilstopning af enheden. Agarose gel blandingen er tyktflydende og den region, hvor en enkelt kanal deler sig i otte er særligt tilbøjelige til tilstopning. Ved at centrere et højhastighedskamera for at visualisere enhedens drift i denne del af enheden, kan brugerne overvåge ensartetheden af dråber, der kommer ud af hver af de otte kanaler, og reagere hurtigt, hvis ensartetheden ændres på grund af træsko i nogen af kanalerne. Inspektion af en lille mængde indsamlet emulsion under mikroskopet giver en sekundær metode til bekræftelse af en emulsion af høj kvalitet.
Efter vækst af gærkolonier inden for hydrogels er der behov for flere forholdsregler for at sikre kvalitet mRNA-ekstraktion på enkelt koloniniveau. Det er vigtigt at optimere den tid gær er i hydrogel kultur, fordi hvis gæren er tilbage i kulturen for længe, vil mange undslippe rammerne af hydrogels, hvilket fører til en højere baggrundssignal under RNA sekventering og lavere følsomhed, når diskriminere mellem celletyper. Korrekt generering af sfærolaster ved hjælp af Zymolyase sikrer, at mRNA frigives efter celleeksponering for lysisbuffer. Visuel inspektion af gærkolonier efter Zymolyase bør give skinnende gærceller. Forkert cellevæg fordøjelse vil føre til lavere RNA capture effektivitet. Endelig skal hydrogels være tætpakket, da de sprøjtes ind i enhed B. Overvågning af hydrogelindgangen med et højhastighedskamera vil gøre det muligt at afslutte emulsionsindsamlingen, når hydrogelerne ikke længere er tætpakket ved input til enheden, ellers vil opsamlingseffektiviteten blive påvirket.
En potentiel bekymring med vores metode er, at microgel kultur gær kan ændre genekspression. Tidligere arbejde med at undersøge gær genekspression i microgels og på agar vise forskelle i genekspression gennemsnit, men generelt en positiv korrelation17, selv om yderligere undersøgelse af denne påstand på en række gær stammer er klogt. Metoden har også begrænset celleopsamlingseffektivitet på grund af stokastiske indlæsning af mRNA-opsamlingsperler efter Poisson-statistik14. I øjeblikket omkring 10% af dråber indeholder en perle og en koloni, og satsen for dobbelt indkapslinger forventes at være under 1%. Dobbelte indkapslinger fører til konfunderende elementer under RNA-seq dataanalyse og deres filtrering er fortsat udfordrende23; en opsamlingsprocent på 25 % ville føre til en tilsvarende stigning i dobbelt indkapslinger til 5 % (supplerende figur 2). Selv om vi demonstrerer ICO-seq ved hjælp af Drop-Seq platformen, er der andre dråbe RNA-seq platforme, der introducerer mRNA fange perler deterministisk snarere end statistisk, såsom kommercielt tilgængelige 10x Genomics Chrom platform15,24. Integrationen af disse platforme med ICO-seq kunne øge fange effektivitet ud over, hvad Poisson statistikker tillader. Endelig er en grundlæggende begrænsning af dråbeRNA-seq den manglende evne til at inddrive celler af interesse efter sekvensering. Denne begrænsning bør tages i betragtning, når man overvejer de typer af gær biblioteker til at analysere ved hjælp af denne metode.
Celle-til-celle heterogenitet er blevet påvist på klonal niveau for mikrober som E. coli25 og S. cerevisiae26 afslører nye celle hedder det, at en bulk-niveau analyse ellers ville maskere. Bulk RNA-seq analyser udført på C. albicans tendens til enten at se på befolkningen sationom ændringer, eller hvide og uigennemsigtige celler som to separate populationer27,28. Anvendelsen af ICO-seq kan føre til opdagelsen af yderligere understater og skabe en analytisk ramme for at opdage nye celletilstande inden for andre gærarter. Men væksten af celler i hydrogels er ikke begrænset til gær: andre celletyper, såsom pattedyr, bakterielle, og andre svampeceller kan også dyrkes inden hydrogels29,30. Sekvenseringen af isogene kolonier versus enkelte celler fører til et gennemsnit ud af biologisk støj på grund af celle-til-celle variation, hvilket forbedrer forskelsbehandlingen mellem celletyper. Dette kan hjælpe, når man analyserer celler, hvor genetisk mangfoldighed centre på specifikke syntese veje. De udvidede muligheder for celletypeinput til ICO-seq og dens potentielle integration med kommercielt tilgængelige dråbeRNA-seq platforme positionerer ICO-seq som en lovende platform til dissekering af cellulær heterogenitet på det genetiske niveau.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 og tilskud R01HG008978, National Science Foundation Technology Center tilskud DBI-1548297, og UCSF Center for Cellular Construction. ARA og ZJG er Chan-Zuckerberg Biohub Efterforskere.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3 mL syringes | BD | 309657 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |