Summary
이 프로토콜은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 표적 유전자의 mRNA 발현 수준 및 공간 패턴을 검출하는 situ 혼성화 접근법에 효과적인 설명한다.
Abstract
기업에서 혼성화(ISH)는 조직에서 특정 유전자(예를 들어, mRNA 및 ncRNA)의 세포 분포 패턴을 제시하는 매우 유익한 기술이다. 시펀큘리드 웜 시분큘러스 누두스는 영양및 약용 가치가 높기 때문에 중요한 어업 자원입니다. 현재, Sipunculus nudus의 분자 생물학에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 이 문서의 목적은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 특정 mRNA를 국소화하기 위한 민감한 방법을 개발하는 것이다. 이 프로토콜에는 디곡시제닌 표지된 안티센스 및 센스 리보프로브 제제, coelomic 유체 수집 및 섹션 준비, 특정 리보프로퍼 혼성화, 항체 배양, 착색 및 착색 후 처리를 포함한 ISH의 상세한 단계가 포함됩니다. 이 방법을 사용하여 성공적인 실험에서 얻은 대표적인 결과가 입증됩니다. 프로토콜뿐만 아니라 다른 시분큘라 종에 적용 할 수 있어야합니다.
Introduction
ISH는, 표지된 핵산 프로브를 이용하여 관심 있는 특정 DNA 또는 RNA 서열을 검출하고, 형태학적으로 보존된 조직1,,2,,3에서표적 유전자의 공간 발현 패턴을 설명하는 유용한 방법이다. 일반적으로, 표적 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성되고, 디곡시겐린 뇨딘-5'-삼인산염으로 표지된 안티센스/센스 RNA 프로브를 합성하기 위한 템플릿으로 사용된다. 샘플은 리보프로브로 배양하기 전에 고정되고 투과됩니다. 과잉 프로브를 세척 한 후, 혼성화는 알칼리 성 인산염 - 공액3,,4,,5,,6인항 디그산소인 항체를 사용하여 면역 조직 화학에 의해 시각화됩니다.
시분큘러스 누두스(Phylum Sipuncula; 주문 시분쿨리다: 시분큘리대)는 세분화되지 않은, coelomate 및 양측 대칭해양 벌레7,,8. 시분큘러스 누두스는 열대와 온대 연안 해역에 널리 분포하는 국제적인 종입니다. 또한 영양및 약효가 높은 중국 남부의 중요한 해양 어업 자원인9,,10. 그러나, 분자 생물학에 있는 Sipunculus nudus는 아직 초기 단계에 있습니다. 유전자의 생물학적 역할을 완전히 이해하기 위해 세포 해상도에서 유전자 발현 패턴을 조사하는 것이 매우 흥미로합니다. 비모델 유기체인 시분큘러스 누드두스에서는유전자 발현 패턴을 검출하는 이상적인 방법인 ISH 방법이 아직 확립되지 않았다. 그것의 coelomic 액체는 과립구, 항아리 세포, 심포지부 세포, 세균 세포, 적혈구 등11를포함하여 몇몇 세포 모형을 포함합니다. 이중 성/mab-3 관련 전사 인자-1(dmrt1)은 이 방법에서 대표적인 유전자로서 사용되며, 무척추동물에서 포유류에 이르는 대부분의 종에서 성 결정 및 분화의 고도로 보존된 전사 조절기이다dmrt112,,13. 다양한 종(예: 검은 돼지 등) 도 14, dmrt1은 세르톨리 세포에서 발현되었고, 그의 기능은 시분큘러스 누두스의트로포블라스트 세포와 유사하게 발아세포를 둘러싸고 있다. 따라서, 우리는 Sipunculus nudus의 dmrt1이 정자의 trophoblast 세포에서 발현된다는 가설을 세우고, ISH 방법의 결과는 명확하게 가설을 확인하였다.
이 프로토콜은 처음으로 DIgoxigenin 표지된 안티센스/센스 mRNA 프로브를 사용하여 COELOMIC 유체 얼룩에서 mRNA 발현 패턴을 결정하는 ISH를 설명합니다. 최적의 반응 조건이 제공되어 고해상도에서 mRNA 발현의 매우 민감한 시각화가 가능합니다. 개발된 ISH 방법은 잠재적으로 시분큘러스 누두스 이외의 더 많은 시분쿨리다 종에 적용될 수 있다.
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Protocol
동물 절차는 화차오 대학의 동물 관리 및 복지위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 리보프로브 준비
- 프라이머 디자인
- 프로그램 프라이머 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)를 엽니 다. dmrt1 시퀀스(GenBank: MK182259)를 시퀀스 창에 복사합니다.
- 설정 프라이머 길이 (23-25 bp), 용융 온도 (55-60 ° C), 및 G / C 함량 (40-60%). 프라이머 선택을클릭합니다.
참고: RNA 프로브에 필요한 최소 크기는 약 500 bp입니다. - T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열(5, -TAATACGCACTATAGGG-3) 을 선택된 프라이머 중 하나에 첨가한다., ISH에 대한 dmrt1 프라이머 서열은 표 1에나타내고 있습니다.
참고: 센스 프로브의 경우, T7 RNA 폴리머라제 프로모터는 5' 전달 프라이머의 끝에 위치합니다. 안티센스 프로브의 경우, T7 RNA 폴리머라제 프로모터는 역프라이머의 5'-끝에 위치한다.
- PCR 증폭
- 얼음 위에 마이크로퍼지 튜브를 놓고 다음과 같은 반응 혼합물(50 μL 반응)을 준비합니다: 1x Taq DNA 폴리머라제 혼합물, cDNA 1 μg(100 μL의 coelomic fluid에서 제조됨), 1 μM 포워드 프라이머, 1 μM 역프라이머 및 뉴클레아제 없는 물.
