माइक्रोबियल इंजीनियरिंग के ‘डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट’ चक्र में एक अड़चन वह गति है जिस पर हम उपभेदों की कार्यात्मक स्क्रीन कर सकते हैं। हम प्रति प्रयोग सैकड़ों से हजारों खमीर कोशिकाओं पर लागू तनाव स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करते हैं जो ड्रॉपलेट-आधारित आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करता है।
खमीर जीनोम को संपादित करने के लिए उपलब्ध शक्तिशाली उपकरणों ने इस माइक्रोब को इंजीनियरिंग के लिए एक मूल्यवान मंच बना दिया है। हालांकि अब लाखों आनुवंशिक रूप से अलग उपभेदों के पुस्तकालयों का निर्माण संभव है, एक वांछित फेनोटाइप के लिए स्क्रीनिंग एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। मौजूदा स्क्रीनिंग तकनीकों के साथ, सूचना उत्पादन और थ्रूपुट के बीच एक ट्रेडऑफ है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग आमतौर पर ब्याज के एक उत्पाद पर की जा रही होती है। इसलिए, हम आनुवंशिक रूप से इंजीनियर खमीर उपभेदों के आइसोजेनिक पिकोटर कालोनियों के लिए एकल सेल आरएनए अनुक्रमण को अनुकूलित करके तनाव स्क्रीनिंग में तेजी लाने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। खमीर कोशिकाओं पर आरएनए अनुक्रमण प्रदर्शन की अनूठी चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हम आरएनए अनुक्रमण करने से पहले हाइड्रोगेल और स्फेरोप्लास्ट के भीतर आइसोजेनिक खमीर कालोनियों को संस्कृति देते हैं। आरएनए अनुक्रमण डेटा का उपयोग खमीर फेनोटाइप का अनुमान लगाने और इंजीनियर रास्तों को सुलझाने के लिए किया जा सकता है। हमारी विधि की स्केलेबिलिटी माइक्रोबियल इंजीनियरिंग में एक महत्वपूर्ण बाधा को संबोधित करती है।
माइक्रोबियल इंजीनियरिंग का एक प्राथमिक लक्ष्य रोगाणुओं को संशोधित करना है ताकि उन्हें मूल्यवान यौगिकों का उत्पादन करने के लिए प्रेरित किया जा सके1,2. एस सेरेविसिया अपनी संस्कृति में आसानी और इंजीनियरिंग के लिए उपलब्ध उपकरणों की चौड़ाई के3,4,5कारण माइक्रोबियल इंजीनियरिंग के लिए प्राथमिक जीव रहा है । हालांकि, संशोधित खमीर पर कार्यात्मक स्क्रीन प्रदर्शन करने में एक बाधा बनी हुई है: स्क्रीनिंग थ्रूपुट परिमाण के आदेशों से जीनोम इंजीनियरिंग से पीछे है। स्क्रीनिंग में आमतौर पर माइक्रोवेल प्लेटों में उपभेदों को अलग करना और एक विशिष्ट यौगिक6,7के उत्पादन को मापने के द्वारा उन्हें फेनोटाइप करना शामिल होता है । इस प्रक्रिया का थ्रूपुट सौ माइक्रोलीटर प्रतिक्रियाओं में व्यक्तिगत उपभेदों को पर्ण करने के लिए आवश्यक बड़ी मात्रा में रिएजेंट द्वारा सीमित है। ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लूइडिक्स सामान्य रूप से अच्छी प्लेटों8में किए गए प्रतिक्रियाओं को डाउनस्केलिंग करके परिमाण के आदेशों द्वारा खमीर स्क्रीनिंग के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए एक आकर्षक समाधान प्रदान करता है। हालांकि, प्लेट स्क्रीन के साथ, ड्रॉपलेट स्क्रीन आमतौर पर एकल उत्पाद यौगिकों का पता लगाती है, जो इंजीनियर मार्ग9,,10,,11के वैश्विक कार्य में सीमित जानकारी प्रदान करती है।
आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) सभी प्रासंगिक जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर को12,,13के साथ मूल्यांकन करने की अनुमति देकर मार्ग संचालन के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन को सक्षम कर सकता है। इसके अलावा, ड्रॉपलेट विधियां हजारों कोशिकाओं को प्रति प्रयोग प्रोफाइल करने की अनुमति देती हैं, जो इंजीनियर वेरिएंट14,,15के पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए आवश्यक थ्रूपुट प्रदान करती हैं। हालांकि, आरएनए-सेक विधियों को स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है; खमीर, तुलना करके, प्रति सेल कम एमआरएनए और एक सेल दीवार होती है जिसे16को हटाना मुश्किल होता है, मौजूदा तरीकों से उनके अनुक्रमण को रोकना पड़ता है। यदि खमीर आरएनए-सीक्यू को सक्षम करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट ड्रॉपलेट विधि तैयार की जा सकती है, तो यह खमीर इंजीनियरिंग के लिए एक स्केलेबल, लागत प्रभावी और सूचना युक्त फेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म प्रदान करेगा।
हम उच्च थ्रूपुट ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लूइडिक्स17का उपयोग करके खमीर कोशिकाओं को अनुक्रमित करने के लिए हमारी हाल ही में विकसित विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सीमित आरएनए की चुनौती को दूर करने के लिए, हम पिकोटर हाइड्रोगेल क्षेत्रों में एकल खमीर कोशिकाओं को समझाते हैं और संस्कृति करते हैं। संस्कृति कोशिकाओं को डुप्लिकेट करती है, एक ही इंजीनियर मार्ग साझा करने वाली सैकड़ों प्रतियां देती है; यह एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति के कारण भिन्नता को कम करता है, जबकि अनुक्रमण के लिए उपलब्ध आरएनए की मात्रा में काफी वृद्धि करता है। संस्कृति आधारित प्रवर्धन के बाद, हम कोशिकाओं को स्गोला, थोक एंजाइमैटिक पाचन के माध्यम से सेल की दीवार को हटाने। कोशिका झिल्ली बरकरार रहती है, ताकि प्रत्येक आइसोजेनिक कॉलोनी और उससे जुड़े एमआरएनए अपने हाइड्रोगेल क्षेत्रों में समाहित रहें। यह हमें MRNA कैप्चर रिएजेंट्स और लिसिस बफर के साथ व्यक्तिगत उपनिवेशों को जोड़ी बनाने की अनुमति देता है, और एमआरएनए को ड्रॉप-एसईक्यू वर्कफ्लो14के बाद कैप्चर, बारकोड और अनुक्रमित करने की अनुमति देता है। हमारी विधि प्रति प्रयोग हजारों आइसोजेनिक खमीर कालोनियों की प्रतिलेखन-व्यापी स्क्रीनिंग की अनुमति देती है।
आइसोजेनिक खमीर कॉलोनी आरएनए अनुक्रमण (आईसीओ-सीक्यू) के लिए हमारी विधि इंजीनियर खमीर उपभेदों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक प्रकाशित एकल सेल आरएनए अनुक्रमण मंच, ड्रॉप-सीक्यू को अनुकूलित करती है। खमीर कोशिकाओं में एक विशिष्ट स्तनधारी कोशिका की एमआरएनए की प्रतियों का 10% से कम होता है और इसमें एक कोशिका दीवार होती है जिसे एमआरएनए कैप्चर16से पहले अपमानित करने की आवश्यकता होती है। ये दो कारक ड्रॉप-सेक या अन्य बूंद-आधारित स्क्आरएनए-सीक्यू प्लेटफार्मों पर खमीर के प्रत्यक्ष आवेदन को रोकना। इन मुद्दों के समाधान के लिए, हम हाइड्रोगेल के भीतर एकल कोशिकाओं को समझाते हैं और आरएनए अनुक्रमण के लिए पर्याप्त इनपुट सामग्री प्रदान करने के लिए उन्हें उपनिवेशों में विकसित करते हैं और हम lysis और mRNA कैप्चर से पहले स्फेरोप्लास्ट उत्पन्न करने के लिए खमीर सेल दीवार को पचाते हैं। ये परिवर्तन मूल ड्रॉप-सीक्यू वर्कफ़्लो की तुलना में आईसीओ-सीक्यू कार्यप्रवाह में अतिरिक्त जटिलता जोड़ते हैं और महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें उपयोगकर्ताओं को सुचारू रूप से आगे बढ़ना सुनिश्चित करना चाहिए।
अगारोज हाइड्रोगेल के भीतर एकल खमीर कोशिकाओं को एन्कैप्सुलेट करने के लिए डिवाइस ए का उचित संचालन आवश्यक है। एक से अधिक खमीर सेल के साथ हाइड्रोगेल की संख्या को कम करने के लिए इनपुट खमीर निलंबन की उचित गिनती का पालन किया जाना चाहिए, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि पर्याप्त हाइड्रोगेल में एमआरएनए कैप्चर के दौरान उचित सेल कैप्चर दक्षता सुनिश्चित करने के लिए एक ही सेल हो। माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस ऑपरेशन के दौरान, अगारोज जेल मिश्रण को अच्छी तरह से भंग किया जाना चाहिए और डिवाइस क्लोजिंग की संभावना को कम करने के लिए सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए। अगारोज जेल मिश्रण चिपचिपा है और जिस क्षेत्र में एक चैनल आठ में विभाजित होता है, विशेष रूप से क्लोजिंग से ग्रस्त होता है। डिवाइस के उस क्षेत्र में डिवाइस ऑपरेशन की कल्पना करने के लिए एक उच्च गति कैमरा केंद्रित करके, उपयोगकर्ता आठ चैनलों में से प्रत्येक से उभरने वाली बूंदों की एकरूपता की निगरानी कर सकते हैं और किसी भी चैनल में क्लॉग के कारण एकरूपता परिवर्तन होने पर जल्दी से प्रतिक्रिया कर सकते हैं। माइक्रोस्कोप के तहत एकत्र पायस की एक छोटी मात्रा का निरीक्षण उच्च गुणवत्ता वाले पायस की पुष्टि करने के लिए एक माध्यमिक विधि प्रदान करता है।
हाइड्रोगेल के भीतर खमीर कालोनियों के विकास के बाद, एकल कॉलोनी स्तर पर गुणवत्ता mRNA निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए कई सावधानियां आवश्यक हैं। खमीर हाइड्रोगेल संस्कृति में होने के समय को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यदि खमीर बहुत लंबे समय तक संस्कृति में छोड़ दिया जाता है, तो कई हाइड्रोगेल के दायरे से बच जाएंगे, जिससे सेल प्रकारों के बीच भेदभाव करते समय आरएनए अनुक्रमण और कम संवेदनशीलता के दौरान उच्च पृष्ठभूमि संकेत होगा। ज़िमोलिज का उपयोग करके स्हेरोप्लास्ट की उचित पीढ़ी यह सुनिश्चित करती है कि एमआरएनए को लिसिस बफर के सेल एक्सपोजर के बाद जारी किया जाएगा। ज़िमोलिज़ के बाद खमीर उपनिवेशों के दृश्य निरीक्षण में शिनियर खमीर कोशिकाओं को प्राप्त करना चाहिए। अनुचित सेल वॉल पाचन कम आरएनए कैप्चर दक्षता का कारण बनेगा। अंत में, हाइड्रोगेल को बंद पैक किया जाना चाहिए क्योंकि उन्हें डिवाइस बी में इंजेक्ट किया जाता है। उच्च गति वाले कैमरे के साथ हाइड्रोगेल इनपुट की निगरानी करने से पायस संग्रह की समाप्ति के लिए अनुमति मिलेगी एक बार हाइड्रोगेल डिवाइस में इनपुट पर बंद नहीं होंगे, अन्यथा कैप्चर दक्षता प्रभावित होगी।
हमारी विधि के साथ एक संभावित चिंता यह है कि खमीर की माइक्रोजेल संस्कृति जीन अभिव्यक्ति को काफी बदल सकती है। पिछले माइक्रोगेल में खमीर जीन अभिव्यक्ति की जांच और आगर पर काम जीन अभिव्यक्ति औसत में मतभेदों को प्रदर्शित करता है, लेकिन कुल मिलाकर एक सकारात्मक संबंध17,हालांकि खमीर उपभेदों की एक किस्म पर इस दावे की आगे की जांच विवेकपूर्ण है । इस विधि में पॉइसन स्टैटिस्टिक्स14के बाद एमआरएनए कैप्चर मोतियों की स्टोकस्टिक लोडिंग के कारण सीमित सेल कैप्चर दक्षता भी होती है । वर्तमान में लगभग 10% बूंदों में एक