Summary
아실-RAC(Acyl-Resin Assisted Capture)는 다양한 생물학적 샘플에서 시스테인 잔류물(S-acylation)의 가역적 지질 변형을 검출하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법입니다.
Abstract
단백질 S-아실화, 또한 S-팔미토일화라고도, 비질 티오에스터 결합을 통해 긴 사슬 지방산시스테인 잔류물의 가역 적인 번역 후 수정이다. 광범위한 규제 메커니즘으로 부상하고 있는 S-acylation은 복잡한 형성에서 단백질 인신 매매 및 단백질 안정성에 이르기까지 단백질의 생물학적 활성의 거의 모든 측면을 조절할 수 있습니다. 단백질 S-아실화의 생물학적 기능에 대한 이해의 최근 진전은 다양한 생물학적 샘플에서 단백질 S-아실화를 강력하고 민감하게 검출할 수 있도록 하는 새로운 생화학 적 도구의 개발로 인해 크게 달성되었습니다. 여기서, 우리는 아실 수지 보조 포획(Acyl-RAC)을 설명하며, 티올 반응성 세파로즈 비드에 의한 내인성 S-아사이클레이트 단백질의 선택적 포획에 기초한 최근 개발된 방법을 설명합니다. 기존 접근법에 비해 Acyl-RAC는 더 적은 단계가 필요하며 새로운 S-acylation 표적을 식별하기 위한 질량 분석과 결합될 때 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술에 있는 중요한 제한은 동일 thioester 결합을 통해 시스테인에 붙어 있는 지방산 종 사이 구별하는 기능의 부족입니다.
Introduction
S-아실화는 비질 티오에스터 결합1을통해 표적 단백질상에 지방 아실 사슬을 내부 시스테인 잔류물로 첨가하는 가역적 번역 후 변형이다. 그것은 먼저 팔미네이트와 단백질의 수정으로 보고 되었다, 포화 16 탄소 지방산2,따라서이 수정 은 종종 S-팔미토일화라고. 팔미네이트 이외에, 단백질은 다양한 길고 짧은 포화 (myristate 및 stearate), 단일 불포화 (oleate) 및 고도 불포화 (아라키도네이트 및 에이코사펜타노에이트) 지방산3,4,4,5,,6,,7에의해 가역적으로 변형 될 수 있다. 진핵 세포에서, S-아실화는 DHHC 단백질 아실트랜스퍼라제로 알려진 효소의 가족에 의해 촉매되고 시스테인 탈아실화의 역반응은 단백질 티에스테르아제에 의해 촉매화되며,8대부분은 여전히 수수께끼8로 남아 있다.
티오에스터 결합의 lability는 이 지질 변형을 가역적으로 만들어, 동적으로 단백질 군집화, 혈장 막 국소화, 세포내 인신 매매, 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 안정성9,,10. 결과적으로, S-아실레이션은 헌팅턴병, 알츠하이머병 및 여러 유형의 암(전립선, 위, 방광, 폐, 대장암)을 포함하는 여러 장애와 관련이 있으며, 이는 이러한 번역 후 단백질 변형을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 필요하다11.
방사성 물질([3H],[14C] 또는[125I])을 가진 대사 표지는 S-아실화 단백질 을 분석하기 위해 개발된 첫 번째 접근법 중하나였다(12,,13,,14. 그러나, 방사성 표지 기반 방법은 건강 문제를 제시하고, 매우 민감하지 않고, 시간이 오래 걸리며, 고도로 풍부한 단백질의 지질만검출한다 15. 방사성 표지에 대한 더 빠르고 비방사성 대안은 단백질 S-아실레이션16의역학을 분석하기 위해 일상적으로 사용되는 생체 부착 지방산 프로브로 대사 라벨링입니다. 이 방법에서, 화학 리포터(알킨 또는 아지드기)를 가진 지방산은 단백질 아실트랜스퍼라제에 의해 S-아실화 단백질내로 통합된다. 아지드-알키젠 후이스겐 사이클로첨가반응(click chemistry)은 불소 또는 비오틴과 같은 기능화된 군을 부착하여, S-아실화단백질(17,,18,,19)의검출을 허용하는 통합 지방산에 부착하는데 사용될 수 있다.
아실-비오틴 교환(ABE)은 조직시료에대한 부적합성과 같은 대사 라벨링의 단점 중 일부를 우회하는 S-아실화성 단백질의 포획 및 동정을 위해 광범위하게 사용되는 생화학적 방법 중 하나이다. 이 방법은 조직 및 냉동 세포 시료20,,21을포함하는 다양한 범위의 생물학적 샘플에서 S-아실레이션의 분석을 위해 적용될 수 있다. 이 방법은 중성 하이드록실라민에 의한 아실기와 시스테인 잔기 사이의 티오에스터 결합의 선택적 절단에 기초한다. 해방된 티올 그룹은 티올 반응성 비오틴 유도체로 포획됩니다. 생성된 생체면역단백질은 스트렙타비딘 아가로오스를 사용하여 친화도 정제되고 면역블로팅에 의해 분석된다.
아실-수지 보조 포획(Acyl-RAC)이라는 대안적인 접근법은 나중에 티올-반응성수지(22,,23)에의한 자유 시스테인의 직접적인 접합으로 생체측화 단계를 대체하기 위해 도입되었다. 이 방법은 ABE에 비해 단계가 적고 유사하게 광범위한 샘플1에서단백질 S-아실화를 검출하는데 사용될 수 있다.
아실-RAC는 4개의 주요 단계로 구성되어있습니다(그림 1),
1. 무료 티올 그룹의 차단;
2. 시스테인-아실 티에스터 결합과 중성 하이드록실라민(HAM)의 선택적 절단은 시스테인 티올 기를 노출시키는;
3. 티올 반응성 수지로 지방 시스테인을 포착;
4. 완충제를 줄이면서 용출 후 S-아사이클화 단백질의 선택적 농축.
포획된 단백질은 다양한 범위의 종 및,조직22,,24,25에서S-아실화 프로테오메를 평가하기 위해 면역블롯팅 또는 질량분광법(MS) 기반 프로테오믹스를 실시하여 분석될 수 있다. 개별 적인 S-아실화 부위는 또한 LC-MS/MS22에의한 생성된 펩티드의 포착된 단백질및 분석의 트립신 소화에 의해 확인될 수 있다. 여기에서, 우리는 아실-RAC가 세포주 및 조직 샘플 모두에서 다중 단백질의 S-acylation의 동시 검출을 위해 사용될 수 있는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용된 마우스는 NIH 지침에 따라 안락사되었다. 휴스턴에 있는 텍사스 건강 과학 센터의 동물 복지 위원회는 모든 동물 일을 승인했습니다.
1. 세포 리세이츠의 준비
- 표 1에설명된 대로 라시스 버퍼를 준비합니다. PBS 의 10 mL에, n-도데실 β-D-말토 사이드 세제 (DDM)의 0.1 g을 추가하고 용해하기 위해 회전. 100 μL의 인산염 억제제 칵테일 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) 및 프로테아제 억제제 칵테일 (1x)을 추가하고 사용하기 전에 얼음에 버퍼를 식힙니다.
- 인큐베이터에서 세포를 함유하는 필수 매체를 15 mL 또는 50 mL 원엽 튜브로 전달하고 350 x g에서 5 분 동안 스핀 셀을 5 분 동안 흡입하여 세포 파편을 제거합니다.
참고: 각 아실-RAC 반응에 대해 1 x 10x 10 7 셀을 사용했습니다. - 5 mL의 PBS에서 다시 중단하고 5 분 동안 350 x g에서 회전하여 펠릿을 씻으십시오.
참고 : PBS에서 확장 된 배양으로 인한 세포 포해를 피하기 위해 1.3 단계를 신속하게 수행하십시오. - 1.1단계에서 제조된 용해 완충액 600 μL을 펠릿에 넣고 4°C에서 30분 동안 열 셰이커에서 1500 rpm에서 흔들어 서 서 용해합니다.
- 4 °C에서 20,000 x g에서 30 분 동안 펠릿 세제 불용성 물질에 원심 분리하여 제거합니다. 미리 냉각 된 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브에서 제거 된 용해액을 수집하고 얼음에 보관하십시오.
- 브래드포드/BCA 분석기를 수행하여 단백질 농도를 추정합니다. 실험을 수행하기 전에 다른 샘플에서 동일한 양의 단백질을 확인하는 것이 중요합니다. 반응당 적어도 500 μg의 단백질을 사용하는 것이 좋습니다.
참고: 설명된 실험에서, 우리는 쥐 조직에서 배양된 (Jurkat) 세포 및 1 차적인 비장세포를 사용했습니다. 전술한 상기 의 해방법은 다른 세포 유형에도 채택될 수 있다. 전술한 세포 유형에 대해 수득된 평균 단백질 농도는 1 x 107 세포 당 약 500 μg이다. Jurkat 세포는 RPMI-1640 배지에서 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 1 mM 나트륨 피루베이트, 4,500 mg/L 글루코스, 및 1,500 mg/L 중탄산나트륨을 37°C에서 10% FBS와 5%CO2로보충하여 정제하였다. 우리는 반응 당 1 x 107 Jurkat 세포를 사용했습니다. 1차 비장세포는기재된 바와같이 마우스 비장 조직으로부터 분리되었다 26. 간단히, 비장 조직은 얼음에 macerated했다, 저혈압 용액적혈구의 용해 와 원심 분리에 의해 림프구에서 분리. 우리는 반응 당 1 x 107 1 차 적인 세포를 사용 했습니다.
2. 아실-RAC: 무료 티올 그룹 차단
참고: 모든 후속 단계는 실온(RT)에서 수행할 수 있습니다.
- 용해액을 신선한 1.5 mL 마이크로퍼지튜브로 옮기고 아래에 설명된 바와 같이 클로로포름 메탄올(CM) 침전을 수행한다.
- 메탄올(MeOH) 및 클로로포름(CHCl3)을리세이트의 최종 비율로 리액수에 첨가합니다: MeOH: CHCl3 의 2:2:1 및 균질한 현탁액을 만들기 위해 힘차게 흔들어주세요.
- 수성 및 유기 상 사이의 중간 상에서 펠릿 ("팬케이크")를 형성하기 위해 5 분 동안 10,000 x g에서 회전하십시오.
- 바늘 이나 젤 로딩 팁을 사용 하 여 가능한 한 많은 용매를 튜브를 기울입니다.
- 단백질 펠릿을 몇 분 동안 건조시키고 MeOH 600 μL을 추가하고 펠릿이 부서지지 않도록 부드럽게 혼합하여 부드럽게 씻어냅니다.
- 나머지 MeOH를 조심스럽게 제거하고 벤치탑에서 약 5분 동안 단백질 펠릿을 건조시면 됩니다.
- (선택 사항) 추가원심분리 단계를 수행하여 MeOH 세척 후 깨진 펠릿을 스핀다운하여 시료 손실을 방지합니다.
참고: 실험은 CM 강수 단계 후에 중지될 수 있다. 펠렛이 수득되면, 최대 1주일까지 -20°C에서 500 μL의 MeOH에 저장될 수 있다.- 펠릿이 용해될 때까지 열 셰이커에서 42°C/1500 rpm에서 와르싱하여 2SHB 완충제의 200 μL에서 단백질 펠릿을 용해시면 됩니다.
- (선택 사항) 초음파 처리 수조에서 추가로 5-10 분 동안 배양하여 펠릿을 용해시다.
참고 : 초음파 처리의 길이는 재료의 용해도에 따라 다릅니다. 그러나 장기간 초음파 처리는 단백질 저하를 일으킬 수 있습니다.
- 2SHB 완충액의 998 μL에 MMTS의 2 μL을 추가하여 2SHB에서 0.2% 메틸 메탄티오술포네이트(MMTS)(v/v)를 준비합니다.
참고: 각 실험에 대해 갓 준비한 0.2% MMTS를 사용하십시오. - 각 튜브에 2SHB에 0.2% MMTS의 200 μL을 추가하여 최종 농도0.1% MMTS를 추가합니다. 42°C에서 15분 동안 인큐베이션하고 열 셰이커에서 1500 rpm에서 흔들어 줍니다.
3. 아실-RAC: 하이드록실라민(HAM) 절단 및 S-아실화 단백질 포획
- MMTS를 제거하기 위해 위에서 설명한 바와 같이 3-4x CM 강수량을 반복합니다. MMTS의 제거는 MMTS의 뚜렷한 냄새의 부족에 의해 추정될 수 있습니다. 각 침전 후, 펠릿이 용해될 때까지 열 셰이커에서 42°C/1500 rpm에서 소용돌이치면서 2SHB 완충액의 100 μL에 펠렛을 용해시키고 300 μL의 완충액 A로 희석합니다.
- 최종 침전 후, 위에서 설명한 바와 같이 2SHB 완충액의 200 μL에서 샘플을 용해시키고 완충A의 240 μL로 희석한다.
- 여러 치료 조건에 반응하여 S-아실화의 변화를 비교하는 경우, 단백질 농도를 다시 측정하고 각 조건에 대해 동일한 양의 단백질을 진행합니다.
- 입력 제어로 각 샘플에서 40 μL을 유지합니다.
- 샘플을 200 μL의 두 개의 동등한 부분으로 분할하고 튜브를 "+ HAM" 및 "- HAM"으로 표시합니다. 50 μL의 갓 제조된 중성 2 M HAM(pH 7.0-7.5)을 튜브 중 하나에 400 mM의 최종 농도(+HAM) 및 50 μL의 중성 2 M NaCl을 제2 튜브(-HAM)에 첨가하여 음극 대조군으로 사용할 것이다. 티오프로필-세파로스(TS) 비드를 첨가한다.
참고: CM 강수 단계 중 임의의 실험이후에 실험을 중단할 수 있다. 펠렛이 수득되면, 최대 1주일까지 -20°C에서 500 μL의 MeOH에 저장될 수 있다. 2 M HAM의 중성 pH는 아실 시스테인 티오에스터 결합에 대한 선택성을 보장하고 신중하게 조정해야합니다. 과도한 발포로 인한 시료 손실을 방지하기 위해 2SHB 버퍼에서 시료를 취급할 때주의를 기울여야합니다. HAM 및 + HAM 샘플 - 다음 단계는 모두 동일합니다. - 각 튜브에 30 μL의 TS 비드 슬러리를 추가하고 RT에서 튜브를 1-2 시간 동안 회전시다.
- TS 비드를 버퍼 A에서 1% SDS로 4x 세척하여 잔류 HAM을 제거합니다.
- 1분 동안 마이크로 퍼지를 사용하여 모든 구슬 샘플을 부드럽게 스핀다운하고 상월체를 조심스럽게 흡인합니다.
- 버퍼 A에서 1% SDS의 500 μL에서 비드를 다시 일시 중단합니다.
- 3.7.1-3.7.2세를 반복합니다.
참고: 활성화된 티오프로필-세파로스(TS)는 커플링 전에 중성 pH로 세척해야 하는 첨가제의 존재 하에서 동결 건조로 공급됩니다. 붓기와 세척에는 증류수를 권장합니다. 0.1 g의 구슬을 계량하고 증류수 1 mL에서 다시 중단하고 RT에서 30 분-1 시간 동안 회전하면서 팽창 할 수 있습니다. 버퍼 A로 구슬 1 을 씻고 버퍼 A로 슬러리를 50 % 정착 된 중간에서 50 % 버퍼로 준비하십시오. 부어 오른 TS는 4°C에서 최대 1주일까지 20% 에탄올의 존재 속에서 중성 pH에 저장될 수 있다. 아지드 이온이 2-피리딜 이황화물 기와 반응하기 때문에 아지데 나트륨을 정균제로 사용하지 마십시오. 더 높은 효율성을 위해 신선한 구슬을 준비하십시오. 구슬을 취급하는 동안 P200 파이펫 팁의 끝을 약간 절단하여 손상을 방지할 수 있습니다.
참고: 실험은 CM 강수 후 모든 단계에서 중지할 수 있습니다. 펠릿은 최대 1주일까지 -20°C에서 MeOH의 500 μL에 보관될 수 있다.
4. 용출 및 S-아실화 단백질 검출
- 마지막 세척 후, 위에서 설명한 대로 구슬을 부드럽게 스핀 다운하고 구슬을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상급제를 흡인합니다.
- DTT를 사용하여 4x SDS 샘플 버퍼로 구슬에서 단백질을 회수합니다.
- 50 μL의 4x SDS 샘플 버퍼를 구슬에 넣고 열 셰이커에서 15분 동안 80°C, 1500rpm에서 배양합니다. 튜브를 식힙니다.
- 5,000 x g에서 3분 동안 구슬을 원심분리하여 구슬을 완전히 펠렛하고 용출된 단백질을 젤 로딩 팁을 사용하여 신선한 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
- SDS-PAGE를 실행하고 서쪽 블로팅에 의한 관심 단백질의 S-아실화를 분석합니다.
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Representative Results
전술한 프로토콜에 따라, 우리는 먼저 아실-RAC를 사용하여 주캇 세포에서 여러 단백질의 S-acylation을 동시에 검출하인, T 세포 백혈병 환자27의말초 혈액으로부터 유래된 불멸의 T 세포주를 검출하였다. 이전에 S-아실화9,,28,,29로 확인된 조절T 세포 단백질은 이 방법의 유용성을 입증하기 위해 선택되었다. 도 2A에도시된 바와 같이, 티로신 키나아제 Lck는 중성 2M 하이드록실라민으로 처리된 라이세트에서 검출되어 시스테인 잔기와 지방산 잔기 사이의 티에스터 결합을 갈라낼 수 있다(+HAM lane). 2M NaCl(-HAM 레인)으로 처리된 샘플은 티오에스테르 결합의 검출을 위한 분석법의 선택성을 나타내는 중요한 음성 대조군을 나타낸다. 입력 차선은 신호의 특이성을 더욱 확증하고 관심 있는 단백질이 S-아실레이트가 아닌 경우 양성 대조군역할을 할 수 있다. 그 후 멤브레인을 단백질 Fyn 및 LAT에 대한 항체로 벗겨내고 재프로브하여 아실-RAC 분석제가 동시에 다중 단백질의 S-아실화를 분석하는데 사용될 수 있음을 입증하였다(도2A).
조직 샘플에서 단백질 S-아실화를 검출하는 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 우리는 마우스 비장에 아실-RAC 프로토콜을 적용하였다. 도 2B에도시된 바와 같이, Lck, Fyn 및 LAT의 S-아실화는 이러한 변형이 두 종 사이에서 보존됨을 나타내는 1차 마우스 비장세포에서 용이하게 검출될 수 있다.
그림 1. 아실-RAC의 개략적 표현. 이 방법은 4개의 주요 단계로 구성되어 있습니다: (1) 메틸 메탄티오설포네이트(MMTS)를 가진 자유 티올 기를 차단하고, (2) 시스테인-아실 티에스터 결합을 중성 하이드록실라민(HAM)과 선택적 절단으로 차단하여 시스테인 티올 기를 노출시키는 단계, (3) 새로 노출된 시스테인 티올을 티올 반응성 수지와 직접 컨쥬게이션하고 (4) 감소용용용액 완충제를 사용하여 포획된 단백질의 회수, 면역블롯 또는 MS 분석을 통해 단백질을 포획한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. S-아사이클화 단백질 검출. 아실-RAC 분석기는 Jurkat T세포(A)및 뮤린 비장조직(B)에서T 세포 신호 단백질의 S-acylation을 검출하는 데 사용되었다. Lck-, Fyn- 및 LAT 특이적 항체를 가진 면역블롯질은 하이드록실라민 처리 샘플(+ HAM lane)에서 이들 단백질의 S-아실화를 나타낸다. 염화나트륨(-HAM 레인)으로 처리된 시료는 음성 대조군역할을 한다. 처리되지 않은 라세이트는 입력 레인에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 | 구성 | 노트 |
| 리시스 버퍼 (LB) | DPBS에서 1% DDM; 10 μM ML211; 인산염 억제제 칵테일 2 (1:100); 프로테아제 억제제 칵테일 (1X), PMSF (10 mM) | 사용하기 전에 4°C에서 신선하고 차갑게 준비하세요. |
| SDS 버퍼(2SHB) | 2% SDS; 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7.4 | |
| 버퍼 A | 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7.4 | |
| 하이드록실라민 (HAM) | 증류H20의 M 재고 용액 2개 | 신선하게 준비하세요. 처음 용해되면 HAM은 매우 낮은 pH를 가합니다. 7-7.5에 pH에 5 M NaOH를 사용합니다. |
| 4X SDS 샘플 버퍼 | 200 mM Tris-Cl (pH 6.8), 8 % SDS (황산 나트륨) 0.01 % 브로모페놀 블루, 10 % 글리세롤 | 사용 직전에 5 mM DTT로 보충하십시오. |
표 1: 프로토콜에 필요한 일반적으로 사용되는 버퍼의 버퍼 구성. 2SHB 버퍼 및 버퍼 A는 사전에 준비할 수 있지만 pH는 정기적으로 확인해야 합니다. 라시스 버퍼와 HAM은 실험당일에 준비되어야 한다.
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Discussion
여기서, 우리는 성공적으로 마우스 조직으로부터 유래된 배양된 인간 세포 및 1차 세포 모두에서 선택된 단백질의 S-아실화를 검출하기 위해 아실-RAC 검정을 활용하였다. 이 방법은 간단하고 민감하며 표준 생화학 기술을 사용하여 최소한의 장비 요구 사항으로 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 단백질 전탈 시스템(Sec61b), 리보좀 단백질 S11(Rps11), 및 미세소좀 글루타티온-S-트랜스페라제 3(MGST3)의Sβ-소단위와 같은 신규한22S-아실화 단백질을 성공적으로 식별하는 것으로 나타났다. 아실-RAC의 감도 및 적응성은 다양한 생물학적 샘플에서 단백질 S-아실화를 연구하는 데 적합합니다.
S-acylated 단백질의 상당한 분획은 또한 지질 뗏목으로 알려져 있는 혈장 막의 glycosphingoid 농축한 부분과 연관될 수 있습니다. 따라서 트리톤 X-100, NP-40 또는 Brij58과 같은 순도 세제가 용해30에사용되는 경우 일부 S-acylated 단백질이 완전히 추출되지 않을 수 있습니다. 음이온 성 세제 (예 : SDS) 또는 말토 사이드 기반비이온성 세제 (예 : n-dodecyl β-D-maltoside (DDM)))는 지질 뗏목의 해리및 관심단백질의 완전한 회복을 보장하기 위해 사용될 수있다30,,31,,32. 이 프로토콜에서는, 우리는 DDM, 막 단백질 추출에 효과적이고 장기간 에 그들의 안정한 네이티브 상태를 유지하는 것으로 입증된 온화한, 지질 같이 비 이온성세제를 사용했습니다 33.
