Summary
Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.
Abstract
Protein S-aylasyon, ayrıca S-palmitoylation olarak anılacaktır, bir labile tiyoester bağı ile uzun zincirli yağ asitleri ile sistein kalıntıları ters çevrilebilir bir post-çevirici modifikasyonudur. Yaygın bir düzenleyici mekanizma olarak ortaya çıkan S-aylasyonu, kompleks oluşumundan protein ticaretine ve protein stabilitesine kadar proteinlerin biyolojik aktivitesinin neredeyse tüm yönlerini modüle edebilir. Protein S-aylasyonunun biyolojik işlevini anlamada son zamanlarda kaydedilen ilerleme, büyük ölçüde çeşitli biyolojik örneklerde protein S-amilasyonunun sağlam ve hassas bir şekilde algılanmasına olanak sağlayan yeni biyokimyasal aletlerin geliştirilmesi sayesinde gerçekleşetmiştir. Burada, endojen S-acylated proteinlerin tiol-reaktif Sepharose boncuklar tarafından seçici olarak ele geçirilmesine dayanan, son zamanlarda geliştirilen bir yöntem olan acyl reçin destekli yakalamayı (Acyl-RAC) tanımlıyoruz. Mevcut yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, Acyl-RAC daha az adım gerektirir ve yeni S-acylation hedeflerinin belirlenmesi için kütle spektrometresi ile birleştiğinde daha güvenilir sonuçlar verebilir. Bu teknikteki önemli bir sınırlama, aynı tiyoester bağı ile sisteinlara bağlı yağ asidi türleri arasında ayrım yapma becerisinin olmamasıdır.
Introduction
S-acylation bir labile tiyoesterbağı1 ile bir hedef protein üzerinde bir iç sistein kalıntısı bir yağlı asil zincir eklenmesi içeren bir geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyondur. İlk olarak palmitat ile proteinlerin bir değişiklik olarak bildirilmiştir, doymuş 16-karbon yağ asidi2, ve bu nedenle bu değişiklik genellikle S-palmitoylation olarak adlandırılır. Palmitat ek olarak, proteinler geri daha uzun ve kısa doymuş çeşitli tarafından değiştirilebilir (myristate ve stearate), tekli doymamış (oleat) ve çoklu doymamış (arachidonate ve eikosapentanoat) yağ asitleri3,4,5,6,7. Ökaryotik hücrelerde, S-aylasyon DHHC protein ayltransferazlar olarak bilinen enzimler bir aile tarafından katalize edilir ve sistein deamilasyonu ters reaksiyon protein tiyoesterases tarafından katalize edilir, çoğu hala esrarengiz kalır8.
Tiyoester bağının lability bu lipid modifikasyonu geri dönüşümlü hale getirir, dinamik protein kümelenme düzenleyen izin, plazma membran lokalizasyonu, hücre içi ticareti, protein-protein etkileşimleri ve protein stabilitesi9,10. Sonuç olarak, S-acylation Huntington hastalığı, Alzheimer hastalığı ve kanser çeşitli türleri (prostat, mide, mesane, akciğer, kolorektal) dahil olmak üzere çeşitli bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, bu post-çeviriprotein modifikasyonu tespit etmek için güvenilir yöntemlergeliştirilmesini gerektirir11.
Radyoaktif metabolik etiketleme ([3H], [14C] veya [125I]) palmitat, protein S-aylasyonunu saymak için geliştirilen ilk yaklaşımlardan biridir12,13,14. Ancak, radyolabeling tabanlı yöntemler sağlık endişeleri mevcut, çok hassas değildir, zaman alıcı, ve sadece son derece bol proteinlerin lipidasyon tespit15. Radiolabeling için daha hızlı ve radyoaktif olmayan bir alternatif biyoortogonal yağ asidi probları ile metabolik etiketleme, hangi rutin protein S-acylation dinamikleri hesaplamak için kullanılır16. Bu yöntemde, bir kimyasal muhabir (alkine veya azit grubu) ile bir yağ asidi bir protein ayltransferaz tarafından S-asilat protein içine dahil edilmiştir. Azide-alkyne Huisgen sikloek reaksiyonu (tıklama kimyası) daha sonra bir florofor veya biyotin gibi işlevselleştirilmiş bir grup eklemek için kullanılabilir, Entegre yağ asidi S-acylated protein tespiti için izin17,18,19.
Acyl-biotin değişimi (ABE) doku örnekleri için uygun olmayan gibi metabolik etiketleme eksiklikleri bazı atlar S-acylated proteinlerin yakalanması ve belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal yöntemlerden biridir15. Bu yöntem, dokular ve dondurulmuş hücre örnekleri20,21dahil olmak üzere biyolojik örnekler, çeşitli s-acilesyon analizi için uygulanabilir. Bu yöntem, nötr hidroksilin ile asil grup ve sistein kalıntısı arasındaki tiyoester bağının selektif bölünmesine dayanır. Serbest tiyol grupları daha sonra bir tiol-reaktif biotin türevi ile yakalanır. Üretilen biyotinylated proteinler daha sonra afinite-streptavidin agarose kullanılarak saflaştırılmış ve immünoblotting tarafından analiz edilir.
Alternatif bir yaklaşım acyl-reçine destekli yakalama denir (Acyl-RAC) daha sonra bir tiyol-reaktif reçine22,,23tarafından serbest sistein doğrudan konjugasyon ile biyotinylation adım yerine tanıtıldı . Bu yöntem, ABE ile karşılaştırıldığında daha az adıma sahiptir ve benzer şekilde çok çeşitli örneklerde protein S-alasyonunun saptanması için kullanılabilir1.
Acyl-RAC 4 ana adımdan oluşur (Şekil 1),
1. Serbest tiyol gruplarının engellenmesi;
2. Nötr hidroksilin ile sistein-asil tiyoester bağıseçici bölünme (HAM) sistein tiyol grupları ortaya çıkarmak için;
3. Bir tiyol-reaktif resin ile lipideli sistein yakalama;
4. Tampon azaltarak elüsyondan sonra S-asitli proteinlerin seçici zenginleşmesi.
Yakalanan proteinler daha sonra immünoblotting veya kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik türler ve dokuların çeşitli sitifom değerlendirmek için tabi analiz edilebilir22,24,25. Bireysel S-aylasyon siteleri de yakalanan proteinlerin tripsin sindirim ve LC-MS/MS22ile ortaya çıkan peptidlerin analizi ile tespit edilebilir. Burada, hem hücre hattında hem de doku örneğinde birden fazla proteinin S-amilasyonunun eşzamanlı olarak saptanmasında nasıl asil-RAC kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan fareler NIH kurallarına göre ötenazi yedirildi. Houston Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Hayvan Refahı Komitesi tüm hayvan çalışmaları onayladı.
1. Hücre lisatlarının hazırlanması
- Tablo 1'deaçıklandığı gibi lysis arabelleği hazırlayın. 10 mL PBS'ye 0,1 g n-dodeyl β-D-maltoside deterjan (DDM) ekleyin ve çözülecek şekilde döndürün. 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyl 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) ve proteaz inhibitörü kokteyli (1x) ekleyin ve kullanmadan önce tamponu buz üzerinde soğutun.
- Herhangi bir hücre enkazından kurtulmak için 350 x g'de 350 x g'de kuvözden hücreleri içeren ortamların 15 mL veya 50 mL konik tüplere ve dönüş hücrelerine aktarılması gerekmektedir.
NOT: Yapılacak her asil-RAC reaksiyonu için 1 x 107 hücre kullandık. - Peleti 5 mL PBS'de yeniden sulayarak ve 5 dk boyunca 350 x g'da döndürerek yıkayın.
NOT: PBS'de uzun süreli kuluçka nedeniyle hücre lisi önlemek için adım 1.3'ü hızlı bir şekilde gerçekleştirin. - 1.1 adımda hazırlanan 600 μL likli lisis tamponu peletin üzerine ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca bir termal çalkalayıcıda 1500 rpm'de sallayarak lyse.
- 4 °C'de 20.000 x g'de 30 dk pelet deterjansız malzemeleriçin santrifüj ile temizler. Önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrofuge tüplerde temizlenmiş lysate toplayın ve buzüzerinde tutun.
- Protein konsantrasyonu tahmin etmek için Bradford/BCA tayini yapın. Deneyi gerçekleştirmeden önce farklı numuneler arasında aynı miktarda proteinin sağlanması çok önemlidir. Reaksiyon başına en az 500 μg protein kullanmanızı öneririz.
NOT: Açıklanan deneylerde fare dokusundan kültürlü (Jurkat) hücreleri ve primer splenositler kullandık. Yukarıda açıklanan lysis yöntemi diğer hücre tiplerine de benimsenebilir. Yukarıda bahsedilen hücre tipleri için elde edilen ortalama protein konsantrasyonu 1 x 107 hücre başına yaklaşık 500 μg'dir. Jurkat hücreleri RPMI-1640 orta 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum pirüuvat, 4.500 mg/L glukoz ve 1.500 mg/L sodyum bikarbonat içeren modifiye edilmiş ve %5 CO2ile 37 °C'de %10 FBS ile desteklenmiştir. Reaksiyon başına 1 x 107 Jurkat hücreleri kullandık. Primer splenositler fare dalak dokusundan izole edildi26. Kısaca, dalak dokusu buz üzerinde maceralı, hipotonik çözelti de eritrositlerin lysis ve santrifüj ile lenfositler ayrılması izledi. Reaksiyon başına 1 x 107 primer hücre kullandık.
2. Acyl-RAC: Serbest tiyol gruplarının engellenmesi
NOT: Sonraki tüm adımlar oda sıcaklığında (RT) yapılabilir.
- Taze 1,5 mL mikrofuge tüpe lysate aktarın ve aşağıda açıklandığı gibi kloroform-metanol (CM) yağış gerçekleştirin.
- Lysate'nin son oranında lysate'ye metanol (MeOH) ve kloroform (CHCl3)ekleyin: MeOH: CHCl3 2:2:1 ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için şiddetle çalkalayın.
- Sulu ve organik fazlar arasındaki interfazda bir pelet ("gözleme") oluşturmak için 5 dk için 10.000 x g spin.
- Bir iğne veya jel yükleme ucu kullanarak tüpü yatırın ve mümkün olduğunca çok çözücü aspire edin.
- Protein peletini birkaç dakika havayla kurutun ve 600 μL MeOH ekleyerek ve peletin kırılmasını önlemek için hafifçe karıştırarak hafifçe yıkayın.
- Dikkatle kalan MeOH çıkarın ve yaklaşık 5 dakika boyunca bir tezgah üzerinde protein pelet kuru.
- (İsteğe bağlı) Örnek kaybını önlemek için MeOH yıkamadan sonra herhangi bir kırık pelet aşağı spin için ek bir santrifüj adım gerçekleştirin.
NOT: Cm yağış adımından sonra deney durdurulabilir. Pelet elde edildikten sonra -20 °C'de 500 μL MeOH'da bir haftaya kadar saklanabilir.- 2SHB tamponunun 200 μL'si halinde protein peletini bir termal çalkalayıcıda 42 °C/1500 rpm'de girdaplayarak pelet eriyene kadar çözün.
- (İsteğe bağlı) Pelet eritmek için bir sonicating su banyosu ek bir 5-10 dakika kuluçka.
NOT: Sonication uzunluğu malzemenin çözünürlüğüne bağlı olarak değişir. Ancak, uzun süreli sonication protein bozulmasına neden olabilir.
