Summary
Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is een zeer gevoelige, betrouwbare en gemakkelijk uit te voeren methode om omkeerbare lipidemodificatie van cysteïneresiduen (S-acylation) in een verscheidenheid van biologische monsters op te sporen.
Abstract
Eiwit S-acylation, ook wel S-palmitoylation genoemd, is een omkeerbare posttranslationele modificatie van cysteïneresten met lange-keten vetzuren via een labiele thioesterbinding. S-acylation, die in opkomst is als een wijdverbreid regelgevend mechanisme, kan bijna alle aspecten van de biologische activiteit van eiwitten moduleren, van complexe vorming tot eiwithandel en eiwitstabiliteit. De recente vooruitgang in het begrijpen van de biologische functie van eiwit S-acylation werd grotendeels bereikt door de ontwikkeling van nieuwe biochemische instrumenten waardoor robuuste en gevoelige detectie van eiwit S-acylation in een verscheidenheid van biologische monsters. Hier beschrijven we acyl hars-ondersteunde vangst (Acyl-RAC), een recent ontwikkelde methode gebaseerd op selectieve vangst van endogene S-acylated eiwitten door thiol-reactieve Sepharose kralen. In vergelijking met bestaande benaderingen vereist Acyl-RAC minder stappen en kan het betrouwbaardere resultaten opleveren in combinatie met massaspectrometrie voor de identificatie van nieuwe S-acylation-doelen. Een belangrijke beperking in deze techniek is het gebrek aan vermogen om onderscheid te maken tussen vetzuursoorten die via dezelfde thioesterbinding aan cysteïnes zijn verbonden.
Introduction
S-acylation is een omkeerbare posttranslationele modificatie waarbij een vetacylketen wordt toegedeeld aan een intern cysteïneresidu op een doeleiwit via een labiele thioesterbinding1. Het werd voor het eerst gemeld als een wijziging van eiwitten met palmitaat, een verzadigd 16-koolstofvetzuur2, en daarom wordt deze wijziging vaak aangeduid als S-palmitoylation. Naast palmitaat kunnen eiwitten omkeerbaar worden gewijzigd door een verscheidenheid aan langere en kortere verzadigde (myristaat en stearate), enkelvoudig onverzadigd (oleaat) en meervoudig onverzadigd (arachidonaat en eicosapentanoaat) vetzuren3,4,5,6,7. In eukaryotische cellen wordt S-acylation gekatalyseerd door een familie van enzymen die bekend staan als DHHC-eiwitacyltransferases en de omgekeerde reactie van cysteinedeacylation wordt gekatalyseerd door eiwitthioesterases, waarvan de meeste nog steedsraadselachtig8 blijven.
De laaitbaarheid van de thioesterbinding maakt deze lipidemodificatie omkeerbaar, waardoor het eiwitclustering, plasmamembraanlokalisatie, intracellulaire handel, eiwit-eiwitinteracties en eiwitstabiliteit9,10kandynamisch reguleren. Bijgevolg is S-acylation gekoppeld aan verschillende aandoeningen, waaronder de ziekte van Huntington, de ziekte van Alzheimer en verschillende vormen van kanker (prostaat, maag, blaas, long, colorectale), die de ontwikkeling van betrouwbare methoden om deze post-translationele eiwitmodificatie te detecterenvereist 11.
Metabolische etikettering met radioactief ([3H], [14C] of [125I]) palmitaat was een van de eerste benaderingen ontwikkeld om testeiwit S-acylation12,13,14. Echter, radiolabeling-gebaseerde methoden presenteren gezondheidsproblemen, zijn niet erg gevoelig, tijdrovend, en alleen detecteren lipidatie van zeer overvloedige eiwitten15. Een sneller en niet-radioactief alternatief voor radiolabeling is metabolische etikettering met bioorthogonale vetzuursondes, die routinematig wordt gebruikt om de dynamiek van eiwit S-acylation16te assay. Bij deze methode wordt een vetzuur met een chemische reporter (alkyne of azidegroep) door een eiwit acyltransferase in het S-acylated eiwit verwerkt. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reactie (klik chemie) kan vervolgens worden gebruikt om een gefunctionaliseerde groep, zoals een fluoroftaan of biotine, hechten aan het geïntegreerde vetzuur waardoor detectie van de S-acylated eiwit17,18,19.
Acyl-biotine uitwisseling (ABE) is een van de veel gebruikte biochemische methoden voor het vangen en identificeren van S-acylated eiwitten die een aantal van de tekortkomingen van metabole etikettering omzeilt, zoals ongeschiktheid voor weefselmonsters15. Deze methode kan worden toegepast voor de analyse van S-acylation in een breed scala van biologische monsters, waaronder weefsels en diepgevroren celmonsters20,21. Deze methode is gebaseerd op selectieve decolleté van de thioesterbinding tussen de acylgroep en het cysteïneresidu door neutrale hydroxylamine. De bevrijde thiolgroepen worden vervolgens gevangen met een thiol-reactief biotinederivaat. De gegenereerde bioatlateeiwitten worden vervolgens affiniteitgezuiverd met streptavidinaaga en geanalyseerd door immunoblotting.
Een alternatieve aanpak genoemd acyl-hars bijgestaan vangen (Acyl-RAC) werd later geïntroduceerd om de biotinylation stap te vervangen door directe vervoeging van vrije cysteïnedoor een thiol-reactieve hars22,23. Deze methode heeft minder stappen in vergelijking met ABE en kan op dezelfde manier worden gebruikt om eiwit S-acylation te detecteren in een breed scala van monsters1.
Acyl-RAC bestaat uit 4 hoofdstappen (figuur 1),
1. Blokkering van vrije thiolgroepen;
2. Selectieve splitsing van de cysteïne-acylthioesterbinding met neutrale hydroxylamine (HAM) om cysteïnethiolgroepen bloot te leggen;
3. Het vastleggen van de lipide cysteïnen met een thiol-reactieve hars;
4. Selectieve verrijking van de S-acylated eiwitten na elutie met reducerende buffer.
De gevangen eiwitten kunnen vervolgens worden geanalyseerd door immunoblotting of onderworpen aan massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics om het S-acylated proteome te beoordelen in een gevarieerd scala van soorten en weefsels22,24,25. Individuele S-acylation sites kunnen ook worden geïdentificeerd door trypsine vertering van de gevangen eiwitten en analyse van de resulterende peptiden door LC-MS/MS22. Hier laten we zien hoe acyl-RAC kan worden gebruikt voor gelijktijdige detectie van S-acylation van meerdere eiwitten in zowel een cellijn als een weefselmonster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen gebruikt in dit protocol werden geëuthanaseerd volgens NIH richtlijnen. Het Comité voor dierenwelzijn van de University of Texas Health Science Center in Houston keurde al het dierenwerk goed.
1. Bereiding van cellysataten
- Bereid de lysisbuffer voor zoals beschreven in tabel 1. Voeg 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside wasmiddel (DDM) toe en draai om op te lossen tot 10 mL PBS. Voeg 100 μL fosforremmercocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) en proteaseremmercocktail (1x) toe en koel de buffer voor gebruik op ijs.
- Breng de vereiste media met cellen uit de couveuse over in conische buizen van 15 mL of 50 mL en spincellen op 350 x g gedurende 5 min en aangezogen om zich te ontdoen van elk celpuin.
OPMERKING: We gebruikten 1 x 107 cellen voor elke acyl-RAC reactie die moest worden uitgevoerd. - Was de pellet door het opnieuw op te schorten in 5 mL PBS en te spinnen op 350 x g gedurende 5 min.
OPMERKING: Voer stap 1.3 snel uit om cellyse te voorkomen als gevolg van langdurige incubatie in PBS. - Voeg 600 μL lysisbuffer bereid in stap 1.1 toe aan de pellet en lyse door te schudden bij 1500 tpm in een thermische shaker gedurende 30 min bij 4 °C.
- Duidelijk lysates door centrifugering bij 20.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min tot pellet wasmiddel-onoplosbare materialen. Verzamel gerooide lysate in voorgekoelde 1,5 mL microfuge buizen en houd ze op ijs.
- Voer een Bradford / BCA test uit om de eiwitconcentratie te schatten. Het is van cruciaal belang om dezelfde hoeveelheid eiwit te garanderen in verschillende monsters voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Wij raden aan om minstens 500 μg eiwit per reactie te gebruiken.
OPMERKING: In de beschreven experimenten gebruikten we gekweekte (Jurkat) cellen en primaire splenocyten uit muizenweefsel. De hierboven beschreven lysismethode kan ook worden gebruikt voor andere celtypen. De gemiddelde eiwitconcentratie voor bovengenoemde celtypen is ongeveer 500 μg per 1 x 107 cellen. Jurkatcellen werden gehandhaafd in RPMI-1640 medium dat is aangepast tot 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 4.500 mg/L glucose en 1.500 mg/L natriumbicarbonaat aangevuld met 10% FBS bij 37 °C met 5% CO2. We gebruikten 1 x 107 Jurkat cellen per reactie. Primaire splenocyten werden geïsoleerd van muis miltweefsel zoals beschreven26. Kortom, miltweefsel werd gemacereerd op ijs, gevolgd door lyse van erythrocyten in hypotonische oplossing en scheiding van de lymfocyten door centrifugatie. We gebruikten 1 x 107 primaire cellen per reactie.
2. Acyl-RAC: Blokkeren van vrije thiolgroepen
LET OP: Alle volgende stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT).
- Breng lysate in een verse 1,5 mL microfuge buis en voer chloroform-methanol (CM) neerslag zoals hieronder beschreven.
- Voeg methanol (MeOH) en chloroform (CHCl3)toe aan het lysaat bij een eindverhouding van lysaat: MeOH: CHCl3 van 2:2:1 en schud krachtig om een homogene suspensie te creëren.
- Draai op 10.000 x g gedurende 5 min om een pellet ("pannenkoek") te vormen in de interfase tussen waterige en organische fasen.
- Kantel de buis en zuig zoveel mogelijk oplosmiddel en een naald of een gellaadtip.
- Laat de eiwitpellet een paar minuten drogen en was het voorzichtig door 600 μL MeOH toe te voegen en voorzichtig te mengen om te voorkomen dat de pellet wordt afgebroken
- Verwijder voorzichtig de resterende MeOH en droog de eiwitpellet op een benchtop gedurende ongeveer 5 minuten.
- (Optioneel) Voer een extra centrifugatiestap uit om een afgebroken pellet na de MeOH-wasbeurt te laten lopen om verlies van monster te voorkomen.
OPMERKING: Het experiment kan worden gestopt na de CM-neerslagstap. Zodra de pellet is verkregen, kan deze tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C.- Los de eiwitpellet op in 200 μL 2SHB-buffer door bij 42 °C/1500 tpm in een thermische shaker te draaien totdat de pellet is opgelost.
- (Optioneel) Incubeer voor een extra 5-10 min in een sonicerend waterbad om de pellet op te lossen.
LET OP: De lengte van de sonicatie varieert afhankelijk van de oplosbaarheid van het materiaal. Langdurige sonicatie kan echter eiwitafbraak veroorzaken.
- Bereid 0,2% methylmethaanthiosulfonaat (MMTS) (v/v) voor in 2SHB door 2 μL MMTS toe te voegen aan 998 μL 2SHB-buffer.
LET OP: Gebruik vers bereide 0,2% MMTS voor elk experiment. - Voeg 200 μL van 0,2% MMTS in 2SHB toe aan elke buis tot een uiteindelijke concentratie van 0,1% MMTS. Incubeer gedurende 15 min bij 42 °C met schudden bij 1500 tpm in een thermische shaker.
3. Acyl-RAC: Hydroxylamine (HAM) decolleté en vangst van S-acylated eiwitten
- Herhaal 3-4x CM neerslag zoals hierboven beschreven om MMTS te verwijderen. Verwijdering van MMTS kan worden geschat door het ontbreken van verschillende geur van MMTS. Los na elke neerslag de pellet op in 100 μL 2SHB-buffer door bij 42 °C/1500 tpm in een thermische shaker te draaien totdat de pellet oplost en verdun dan met 300 μL buffer A.
- Los na de laatste neerslag monsters op in 200 μL 2SHB-buffer zoals hierboven beschreven en verdun met 240 μL buffer A.
- In het geval van het vergelijken van veranderingen in S-acylation in reactie op verschillende behandelingsvoorwaarden, meet u de eiwitconcentratie opnieuw en gaat u verder met een gelijke hoeveelheid eiwit voor elke aandoening.
- Bewaar 40 μL van elk monster als invoerregeling.
- Splits monsters in twee gelijke delen van 200 μL en markeer buizen als "+ HAM" en "- HAM". Voeg 50 μL vers bereide neutrale 2 M HAM (pH 7,0-7,5) toe aan een eindconcentratie van 400 mM aan een van de buizen (+ HAM) en 50 μL neutrale 2 M NaCl aan de tweede buis (- HAM), die zal worden gebruikt als een negatieve controle. Ga over tot toevoeging van thiopropyl-Sepharose (TS) kralen.
OPMERKING: Het experiment kan worden gestopt na een van de CM-neerslagstappen. Zodra de pellet is verkregen, kan deze tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C. Neutrale pH van 2 M HAM zorgt voor de selectiviteit van de acyl-cysteïne thioester binding en moet zorgvuldig worden aangepast. Bij het hanteren van monsters in de 2SHB-buffer moet worden opgelet om verlies van monster als gevolg van overmatig schuimvorming te voorkomen. Alle volgende stappen zijn identiek voor - HAM en + HAM monsters. - Voeg 30 μL TS-kraaldrijfmest toe aan elke buis en draai de buizen 1-2 uur bij RT.
- Was de TS kralen 4x met 1% SDS in Buffer A om resterende HAM te verwijderen.
- Draai voorzichtig alle kraalmonsters met behulp van een microfuge voor 1 min en voorzichtig aanzuigen de supernatant.
- Hang de kralen opnieuw op in 500 μL of 1% SDS in Buffer A.
- Herhaal stap 3.7.1–3.7.2 driemaal.
LET OP: Geactiveerde thiopropyl-Sepharose (TS) wordt gevriesdroogd in aanwezigheid van additieven die vóór de koppeling bij neutrale pH moeten worden weggespoeld. Gedestilleerd water wordt aanbevolen voor zwelling en wassen. Weeg 0,1 g kralen en resuspend in 1 mL van gedestilleerd water en laat het zwellen tijdens het draaien gedurende 30 min-1 uur bij RT. Was kralen 1x met buffer A en bereid een drijfmest met buffer A, in een verhouding van 50% geregeld medium tot 50% buffer. Gezwollen TS kan worden opgeslagen bij neutrale pH in aanwezigheid van 20% ethanol bij 4 °C tot een week. Gebruik natriumazide niet als bacteriostatisch middel, omdat azide-ionen reageren met de 2-pyridyldisulfidegroepen. Voor een hogere efficiëntie, bereiden verse kralen. Tijdens het hanteren van de kralen kan de punt van een P200 pipettip iets worden gesneden om schade te voorkomen.
LET OP: Het experiment kan worden gestopt in elk stadium na CM neerslag. De pellet mag tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C.
4. Elutie en detectie van S-acylated eiwitten
- Na de laatste wasbeurt, voorzichtig spin de kralen zoals hierboven beschreven en aanzuigen zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.
- Herstel de eiwitten uit kralen met 4x SDS monsterbuffer met DTT.
- Voeg 50 μL 4x SDS monsterbuffer toe aan de kralen en incubeer bij 80 °C, 1500 tpm gedurende 15 min in een thermische shaker. Laat de buizen afkoelen.
- Centrifugeer de kralen op 5.000 x g gedurende 3 min om de kralen volledig te pelleten en de geëlute eiwitten over te brengen naar een verse buis van 1,5 mL met behulp van een gellaadtip.
- Voer SDS-PAGE uit en analyseer S-acylation van het eiwit(en) van belang door westerse blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naar aanleiding van het hierboven beschreven protocol, gebruikten we eerst acyl-RAC om tegelijkertijd s-acylation van verschillende eiwitten in Jurkat cellen te detecteren, een vereeuwigde T-cellijn oorspronkelijk afgeleid van het perifere bloed van een T-cel leukemie patiënt27. Regulerende T-celeiwitten die eerder als S-acylated9,28,,29 werden geïdentificeerd om het nut van deze methode aan te tonen. Zoals blijkt uit figuur 2A, tyrosine kinase Lck kan worden gedetecteerd in lysaten behandeld met neutrale 2 M hydroxylamine om de thioester band tussen cysteïne residuen en een vetzuur moiety (+ HAM lane) kloven. Het monster behandeld met 2 M NaCl (- HAM lane) vertegenwoordigt een belangrijke negatieve controle, die de selectiviteit van de test voor de detectie van de thioester obligaties aangeeft. De ingangssteeg bevestigt verder de specificiteit van het signaal en kan als positieve controle dienen als het eiwit van belang niet S-acylated is. Het membraan werd vervolgens gestript en gereprobedeerd met antilichamen tegen eiwitten Fyn en LAT om aan te tonen dat de acyl-RAC test kan worden gebruikt om S-acylation van meerdere eiwitten te analyseren op hetzelfde moment (Figuur 2A).
Om het nut van deze methode aan te tonen om eiwit S-acylation in weefselmonsters te detecteren, pasten we het acyl-RAC-protocol toe op de muismilt. Zoals blijkt uit figuur 2B, S-acylation van Lck, Fyn en LAT kan gemakkelijk worden gedetecteerd in primaire muis splenocyten waaruit blijkt dat deze wijziging wordt bewaard tussen twee soorten.
Figuur 1. Schematische weergave van acyl-RAC. De methode bestaat uit 4 hoofdstappen: (1) het blokkeren van vrije thiolgroepen met methylmethaanthiosulfonaat (MMTS), (2) selectief decolleté van de cysteïne-acylthioesterbinding met neutrale hydroxylamine (HAM) om cysteïnethiolgroepen bloot te leggen, (3) afvang van eiwitten met nieuw blootgestelde cysteïnethiol door directe vervoeging met een thiol-reactieve hars en (4) herstel van gevangen eiwitten met behulp van een reducerende elutiebuffer, gevolgd door immunoblotting of MS-analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Detectie van S-acylated eiwitten. Een acyl-RAC test werd gebruikt om S-acylation van T-cel signalering eiwitten in Jurkat T cellen (A) en murine miltweefsel (B) detecteren. Immunoblotting met Lck-, Fyn- en LAT-specifieke antilichamen toont S-acylation van deze eiwitten in het hydroxylamine behandelde monster (+ HAM lane). Een monster dat met natriumchloride (- HAM-rijstrook) wordt behandeld, dient als negatieve controle. Onbehandeld lysaten worden weergegeven in de inganglane. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Buffer | Samenstelling | Notities |
| Lysis Buffer (LB) | 1% DDM in DPBS; 10 μM ML211; Fosforremmer Cocktail 2 (1:100); Protease Inhibitor Cocktail (1X), PMSF (10 mM) | Bereid vers, chill bij 4 °C voor gebruik. |
| SDS-buffer (2SHB) | 2% SDS; 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7.4 | |
| Buffer A | 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7.4 | |
| Hydroxylamine (HAM) | 2 M voorraadoplossing in gedistilleerde H20 | Bereid je vers voor. Wanneer ham voor het eerst wordt opgelost, heeft een zeer lage pH. Gebruik 5 M NaOH om pH te pH tot 7-7,5. |
| 4x SDS-monsterbuffer | 200 mM Tris-Cl (pH 6.8), 8% SDS (natriumdodecylsulfaat) 0,01% Bromophenol blauw, 10% glycerol | Supplement met 5 mM DTT vlak voor gebruik. |
Tabel 1: Buffersamenstelling van veelgebruikte buffers die in het protocol vereist zijn. 2SHB buffer en Buffer A kunnen vooraf worden voorbereid, maar hun pH moet regelmatig worden gecontroleerd. Lysis buffer en HAM moeten worden voorbereid op de dag van het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we met succes gebruik gemaakt van de acyl-RAC test om S-acylation van geselecteerde eiwitten te detecteren in zowel gekweekte menselijke cellen en primaire cellen afgeleid van muisweefsel. Deze methode is eenvoudig, gevoelig, en kan gemakkelijk worden uitgevoerd met minimale apparatuur eisen met behulp van standaard biochemie technieken. Deze methode is aangetoond dat het met succes nieuwe S-acylated eiwitten te identificeren, zoals de β-subeenheid van het eiwit translocating systeem (Sec61b),Sribosomal eiwit S11 (Rps11), en microsomal glutathion- S-transferase 3 (MGST3)22. De gevoeligheid en het aanpassingsvermogen van acyl-RAC maakt het geschikt om eiwit S-acylation te bestuderen in een verscheidenheid van biologische monsters.
Een aanzienlijk deel van de S-acylated eiwitten kan worden geassocieerd met glycosphingolipid-verrijkte delen van het plasmamembraan, ook wel bekend als lipide vlotten. Zo kunnen sommige S-acylated eiwitten niet volledig worden geëxtraheerd als milde detergenten, zoals Triton X-100, NP-40 of Brij58, worden gebruikt voor lysis30. Anionische detergentia (zoals SDS) of op maltoside gebaseerde niet-ionische detergentia (zoals n-dodecyl β-D-maltoside (DDM)) kunnen worden gebruikt om de dissociatie van lipidevlotten en het volledige herstel van de eiwitten van belang30,31,32te waarborgen . In dit protocol gebruikten we DDM, een mild, lipid-achtig niet-ionisch wasmiddel waarvan is aangetoond dat het effectief is in membraaneiwitextractie en het behoud van hun stabiele inheemse toestand gedurende langere perioden33.
De niet-gereglementeerde thioesteraseactiviteit tijdens lyse van het monster kan mogelijk leiden tot een verminderde eiwitopbrengst na de ts-pull-down stap en dus van invloed zijn op de detectie van S-acylated eiwitten. Een thioesteraseremmer, zoals ML211, een dubbele remmer voor Acyl-Eiwit Thioesterase 1 (APT1, LYPLA1) en Acyl-Eiwit Thioesterase 2 (APT2, LYPLA2) kan worden toegevoegd om willekeurige deacylation van eiwitten in lysaat34,35te voorkomen.
Een onvolledige blokkade van cysteïneresiduen kan leiden tot binding van niet-geacytte eiwitten aan TS, wat resulteert in een hoge achtergrond die duidelijk is door een hoog signaal in de –HAM-monsters. De achtergrondbinding kan aanzienlijk worden verminderd door een extra incubatie met een thiol-crosslinking agent-2,2'-dithiodipyridine zoals beschreven in een gewijzigd ABE-protocol van Zhou et al.36.
In tegenstelling tot metabole etikettering is acyl-RAC niet beperkt tot levende cellen en kan worden uitgevoerd om eiwit S-acylation te detecteren in vers geïsoleerde of bevroren weefselmonsters. Aangezien het acyl-RAC-protocol een immunoneerslagstap vermijdt, kan het worden gebruikt om tegelijkertijd lipidatie van meerdere eiwitten te detecteren die van belang zijn voor dezelfde test, waardoor de hoeveelheid biologisch materiaal die nodig is in een enkel experiment, mogelijk wordt verminderd. Metabolische etiketteringstests zijn echter meer geschikt voor experimenten die specifiek gericht zijn op het detecteren van de novo S-acylation of het meten van de omzet van vetzuur op een eiwit van belang. Een andere belangrijke beperking van acyl-RAC is dat deze techniek geen onderscheid kan maken tussen verschillende vetzuren die via dezelfde thioesterbinding3,4,5,6,7covalent kunnen worden gebonden aan de cysteïneresiduen .
Zowel acyl-RAC als ABE-testen zijn gebaseerd op selectieve decolleté van de thioesterbinding tussen het cysteïneresidu en een vetzuur om een vrije thiolgroep te onthullen. Aangezien acyl-RAC gebruik maakt van directe pull-down van S-acylated eiwitten door een thiol-reactieve hars, deze methode vereist minder stappen in vergelijking met ABE. Hoewel vergelijkbaar, proteome-brede studies van S-acylation tonen enige variatie in de eiwitten gedetecteerd met behulp van deze twee methoden, waarschijnlijk te wijten aan de technische verschillen. In het homogenaat van rattenhersenen identificeerde abe-gebaseerde analyse bijvoorbeeld 241 S-acylated eiwitten, terwijl een analyse op basis van acyl-RAC 14425identificeerde. 61 eiwitten in de rat hersenen proteoom werden vaak gedetecteerd door beide methoden onderstrepen de noodzaak voor het gebruik van meerdere technieken om de S-acylation status van een eiwit vast te stellen.
Een ander potentieel nadeel van acyl-RAC- en ABE-methoden is het onvermogen om stoichiometry van S-acylation betrouwbaar te evalueren en het aantal lipide cysteïnen te bepalen. Een wijziging van deze technieken, zogenaamde acyl-PEG exchange of PEG-shift test, werd ontwikkeld om deze beperkingen aan te pakken37,38. Bij deze methode wordt de pull-down stap na hydroxylamine decolleté vervangen door incubatie met een PEG-maleimide mass-tag. Resulterende PEGylation van de blootgestelde vrije cysteïneresiduen kan worden waargenomen als massaverschuiving door SDS-PAGE.
Tot slot is acyl-RAC een snelle, gevoelige en betrouwbare methode die waardevolle inzichten kan bieden in de dynamiek van eiwit S-acylation onder zowel fysiologische als pathofysiologische omstandigheden in een grote verscheidenheid aan biologische monsters. Gezien de beperkingen van de hierboven besproken methode, wordt een combinatie van acyl-RAC met andere technieken aanbevolen om S-acylation van een eiwit van belang volledig te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies 5R01GM115446 en 1R01GM130840.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
References
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
- Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
- DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
- Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
- Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
- Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
- Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
- Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
- Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
- Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).
- O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
- Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
- Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
- Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
- Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
- Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
- Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
- Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
- Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
- Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
- Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
- Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
- Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
- Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
- Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
- Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
- Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
- Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
- Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
- Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).