시료의 용해 동안 관계가 없는 티오에스테라아제 활성은 TS 풀다운 단계 후 잠재적으로 단백질 수율 감소를 초래할 수 있으며, 따라서 S-아실화 단백질의 검출에 영향을 미칠 수 있다. ML211과 같은 티오에스테아제 억제제, 아실-단백질 티오에스트라아제1(APT1, LYPLA1) 및 아실-단백질 티오에스테라아제 2(APT2, LYPLA2)를 위한 이중 억제제는 용해염34,,35에서단백질의 무분별한 탈화를 방지하기 위해 첨가될 수 있다.
시스테인 잔기의 불완전한 봉쇄는 TS에 비 아사이클화 단백질의 결합을 일으킬 수 있습니다, 따라서 –HAM 샘플에서 높은 신호에 의해 분명 높은 배경의 결과. 백그라운드 결합은 저우 외36에의해 변형된 ABE 프로토콜에 기재된 바와 같이 티올 가교 제제-2,2'-디티오디피리딘을 가진 추가적인 인큐베이션에 의해 실질적으로 감소될 수 있다.
대사 라벨링과는 달리, 아실-RAC는 살아있는 세포에 한정되지 않으며, 신선하게 단리되거나 동결된 조직 샘플에서 단백질 S-아실화를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 아실-RAC 프로토콜은 면역 침전 단계를 피하기 때문에, 동일한 분석실험에서 관심 있는 여러 단백질의 지질을 동시에 검출하는데 사용될 수 있으며, 따라서 단일 실험에서 요구되는 생물학적 물질의 양을 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 그러나, 대사 표지계 측정은 특히 de novo S-acylation을 검출하거나 관심 있는 단백질에 지방산 회전율을 측정하는 것을 겨냥한 실험에 더 적합합니다. 아실-RAC의 또 다른 중요한 한계는 이 기술이 동일한 티오에스테르,결합3,,4,,5,,6,7을통해 시스테인 잔류물과 공유결합될 수 있는 상이한 지방산을 구별할 수 없다는 것이다.
아실-RAC 및 ABE 아세포 는 모두 시스테인 잔류물과 지방산 사이의 티에스터 결합의 선택적 분열에 기초하여 자유 티올 그룹을 밝혀내고 있다. 아실-RAC는 티올 반응성 수지에 의한 S-아실화 성 단백질의 직접 풀다운을 사용하기 때문에, 이 방법은 ABE에 비해 더 적은 단계를 필요로 합니다. 유사하지만, S-아실화의 프로테오메 전체 연구는 기술적 차이로 인해 이 두 가지 방법을 사용하여 검출된 단백질의 일부 변이를 보여준다. 예를 들어, 쥐 뇌 균질화에서, ABE 기반 분석은 241S-acylated 단백질을 확인한 반면 아실-RAC 기반 분석은 14425를확인했습니다. 쥐 뇌 프로테오메에서 61개의 단백질은 단백질의 S-아실화 상태를 확인하기 위해 다중 기술의 사용필요성을 강조하는 두 방법 모두에 의해 일반적으로 검출되었다.
아실-RAC 및 ABE 방법의 또 다른 잠재적인 단점은 S-아실화의 세포측을 안정적으로 평가하고 지질 시스테인의 수를 결정하는 무능력이다. 이러한 기술의 변형, 아실-PEG 교환 또는 PEG-시프트 분석이라고 하는, 이러한 한계를 해결하기 위해 개발되었다37,,38. 이 방법에서, 하이드록실라민 절단을 따르는 풀다운 단계는 PEG-말레미드 질량 태그로 인큐베이션에 의해 치환된다. 노출된 자유 시스테인 잔기의 생성된 PEGylation은 SDS-PAGE에 의한 질량 이동으로서 관찰될 수 있다.
결론적으로, 아실-RAC는 다양한 생물학적 시료에서 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 단백질 S-아실화의 역학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 빠르고 민감하며 신뢰할 수 있는 방법입니다. 위에서 논의한 방법의 한계를 고려하여, 관심 있는 단백질의 S-아실화를 완전히 특성화하기 위해 아실-RAC와 다른 기술의 조합이 권장된다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 보조금 5R01GM115446 및 1R01GM130840의 국가 학회에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
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