- 2SHB'de %0,2 metil metil metanosiosulfonat (MMTS) (v/v) 2SHB'ye 298 μL 2SHB tamponuna 2 μL MMTS ekleyerek hazırlayın.
NOT: Her deney için taze hazırlanmış %0,2 MMTS kullanın. - Her tüpe 2SHB'de %0,2 MMTS'lik 200 μL'lik MMTS'yi %0,1 MMTS'lik son konsantrasyona ekleyin. 42 °C'de 15 dakika boyunca tüplü çalkalayıcıda 1500 rpm'de titreyerek inkübedin.
3. Asil-RAC: Hidroksilin (HAM) dekoltesi ve S-asilated proteinlerin yakalanması
- MMTS kaldırmak için yukarıda açıklandığı gibi 3-4x CM yağışları tekrarlayın. MMTS'nin çıkarılması, MMTS'nin belirgin kokusu ndan tahmin edilebilir. Her yağıştan sonra, pelet içözünceye kadar bir termal çalkalayıcıda 42 °C/1500 rpm girdap ile 2SHB tampon 100 μL pelet eritin ve sonra 300 μL Tampon A ile seyreltin.
- Son çökeltiden sonra, yukarıda açıklandığı gibi 2SHB tamponunun 200 μL'sinde numuneleri çözün ve 240 μL Tampon A ile seyreltin.
- Çeşitli tedavi koşullarına yanıt olarak S-aylasyondeğişiklikleri karşılaştırma durumunda, tekrar protein konsantrasyonu ölçmek ve her durum için protein eşit miktarda devam.
- Giriş kontrolü olarak her örnekten 40 μL tutun.
- Örnekleri 200 μL'lik iki eşit parçaya bölün ve tüpleri "+ HAM" ve "- HAM" olarak işaretleyin. Negatif kontrol olarak kullanılacak tüplerden birine (+ HAM) 400 mM ve ikinci tüpe (- HAM) 50°L nötr 2 M HAM (pH 7.0-7.5) ilave edin. Tiyopropil-Sepharose (TS) boncuk ilavesine devam edin.
NOT: Cm yağış adımlarından herhangi biri sonra deney durdurulabilir. Pelet elde edildikten sonra -20 °C'de 500 μL MeOH'da bir haftaya kadar saklanabilir. 2 M HAM'lık nötr pH, asil-sistein tiyoester bağı için seçiciliğini sağlar ve dikkatlice ayarlanmalıdır. Aşırı köpük nedeniyle numune kaybını önlemek için 2SHB tampon numuneleri kullanılırken dikkatli olunmalıdır. Aşağıdaki tüm adımlar - HAM ve + HAM örnekleri için aynıdır. - Her tüpe 30 μL TS boncuk-bulamaç ekleyin ve tüpleri RT'de 1-2 saat döndürün.
- Artık HAM'ı temizlemek için TS boncukları Tampon A'da %1 SDS ile 4 kat yıkayın.
- Yavaşça 1 dakika için bir mikrofuge kullanarak tüm boncuk örnekleri aşağı spin ve dikkatle supernatant aspire.
- Tampon A'da boncukları %1 SDS'nin 500 μL'inde yeniden askıya alın.
- Adımı 3.7.1-3.7.2'yi üç kez tekrarlayın.
NOT: Aktif tiyopropil-Sepharoz (TS), kaplinden önce nötr pH'da yıkanması gereken katkı maddeleri varlığında dondurularak kurutulur. Distile su şişme ve yıkama için tavsiye edilir. Tartılan boncuk 0.1 g ve distile su 1 mL resuspend ve RT 30 dakika-1 saat dönerken şişmesine izin verin. Şişmiş TS nötr pH'da 4 °C'de %20 etanol varlığında bir haftaya kadar saklanabilir. Azit iyonları 2-piril disülfit grupları ile reaksiyona girer beri bir bakteriyostatik ajan olarak sodyum azit kullanmayın. Daha yüksek verimlilik için taze boncuklar hazırlayın. Boncukları kullanırken, P200 pipet ucunun ucu herhangi bir hasarı önlemek için hafifçe kesilebilir.
NOT: Deney CM yağışından sonra herhangi bir aşamada durdurulabilir. Pelet 500 μL MeOH'da -20 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
4. S-asilated proteinlerin elüsyonu ve tespiti
- Son yıkamadan sonra, yukarıda açıklandığı gibi boncukları hafifçe aşağı doğru çevirin ve boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok süpernatant aspire edin.
- DTT ile 4x SDS örnek tampon ile boncuklardan proteinleri kurtarın.
- Boncuklara 50 μL 4x SDS örnek tampon ekleyin ve 80 °C'de 1500 rpm'de bir termal çalkalayıcıda 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpler soğumaya bırakın.
- Boncukları 3 dk için 5.000 x g'de santrifüj edin ve eluted proteinleri jel yükleme ucu kullanarak taze 1,5 mL tüpe aktarın.
- SDS-PAGE çalıştırın ve batı blotting tarafından ilgi protein(ler) S-acylation analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü takiben, ilk olarak jurkat hücrelerinde çeşitli proteinlerin S-aylayasyon tespit etmek için ilk acyl-RAC kullanılan, bir ölümsüzleştirilmiş T hücre hattı aslında bir T hücreli lösemi hastasının periferik kan türetilmiştir27. Düzenleyici T hücre proteinleri daha önce S-acylatedolaraktanımlanan 9,28,29 bu yöntemin yarar göstermek için seçildi. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, sistein kalıntıları ile yağ asidi moiety (+ HAM şeritli) arasındaki tiyoester bağını cleave nötr 2 M hidroksilin ile tedavi lizatlarda tirozin kinaz Lck saptanabilir. 2 M NaCl (-HAM şeritli) ile işlem gören numune, tiyoester bağlarının tespiti için tahkikatın seçiciliğini gösteren önemli bir negatif kontrolü temsil eder. Giriş şeridi sinyalin özgüllüğünü daha da doğrular ve ilgi proteini S-acylated değilse pozitif kontrol olarak hizmet verebilir. Membran daha sonra soyulmuş ve aynı anda birden fazla proteinin S-amilasyon analiz etmek için kullanılabilir acyl-RAC tsay göstermek için proteinler Emil ve LAT karşı antikorlar ile reprobed(Şekil 2A).
Doku örneklerinde protein S-aylasyonunu saptamak için bu yöntemin faydasını göstermek için fare dalağını asil-RAC protokolü uyguladık. Şekil 2B'degösterildiği gibi, Lck, Fyn ve LAT'nin S-aylaasyonu birincil fare splenositlerinde bu modifikasyonun iki tür arasında korunduğunu gösteren kolayca saptanabilir.
Şekil 1. acyl-RAC şematik temsili. Yöntem 4 ana adımdan oluşmaktadır: (1) metil metanthiosulfonat (MMTS) ile serbest tiyol gruplarının bloke sistein-acyl tiyoester bağının nötr hidroksilin (HAM) ile selektif bölünmesi, (3) bir tiyol-reaktif reçine ile doğrudan konjugasyon ile yeni maruz sistein tiyol ile proteinlerin yakalanması ve (4) yakalanan proteinlerin bir azaltıcı elüsyon tampon kullanarak kurtarma, immünoblot veya MS analizi takip. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. S-acylated proteinlerin tespiti. Jurkat T hücrelerinde (A) ve murine dalak dokusunda(B)T hücre sinyalproteinlerinin S-aylayasyonunu saptamak için bir asil-RAC testi kullanılmıştır. Lck-, Fyn ve LAT spesifik antikorlarla immünoblot, hidroksilin tedavi edilen numunede (+ HAM şeritli) bu proteinlerin S-aylakyasyonuna neden olur. Sodyum klorür (-HAM şeritli) ile tedavi edilen bir numune negatif kontrol görevi görüyor. İşlenmemiş lysates giriş şeridinde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Arabellek | Kompozisyon | Notlar |