बीड और एक कॉलोनी होती है, और डबल एनकैप्सुलेशन की दर 1% से कम होने की उम्मीद है। डबल एनकैप्सुलेशन आरएनए-सीक्यू डेटा विश्लेषण के दौरान भ्रमित तत्वों को जन्म देते हैं और उनका फ़िल्टरिंग23को चुनौतीपूर्ण बना हुआ है ; 25% की कैप्चर दर से डबल एनकैप्सुलेशन की इसी वृद्धि को 5%(पूरक चित्रा 2)तक ले जाया जाएगा। यद्यपि हम ड्रॉप-सीक्यू प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके आईसीओ-सीक्यू का प्रदर्शन करते हैं, अन्य बूंद आरएनए-सीक्यू प्लेटफ़ॉर्म हैं जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 10x जीनोमिक्स क्रोमियम प्लेटफॉर्म15,,24जैसे सांख्यिकीय रूप से निर्धारित रूप से एमआरएनए कैप्चर मोतियों को लागू करते हैं। आईसीओ-सीक्यू के साथ उन प्लेटफार्मों का एकीकरण क्या Poisson आंकड़े अनुमति से परे कब्जा क्षमता को बढ़ावा दे सकता है । अंत में, ड्रॉपलेट आरएनए-सीक्यू की एक मौलिक सीमा अनुक्रमण के बाद ब्याज की कोशिकाओं को ठीक करने में असमर्थता है। इस विधि का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए खमीर पुस्तकालयों के प्रकारों पर विचार करते समय इस सीमा को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
ई कोलाई25 और एसजैसे रोगाणुओं के लिए क्लोनल स्तर पर सेल-टू-सेल विषमता का प्रदर्शन किया गया है । cerevisiae26 खुलासा नई सेल में कहा गया है कि एक थोक स्तर के विश्लेषण अंयथा मुखौटा होगा । सी एल्बिकान पर किए गए बल्क आरएनए-सीक्यू विश्लेषण या तो जनसंख्या-व्यापी प्रतिलेखन परिवर्तन, या सफेद और अपारदर्शी कोशिकाओं को दो अलग-अलग आबादी27,,28के रूप में देखते हैं। आईसीओ-सीक्यू का आवेदन अतिरिक्त उपराज्यों की खोज का कारण बन सकता है और अन्य खमीर प्रजातियों के भीतर नए सेल राज्यों की खोज के लिए एक विश्लेषणात्मक ढांचा प्रदान कर सकता है। हालांकि, हाइड्रोगेल के भीतर कोशिकाओं का विकास खमीर तक सीमित नहीं है: अन्य सेल प्रकार, जैसे स्तनधारी, बैक्टीरियल, और अन्य फंगल कोशिकाओं को हाइड्रोगेल29,,30के भीतर भी उगाया जा सकता है। एकल कोशिकाओं बनाम आइसोजेनिक उपनिवेशों के अनुक्रमण से सेल-टू-सेल भिन्नता के कारण जैविक शोर से औसत बाहर हो जाता है, सेल प्रकारों के बीच भेदभाव में सुधार होता है। यह उन कोशिकाओं का विश्लेषण करते समय मदद कर सकता है जहां विशिष्ट संश्लेषण मार्गों पर आनुवंशिक विविधता केंद्र होती है। आईसीओ-सीक्यू के लिए सेल प्रकार इनपुट की विस्तारित संभावनाएं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ड्रॉपलेट आरएनए-सीक्यू प्लेटफार्मों के साथ इसके संभावित एकीकरण आनुवंशिक स्तर पर सेलुलर विषमता को विच्छेदन के लिए एक आशाजनक मंच के रूप में आईसीओ-सीक्यू की स्थिति है।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार DBI-1253293, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान ों के नए प्रर्वतक पुरस्कार DP2AR068129 और अनुदान R01HG008978, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन प्रौद्योगिकी केंद्र अनुदान DBI-1548297, और सेलुलर निर्माण के लिए UCSF केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था । आरा और जेडजेजी चान-जुकरबर्ग बायोहब जांचकर्ता हैं ।
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3 mL syringes | BD | 309657 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |