Summary
Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) è un metodo altamente sensibile, affidabile e facile da eseguire per rilevare la modifica reversibile dei lipidi dei residui di cisteina (S-acylation) in una varietà di campioni biologici.
Abstract
Protein S-acylation, noto anche come S-palmitoylation, è una modifica post-traduzionale reversibile dei residui di cisteina con acidi grassi a catena lunga tramite un legame di tioestro labile. La S-acylation, che sta emergendo come un meccanismo regolatore diffuso, può modulare quasi tutti gli aspetti dell'attività biologica delle proteine, dalla formazione complessa al traffico di proteine e alla stabilità delle proteine. I recenti progressi nella comprensione della funzione biologica della proteina S-acylation sono stati raggiunti in gran parte grazie allo sviluppo di nuovi strumenti biochimici che consentono il rilevamento robusto e sensibile della proteina S-acylation in una varietà di campioni biologici. Qui, descriviamo la cattura assistita da resina acilosa (Acyl-RAC), un metodo recentemente sviluppato basato sulla cattura selettiva di proteine endogeneamente Aclaate con perline sepharose thiol-reattive. Rispetto agli approcci esistenti, Acyl-RAC richiede meno passaggi e può produrre risultati più affidabili se accoppiato con spettrometria di massa per l'identificazione di nuovi obiettivi S-acylation. Una delle principali limitazioni di questa tecnica è la mancanza di capacità di discriminare tra le specie di acidi grassi attaccate ai cistein attraverso lo stesso legame di tiopee.
Introduction
La S-acylation è una modifica post-traduzionale reversibile che comporta l'aggiunta di una catena di acili grassi a un residuo di cisteina interno su una proteina bersaglio tramite un legame di tioestro labile1. È stato segnalato per la prima volta come una modifica delle proteine con palmitate, un acido grasso 16-carbonio saturo2, e quindi questa modifica è spesso indicata come S-palmitoylation. Oltre al palmitato, le proteine possono essere reversibilmente modificate da una varietà di acidi grassi più lunghi e più brevi saturi (miristata e stearate), monoinsaturi (oleati) e polinsaturi (arachidonate ed eicosapentanoa)acidigrassi 3,4,5,6,7. Nelle cellule eucariotiche, la S-acylation è catalizzata da una famiglia di enzimi noti come acyltransferesteraes proteici DHHC e la reazione inversa della deacylazione dei cistein è catalizzata da tiosi proteici, la maggior parte dei quali rimangono ancora enigmatici8.
La leggibilità del legame di tioestro rende reversibile questa modifica dei lipidi, permettendogli di regolare dinamicamente il clustering proteico, la localizzazione della membrana plasmatica, il traffico intracellulare, le interazioni proteina-proteina e la stabilità proteica9,10. Di conseguenza, l'acilazione scisa è stata collegata a diversi disturbi tra cui la Malattia di Huntington, il morbo di Alzheimer e diversi tipi di cancro (prostata, gastrica, vescica, polmone, colorettale), che richiede lo sviluppo di metodi affidabili per rilevare questa modifica delle proteine post-traduzionale11.
L'etichettatura metabolica con palmita radioattiva ([3H], [14C] o [125I]) è stato uno dei primi approcci sviluppati per formulare la proteina S-acylation12,13,14. Tuttavia, i metodi basati sulla radioetichettatura presentano problemi di salute, non sono molto sensibili, richiedono molto tempo e rilevano solo la lipidazione di proteine altamente abbondanti15. Un'alternativa più veloce e non radioattiva alla radioetichettatura è l'etichettatura metabolica con sonde di acidi grassi bioortogonali, che viene utilizzata regolarmente per testare la dinamica della proteina S-acylation16. In questo metodo, un acido grasso con un reporter chimico (gruppo alchine o azide) è incorporato nella proteina S-acilato da un acyltransferase proteico. La reazione di cicloaddition Azide-alkyne Huisgen (chimica del clic) può quindi essere utilizzata per attaccare un gruppo funzionato, come un fluoroforo o biotina, all'acido grasso integrato che consente di rilevare la proteina S-acilata17,18,19.
Lo scambio di acyl-biotin (ABE) è uno dei metodi biochimici ampiamente utilizzati per la cattura e l'identificazione di proteine S-acylated che bypassa alcune delle carenze dell'etichettatura metabolica come l'inadeguatezza per i campioni di tessuto15. Questo metodo può essere applicato per l'analisi di S-acylation in una vasta gamma di campioni biologici, tra cui tessuti e campioni di cellule congelate20,21. Questo metodo si basa sulla scissione selettiva del legame tra il gruppo acileere e il residuo di cisteina da idrossilamina neutra. I gruppi tioli liberati vengono poi catturati con un derivato della biotina thiol-reattiva. Le proteine biotinylate generate vengono quindi purificate dall'affinità con streptavidin agarose e analizzate mediante immunoblotting.
Un approccio alternativo chiamato acyl-resina assistita capture (Acyl-RAC) è stato successivamente introdotto per sostituire la fase di biotinylazione con coniugazione diretta di cistein liberi da una resina thiol-reattiva22,23. Questo metodo ha meno passaggi rispetto ad ABE e allo stesso modo può essere utilizzato per rilevare proteina S-acylation in una vasta gamma di campioni1.
Acyl-RAC è costituito da 4 passaggi principali (Figura 1),
1. Blocco dei gruppi di thiol liberi;
2. Scissione selettiva del legame cisteina-acilo con idrossilamina neutra (HAM) per esporre i gruppi di cisteina;
3. Cattura dei cistein lipidati con una resina thiol-reattiva;
4. Arricchimento selettivo delle proteine aclatato da S dopo l'eluizione con riduzione del tampone.
Le proteine catturate possono quindi essere analizzate mediante immunoblotting o sottoposte a proteometria di massa (MS) per valutare il proteoma aclato da S in una vasta gamma di specie e tessuti22,24,25. I singoli siti di S-acylation possono anche essere identificati mediante la digestione della trypsin acquisizione delle proteine catturate e l'analisi dei peptidi risultanti da LC-MS/MS22. Qui, dimostriamo come acyl-RAC può essere utilizzato per il rilevamento simultaneo di S-acylation di più proteine sia in una linea cellulare che in un campione di tessuto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I topi utilizzati in questo protocollo sono stati eutanasiati secondo le linee guida NIH. L'Animal Welfare Committee dell'Università del Texas Health Science Center di Houston ha approvato tutto il lavoro sugli animali.
1. Preparazione dei lismi cellulari
- Preparare il buffer di lisi come descritto nella tabella 1. A 10 mL di PBS, aggiungere 0,1 g di detergente n-dodecyl (DDM) e ruotare per sciogliere. Aggiungete 100 l di fosphatase inhibitor cocktail 2, ML211 (10 m), PMSF (10 mM) e cocktail inibitore della proteasi (1x) e raffreddare il tampone sul ghiaccio prima dell'uso.
- Trasferire i supporti necessari contenenti le cellule dell'incubatrice in tubi conici da 15 mL o 50 mL e le cellule di spin a 350 x g per 5 min e aspirare per sbarazzarsi di eventuali detriti cellulari.
NOTA: Abbiamo usato 1 x 107 celle per ogni reazione acilo-RAC da eseguire. - Lavare il pellet rispendendolo in 5 mL di PBS e ruotando a 350 x g per 5 min.
NOTA: Eseguire rapidamente il passaggio 1.3 per evitare la lisi cellulare a causa di un'incubazione prolungata in PBS. - Aggiungere 600 lofildi di lisi tampone preparato al punto 1.1 al pellet e lo sileria a 1500 giri/m in uno shaker termico per 30 min a 4 gradi centigradi.
- Lisati chiari per centrifugazione a 20.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 min a pellet detersivo-materiali solubili. Raccogliere il lisato eliminato in tubi di microfuge pre-raffreddati da 1,5 mL e tenerli sul ghiaccio.
- Eseguire un saggio Bradford/BCA per stimare la concentrazione di proteine. È fondamentale garantire la stessa quantità di proteine tra campioni diversi prima di eseguire l'esperimento. Si consiglia di utilizzare almeno 500 g di proteine per reazione.
NOTA: Negli esperimenti descritti, abbiamo usato cellule coltivate (Jurkat) e splenociti primari dal tessuto dei topi. Il metodo di lisi descritto sopra può essere adottato anche ad altri tipi di cellule. La concentrazione media di proteine ottenuta per i tipi di cellule di cui sopra è di circa 500 g per 1 x 107 cellule. Le cellule Jurkat sono state mantenute in RPMI-1640 media modificato per contenere 2 mM L-glutamine, 10 m HEPES, 1 mM di pyruvate di sodio, 4.500 mg/l di glucosio e 1.500 mg/L bicarbonato di sodio integrato con 10% FBS a 37 s.C con 5% CO2. Abbiamo usato 1 x 107 cellule Jurkat per reazione. Gli splenociti primari sono stati isolati dal tessuto della milza del topo come descritto26. In breve, il tessuto della milza è stato macerato sul ghiaccio, seguito da lisi di eritrociti in soluzione ipotonica e separazione dai linfociti dalla centrifugazione. Abbiamo usato 1 x 107 cellule primarie per reazione.
2. Acyl-RAC: Blocco dei gruppi thiol liberi
NOTA: tutti i passaggi successivi possono essere eseguiti a temperatura ambiente (RT).
- Trasferire il lisato in un nuovo tubo di microfuge da 1,5 ml ed eseguire la precipitazione cloroformio-metanolo (CM) come descritto di seguito.
- Aggiungere metanolo (MeOH) e cloroformio (CHCl3) al lisato ad un rapporto finale di lisato: MeOH: CHCl3 di 2:2:1 e agitare vigorosamente per creare una sospensione omogenea.
- Girare a 10.000 x g per 5 min per formare un pellet ("pancake") all'interfase tra fasi acquose e organiche.
- Inclinare il tubo e aspirare il più possibile il solvente utilizzando un ago o una punta di carico gel.
- Asciugare l'aria del pellet proteico per alcuni minuti e lavarlo delicatamente aggiungendo 600 lofe di MeOH e mescolando delicatamente per evitare di rompere il pellet
- Rimuovere con cura il restante MeOH e asciugare il pellet proteico su un banco per circa 5 minuti.
- (Facoltativo) Eseguire un ulteriore passo di centrifugazione per ruotare verso il basso qualsiasi pellet rotto dopo il lavaggio MeOH per evitare la perdita di campione.
NOTA: l'esperimento può essere interrotto dopo la fase di precipitazione CM. Una volta ottenuto, il pellet può essere conservato in 500 gradi di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana.- Sciogliere il pellet proteico in un buffer da 2SHB da 2SHB vortice a 42 s/1500 rpm in uno shaker termico fino a quando il pellet non viene sciolto.
- (Facoltativo) Incubare per altri 5-10 min in un bagno d'acqua sonicante per sciogliere il pellet.
NOTA: La durata della sonicazione varia a seconda della solubilità del materiale. Tuttavia, la sonicazione prolungata può causare la degradazione delle proteine.
- Preparare lo 0,2% di metano metilethiosulfonate (MMTS) (v/v) in 2SHB aggiungendo 2 L di MMTS a 998 l l di buffer 2SHB.
NOTA: utilizzare 0,2% MMTS appena preparato per ogni esperimento. - Aggiungere 200 L dello 0,2% MMTS in 2SHB ad ogni tubo ad una concentrazione finale dello 0,1% MMTS. Incubare per 15 min a 42 sc con agitazione a 1500 giri/m in uno shaker termico.
3. Acyl-RAC: Scissione dell'idrossilamina (HAM) e cattura delle proteine Aciolate S
- Ripetere le precipitazioni 3-4x CM come descritto in precedenza per rimuovere MMTS. La rimozione di MMTS può essere stimata dalla mancanza di odore distinto di MMTS. Dopo ogni precipitazione, sciogliere il pellet in un buffer da 100 gradi di 2SHB vorticendo a 42 s/1500 giri/min in uno shaker termico fino a quando il pellet si dissolve, quindi diluire con 300L di buffer A.
- Dopo la precipitazione finale, sciogliere i campioni in 200 - L di buffer 2SHB come descritto sopra e diluire con 240 L del buffer A.
- In caso di confronto dei cambiamenti nella S-acylation in risposta a diverse condizioni di trattamento, misurare nuovamente la concentrazione di proteine e procedere con la stessa quantità di proteine per ogni condizione.
- Conservare 40 l da ogni campione come controllo di input.
- Suddividere i campioni in due parti uguali di 200 -L e marcare i tubi come "HAM" e "- HAM". Aggiungere 50 L di 2 M HAM neutro appena preparato (pH 7,0-7,5) ad una concentrazione finale di 400 mM a uno dei tubi (HAM) e 50 L di 2 M NaCl neutro al secondo tubo (- HAM), che verrà utilizzato come controllo negativo. Procedere con l'aggiunta di perline tiopropile-sefarose (TS).
NOTA: l'esperimento può essere interrotto dopo una qualsiasi delle fasi di precipitazione CM. Una volta ottenuto, il pellet può essere conservato in 500 gradi di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana. PH neutro di 2 M HAM garantisce la sua selettività per il legame acyl-cysteine thioester e deve essere regolato con attenzione. Prestare attenzione quando si maneggiano campioni nel buffer 2SHB per evitare la perdita di campione a causa di schiuma eccessiva. Tutti i passaggi seguenti sono identici per - campioni di HAM e HAM. - Aggiungere 30 lofan di tallone-slurry ad ogni tubo e ruotare i tubi per 1-2 h a RT.
- Lavare le perline TS 4x con 1% SDS nel buffer A per rimuovere il HAM residuo.
- Girare delicatamente verso il basso tutti i campioni di tallone utilizzando un microfugo per 1 min e aspirare con attenzione il supernatante.
- Risospendere le perline in 500 -L dell'1% di SDS nel buffer A.
- Ripetere il passaggio 3.7.1–3.7.2 tre volte.
NOTA: il tiopropile-sepharose (TS) attivato viene fornito liofilizzato in presenza di additivi che devono essere lavati via al pH neutro prima dell'accoppiamento. L'acqua distillata è raccomandata per il gonfiore e il lavaggio. Pesare 0,1 g di perline e risospendere in 1 mL di acqua distillata e lasciarla gonfiare mentre ruota per 30 min-1 h a RT. Lavare perline 1x con buffer A e preparare un liquame con buffer A, in un rapporto del 50% stabilizzato medio al 50% tampone. Swollen TS può essere conservato a pH neutro in presenza di 20% etanolo a 4 gradi centigradi fino a una settimana. Non usare azide di sodio come agente batteriostatico poiché gli ioni di azide reagiscono con i gruppi disulfide 2-pyridyl. Per una maggiore efficienza, preparare perline fresche. Durante la manipolazione delle perline, la punta di una punta di pipetta P200 può essere tagliata leggermente in modo da evitare danni.
NOTA: l'esperimento può essere interrotto in qualsiasi fase dopo la precipitazione CM. Il pellet può essere conservato in 500 gradi L di MeOH in -20 gradi centigradi fino a una settimana.
4. Elusione e rilevamento di proteine acilate A S
- Dopo l'ultimo lavaggio, girare delicatamente verso il basso le perline come descritto sopra e aspirare quanto più supernatante possibile senza disturbare le perline.
- Recuperare le proteine da perline con 4x sDS buffer campione con DTT.
- Aggiungete 50 l di 4x buffer di campione SDS alle perline e incubate a 80 gradi centigradi, 1500 giri/m per 15 min in uno shaker termico. Lasciare raffreddare i tubi.
- Centrifugare le perline a 5.000 x g per 3 min per pellet completamente le perline e trasferire le proteine eluite in un tubo fresco da 1,5 mL utilizzando una punta di carico del gel.
- Eseguire SDS-PAGE e analizzare S-acylation delle proteine di interesse da gonfiore occidentale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seguendo il protocollo descritto sopra, abbiamo usato per la prima volta acyl-RAC per rilevare simultaneamente l'acilazione S di diverse proteine nelle cellule Jurkat, una linea cellulare T immortalata originariamente derivata dal sangue periferico di un paziente con leucemia delle cellule T27. Proteine cellulari T regolatorie precedentemente identificate come S-acylated9,28,29 sono stati scelti per dimostrare l'utilità di questo metodo. Come mostrato nella Figura 2A, la tirosina chinasi Lck può essere rilevata nei lisati trattati con idrossilamina neutra 2 M per fendere il legame di tioestro tra i residui di cisteina e una moiety di acidi grassi (lane HAM). Il campione trattato con 2 M NaCl (- ham lane) rappresenta un importante controllo negativo, che indica la selettività del saggio per il rilevamento dei legami del tioestro. La corsia di ingresso conferma ulteriormente la specificità del segnale e può servire come un controllo positivo se la proteina di interesse non è S-acylated. La membrana è stata poi spogliata e risondata con anticorpi contro le proteine Fyn e LAT per dimostrare che il saggio acyl-RAC può essere utilizzato per analizzare la S-acylation di più proteine contemporaneamente (Figura 2A).
Per dimostrare l'utilità di questo metodo per rilevare la proteina S-acylation in campioni di tessuto, abbiamo applicato il protocollo acyl-RAC alla milza del topo. Come illustrato nella Figura 2B, S-acylation of Lck, Fyn e LAT può essere facilmente rilevato negli splenociti primari del mouse che indicano che questa modifica è conservata tra due specie.
come illustrato nella Figura 1. Rappresentazione schematica di acyl-RAC. Il metodo consiste in 4 passaggi principali: (1) bloccando i gruppi di tiolo libero con metathiosulfonato metilico (MMTS), (2) scissione selettiva del legame cisteine-acyl tioester con idrossilamina neutra (HAM) per esporre i gruppi di cisteinathil, (3) cattura di proteine con cinol appena esposto mediante coniugazione diretta con una resina thiol-reattiva e (4) recupero delle proteine catturate utilizzando un buffer di elizione di riduzione, seguito da immunoblotting o analisi MS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rilevamento di proteine acilate S. Un saggio acyl-RAC è stato utilizzato per rilevare l'aclicazione delle cellule S delle proteine di segnalazione delle cellule T nelle cellule T Jurkat (A) e nel tessuto della milza murina (B). L'immunobloificazione con anticorpi specifici di Lck, Fyn- e LAT mostra la S-acylation di queste proteine nel campione trattato con idrossilamina (corsia HAM). Un campione trattato con cloruro di sodio (- corsia HAM) serve come controllo negativo. I lisati non trattati vengono visualizzati nella corsia di input. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer | Composizione | Note |
| Buffer di Lisi (LB) | 1% DDM in DPBS; 10 MM ML211; Fosforae Inhibitor Cocktail 2 (1:100); Protease Inhibitor Cocktail (1X), PMSF (10 mM) | Preparare fresco, raffreddare a 4 gradi centigradi prima dell'uso. |
| Buffer SDS (2SHB) | 2% SDS; 5 mM EDTA; 100 mHE; pH 7,4 | |
| Buffer A | 5 mM EDTA; 100 mHE; pH 7,4 | |
| Idrossilamina (HAM) | Soluzione di magazzino 2 M in distillato H20 | Preparatevi freschi. Quando viene sciolto per la prima volta, HAM ha un pH molto basso. Utilizzare 5 M NaOH per pH a 7-7.5. |
| Buffer di esempio SDS 4X | 200 mM Tris-Cl (pH 6,8), 8% SDS (solfato di sodio al sodio dodecyl) 0.01% Bromophenol blu, 10% glicerolo | Supplemento con 5 mM DTT appena prima dell'uso. |
Tabella 1: composizione del buffer dei buffer di uso comune necessari nel protocollo. Il buffer 2SHB e il buffer A possono essere preparati in anticipo, ma il loro pH deve essere controllato regolarmente. Il buffer di lisi e HAM devono essere preparati il giorno dell'esperimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui, abbiamo utilizzato con successo il saggio acyl-RAC per rilevare l'acilazione S di proteine selezionate sia nelle cellule umane coltivate che nelle cellule primarie derivate dal tessuto del topo. Questo metodo è semplice, sensibile e può essere facilmente eseguito con requisiti minimi di attrezzatura utilizzando tecniche di biochimica standard. È stato dimostrato che questo metodo identifica con successo nuove proteine S-acilato, come la sottounità z del sistema di traslocazione delle proteine (Sec61b), la proteina ribosomica S11 (Rps11) e il glutathione microsomico- S-transferase 3 (MGST3)22.S La sensibilità e l'adattabilità di acyl-RAC lo rendono adatto per studiare la proteina S-acylation in una varietà di campioni biologici.
Una frazione significativa delle proteine S-acilato può essere associata a parti della membrana plasmatica arricchite con glicosphingolipid, note anche come zattere lipidiche. Così, alcune proteine S-acilato potrebbero non essere completamente estratte se detergenti lievi, come Triton X-100, NP-40 o Brij58, vengono utilizzati per la lisi30. Detergenti anionici (come SDS) o detergenti non ionici basati su malto (come n-dodecyl z-D-maltoside (DDM) possono essere utilizzati per garantire la dissociazione delle zattere lipidiche e il pieno recupero delle proteine di interesse30,31,32. In questo protocollo, abbiamo usato il DDM, un detergente non ionico mite, simile a ibiide, che ha dimostrato di essere efficace nell'estrazione delle proteine della membrana e mantenendo il loro stato nativo stabile per periodi prolungati33.