| Lysis Tampon (LB) | DPBS'de %1 DDM; 10 μM ML211; Fosfataz Inhibitörü Kokteyl 2 (1:100); Proteaz Inhibitörü Kokteyli (1X), PMSF (10 mM) | Kullanmadan önce taze hazırlayın, 4 °C'de soğutun. |
| SDS Arabellek (2SHB) | %2 SDS; 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7.4 | |
| Arabellek A | 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7.4 | |
| Hidroksilin (HAM) | DistileH2 0 2 M stok çözeltisi | Taze hazırlanın. İlk çözündüğünde HAM'ın pH oranı çok düşüktür. PH'dan 7-7.5'e 5 M NaOH kullanın. |
| 4X SDS örnek arabellek | 200 mM Tris-Cl (pH 6.8), %8 SDS (sodyum dodecyl sülfat) %0.01 Bromofenol mavisi, %10 gliserol | Kullanmadan hemen önce 5 mM DTT ile tamamlayınız. |
Tablo 1: Protokolde sık kullanılan arabelleklerin arabellek bileşimi. 2SHB arabellek ve Tampon A önceden hazırlanabilir ancak pH'ları düzenli olarak kontrol edilmelidir. Lysis tampon ve HAM deney günü hazırlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, hem kültürlü insan hücrelerinde hem de fare dokusundan elde edilen birincil hücrelerde seçilen proteinlerin S-aylayasyonunu tespit etmek için asil-RAC analizini başarıyla kullandık. Bu yöntem basit, duyarlı ve standart biyokimya teknikleri kullanılarak minimum ekipman gereksinimleri ile kolayca yapılabilir. Bu yöntem, protein translokasyon sisteminin β-subunit (Sec61b), ribozomal protein S11 (Rps11) ve mikrozomal glutatyon-S-transferaz 3 (MGST3)22gibi yeni S-acylated proteinleri başarıyla tanımlamak için gösterilmiştir. Asil-RAC'nin duyarlılığı ve adaptasyonu çeşitli biyolojik numunelerde protein S-alasyonunun incelenmesini uygun kılmıştır.
S-acylated proteinlerin önemli bir kısmı plazma zarının glikozphingolipid zenginleştirilmiş parçaları ile ilişkili olabilir, ayrıca lipid sallar olarak bilinen. Triton X-100, NP-40 veya Brij58 gibi hafif deterjanlar30lysis için kullanıldığında bazı S-acylated proteinler tam olarak elde edilemeyebilir. Anyonik deterjanlar (SDS gibi) veya maltoside bazlı iyonik olmayan deterjanlar (n-dodecyl β-D-maltoside (DDM gibi)) lipid sallarının dissosiyatasyonunu ve ilgi proteinlerinin tam olarak iyileşmesini sağlamak için kullanılabilir30,31,32. Bu protokolde, membran protein ekstraksiyonunda ve uzun süre ler boyunca stabil yerli hallerini koruduğu kanıtlanan hafif, lipid benzeri iyonik olmayan bir deterjan olan DDM'yi kullandık33.
Numunenin lysis sırasında düzensiz tiyoesterase aktivitesi potansiyel olarak TS çekme adımından sonra protein veriminin düşmesine neden olabilir ve böylece S-asitli proteinlerin saptanması etkileyebilir. Ml211, Acyl-Protein Thioesterase 1 (APT1, LYPLA1) ve Acyl-Protein Thioesterase 2 (APT2, LYPLA2) için bir çift inhibitör gibi bir tiyoesterase inhibitörü, lysate proteinlerin gelişigüzel deasilasyonu önlemek için eklenebilir34,35.
Sistein kalıntılarının tamamlanmamış bir şekilde ablukaya almaması, asilate olmayan proteinlerin TS'ye bağlanmasına neden olarak HAM örneklerinde yüksek sinyal le belirgin bir arka plan la sonuçlanabilir. Arka plan bağlama önemli ölçüde zhou ve ark.36tarafından değiştirilmiş bir ABE protokolü nde açıklandığı gibi bir tiyol-crosslinking ajan-2,2'-dithiodipyridine ile ek bir kuluçka ile azaltılabilir .
Metabolik etiketlemenin aksine, asil-RAC canlı hücrelerle sınırlı değildir ve taze izole edilmiş veya dondurulmuş doku örneklerinde protein S-aylasyonunu saptamak için yapılabilir. Asil-RAC protokolü immünoprepitasyon adımını önleyebildiği için, aynı anda aynı testte birden fazla ilgi proteininin lipidasyonunu tespit etmek için kullanılabilir, böylece tek bir deneyde gerekli biyolojik malzeme miktarını potansiyel olarak azaltır. Ancak, metabolik etiketleme tabanlı tahliller özellikle de novo S-aylation tespit etmek veya ilgi bir protein yağ asidi ciro oranlarını ölçmek amaçlı deneyler için daha uygundur. Acyl-RAC bir diğer önemli sınırlama bu teknik kovalent aynı tiyoesterbağı3,4,5,,6,7ile sistein kalıntıları bağlı olabilir farklı yağ asitleri ayırt edemiyor olmasıdır.
Hem asil-RAC ve ABE tahlilleri sistein kalıntısı ve serbest bir tiyol grubu ortaya çıkarmak için bir yağ asidi arasındaki tiyoester bağı seçici dekolte dayanmaktadır. Asil-RAC, s-asilated proteinlerin doğrudan çekilmesini tiyol-reaktif reçine ile kullandığından, bu yöntem ABE'ye göre daha az adım gerektirir. Benzer olmasına rağmen, S-aylasyon proteome geniş çalışmalar bu iki yöntem kullanılarak tespit proteinlerde bazı varyasyon lar göstermektedir, büyük olasılıkla teknik farklılıklar nedeniyle. Örneğin, sıçan beyin homojenate, ABE tabanlı analiz tespit 241 S-asilated proteinler, asil-RAC tabanlı analiz tespit 14425. Sıçan beyin proteomundaki 61 protein, bir proteinin S-alasyon durumunu saptamak için birden fazla tekniğin kullanılması gereğinin altını çizen her iki yöntemle de yaygın olarak saptanmıştır.
Acyl-RAC ve ABE yöntemlerinin bir diğer potansiyel dezavantajı da S-aylasyonun stokiyometrisini güvenilir bir şekilde değerlendirememeve lipideli sistein sayısını belirleyememedir. Bu tekniklerin bir değişiklik, acyl-PEG değişimi veya PEG-shift tsay olarak adlandırılır, bu sınırlamaları gidermek için geliştirilmiştir37,38. Bu yöntemde hidroksilin dekoltesini takip eden çekme adımı peg-maleimid kitle etiketi ile inkübasyon ile ikame edilir. Açığa çıkan serbest sistein kalıntılarının PEGiletion SDS-PAGE tarafından kitle kayması olarak görülebilir.
Sonuç olarak, asil-RAC biyolojik örneklerin büyük bir çeşitlilik hem fizyolojik hem de patofizyolojik koşullar altında protein S-aylasyon dinamikleri içine değerli anlayışlar sağlayabilir hızlı, duyarlı ve güvenilir bir yöntemdir. Yukarıda tartışılan yöntemin sınırlamaları göz önüne alındığında, diğer tekniklerle acyl-RAC kombinasyonu tamamen ilgi bir protein S-acylation karakterize etmek için tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması bildirilmemiş.
Acknowledgments
Bu çalışma 5R01GM115446 ve 1R01GM130840 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
References
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
- Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
- DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
- Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
- Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
- Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
- Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
- Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
- Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
- Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).
- O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
- Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
- Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
- Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
- Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
- Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
- Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
- Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
- Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
- Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
- Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
- Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
- Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
- Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
- Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
- Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
- Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
- Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
- Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
- Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).