L'attività tioesterase non regolamentata durante la lisi del campione può potenzialmente comportare una riduzione della resa proteica dopo la fase di roll-down di TS e quindi influenzare il rilevamento delle proteine Aciclide. Un inibitore di thioesterase, come ML211, un doppio inibitore per Acyl-Protein Thioesterase 1 (APT1, LYPLA1) e Acyl-Protein Thiose 2 (APT2, LYPLA2) può essere aggiunto per prevenire indiscriminatale le proteine nel lisciato34,35.
Un blocco incompleto dei residui di cisteina può causare il legame di proteine non acilate a TS, risultando quindi in un elevato background evidente dal segnale elevato nei campioni –HAM. L'associazione di fondo può essere sostanzialmente ridotta da un'ulteriore incubazione con un agente tiol-crosslinking-2,2'-dithiodipyridine come descritto in un protocollo ABE modificato da .36
A differenza dell'etichettatura metabolica, l'acyl-RAC non si limita alle cellule vive e può essere eseguito per rilevare l'acilazione proteica S in campioni di tessuto appena isolati o congelati. Poiché il protocollo acyl-RAC evita una fase di immunoprecipitazioni, può essere utilizzato per rilevare contemporaneamente la lipidazione di più proteine di interesse nello stesso esempio, riducendo potenzialmente la quantità di materiale biologico necessaria in un singolo esperimento. Tuttavia, i test basati sull'etichettatura metabolica sono più adatti per esperimenti volti a rilevare specificamente de novo S-acylation o misurare i tassi di rotazione degli acidi grassi su una proteina di interesse. Un'altra importante limitazione di acyl-RAC è che questa tecnica non è in grado di distinguere tra diversi acidi grassi che possono essere legati in modo covalente ai residui di cisteina attraverso lo stesso legame thioester3,4,5,6,7.
Sia i test acyl-RAC che ABE si basano sulla scissione selettiva del legame tra il tioestro tra il residuo cisteina e un acido grasso per rivelare un gruppo di tiolo libero. Poiché acyl-RAC utilizza l'inserimento diretto di proteine S-acylated da una resina thiol-reattiva, questo metodo richiede meno passaggi rispetto ad ABE. Anche se simili, gli studi a livello di proteoma di S-acylation mostrano alcune variazioni nelle proteine rilevate utilizzando questi due metodi, molto probabilmente a causa delle differenze tecniche. Ad esempio, nell'omogenea cerebrale del ratto, l'analisi basata su ABE ha identificato 241 proteine S-acylated, mentre l'analisi acilo-RAC ha identificato 14425. 61 proteine nel proteoma cerebrale del ratto sono state comunemente rilevate da entrambi i metodi sottolineando la necessità di utilizzare più tecniche per accertare lo stato di S-acylation di una proteina.
Un altro potenziale inconveniente dei metodi acyl-RAC e ABE è l'incapacità di valutare in modo affidabile la stoichiometria dell'Acilazione S e determinare il numero di cistein lipidati. Una modifica di queste tecniche, definita acyl-PEG exchange o PEG-shift assay, è stata sviluppata per affrontare queste limitazioni37,38. In questo metodo, il passo pull-down dopo la scissione dell'idrossilamina viene sostituito dall'incubazione con un'etichetta di massa PEG-maleimide. La PEGylation risultante dei residui di cisteina liberi esposti può essere osservata come spostamento di massa da Parte di SDS-PAGE.
In conclusione, acyl-RAC è un metodo veloce, sensibile e affidabile che può fornire preziose informazioni sulle dinamiche della proteina S-acylation in condizioni fisiologiche e patologiche in una grande varietà di campioni biologici. Considerando le limitazioni del metodo discusso in precedenza, si raccomanda una combinazione di acyl-RAC con altre tecniche per caratterizzare completamente la S-acylation di una proteina di interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health grants 5R01GM115446 e 1R01GM130840.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
References
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
- Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
- DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
- Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
- Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
- Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
- Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
- Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
- Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
- Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).
- O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
- Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
- Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
- Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
- Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
- Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
- Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
- Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
- Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
- Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
- Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
- Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
- Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
- Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
- Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
- Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
- Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
- Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
- Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
- Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).