- 파이펫팅과 원심분리기를 짧게 섞어 보라고 한다.
- 반응 튜브를 열 사이클러에 놓고, 다음 조건을 사용하여 PCR을 실행합니다: 2분 동안 95°C에서 초기 변성, 30초 동안 95°C에서 36사이클변성, 30초 동안 55-60°C에서 어닐링, 70초에 72°C에서 연장, 72°C에서 최종 연장.
참고: 어닐링 온도는 프라이머에 따라 최적화되어야 합니다.
- PCR 제품 정제 및 검증
- 50 μL의 PCR 혼합물을 1% 아가로즈 젤에 직접 적재합니다. 아가로즈 젤을 150-180V에서 0.5x TBE로 10분 동안 실행합니다. 1% 아가로즈 겔로부터 특정 DNA 단편을 분리한다.
참고 : DNA는 얼룩이 아닌 단일 밴드로 나타나야합니다. - 제조업체의 프로토콜에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 DNA 단편을 정화합니다. 260 nm의 파장에서 분광광도법에 의해 정제 된 제품을 정량화합니다.
- 시퀀싱을 통해 PCR 제품의 신뢰성을 확인합니다.
참고: (일시 정지 지점) 정제된 PCR 제품은 -20°C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있다.
- 50 μL의 PCR 혼합물을 1% 아가로즈 젤에 직접 적재합니다. 아가로즈 젤을 150-180V에서 0.5x TBE로 10분 동안 실행합니다. 1% 아가로즈 겔로부터 특정 DNA 단편을 분리한다.
- 리보프로브 합성
- RNase-free 마이크로퍼지 튜브를 얼음 위에 놓고, 마이크로 퍼지 튜브 (10 μL 반응)에 다음을 추가하십시오 : 1x Digoxygenin RNA 라벨링 믹스, 1 x 전사 완충제, RNase 억제제 0.5 μL, T7 RNA 폴리머라제 1 μL, PCR 제품 및 RNase 자유 물 1 μg. 파이펫팅과 원심분리기를 짧게 섞어 보라고 한다. 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- RNase 프리 DNase I. 파이펫팅과 원심 분리기를 짧게 섞어 2 μL을 추가합니다. 37 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 2 μL 0.2 M EDTA (pH 8.0)를 추가합니다. 파이펫팅과 원심분리기를 짧게 섞어 보라고 한다.
- 위의 반응에 4 M LiCl 의 2.5 μL 및 75 μL의 프리칠 된 에탄올을 추가하십시오. 잘 섞으세요. -70 °C에서 30 분 동안 둡니다.
- 12,000 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기. 에탄올을 데탄제. 미리 냉각된 70% 에탄올(v/v)의 1 mL를 넣고 부드럽게 혼합하여 강수량을 씻어냅니다.
- 4 °C에서 5 분 동안 12,000 x g의 원심 분리기. 70% 에탄올을 데칸트하고 강수량을 알콜 램프 근처에서 잠시 건조시다. 30 μL의 RNase-free 물을 추가하여 강수량을 녹이고 부드럽게 섞습니다.
- 1% 아가로즈 겔에 합성RNA 2 μL을 로드합니다. 0.5x TBE에서 5-10 분 동안 180V에서 아가로즈 젤을 실행하십시오. 260 nm의 파장에서 분광광도계를 사용하여 표지 된 RNA의 농도를 측정합니다.
- RNase가 없는 마이크로 퍼지 튜브와 필터 팁을 사용하여 RNase 오염을 방지하십시오.
참고: (일시 정지 지점) 디그산소인 표지 프로브는 -70°C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있다.
- RNase가 없는 마이크로 퍼지 튜브와 필터 팁을 사용하여 RNase 오염을 방지하십시오.
2. Coelomic 유체 수집
- S. nudus를 핀으로 해부 테이블에 고정합니다. 작은 오토클레이브 가위로 S. nudus의 몸을 엽니다. 피펫으로 coelomic 유체를 분리하십시오.
- 파이펫으로 1 mL coelomic 유체를 수집하고 폴리 D-리신 처리 현미경 슬라이드로 옮김을 옮김. 피펫 팁으로 coelomic 유체를 고르게 바하십시오. 37 °C에서 1 시간 동안 슬라이드를 공기 건조.
3. 시투 혼성화
- 1일차
- 1x 디에틸 파이로카보네이트 처리 된 인산완식염 (DEPC-PBS)의 100 mL를 포함하는 슬라이드 염색 항아리에서 슬라이드를 재수화. 1x DEPC-PBS로 3회 재수화하고, 부드러운 교반으로 세척당 5분간 재수화합니다.
- 실온에서 10 μg/mL 의 단백질분해제 K로 소화하여 coelomic 유체의 얼룩을 투과시켜 5분 동안 배양합니다. 5 분 3 시간 동안 부드러운 교반으로 1 x DEPC-PBS로 슬라이드를 씻으십시오.
- 슬라이드에 센스/안티센스 리보프로브가 들어있는 50 μL의 혼성화 믹스(HM)를 추가하고 커버 슬립을 추가합니다.
- 젖은 상자 버퍼를 젖은 상자에 넣습니다. 젖은 상자에 슬라이드를 넣고 파라핀 필름으로 잘 밀봉합니다. 60°C에서 하룻밤(적어도 16시간) 혼성화한다.
- 2일차
- 세척 버퍼를 65°C에서 예열합니다. 세척 버퍼가 들어있는 슬라이드 염색 용기에 슬라이드를 담그고 커버슬립이 자동으로 미끄러질 때까지 방치하십시오. 소요 시간 약 5분
- 65 °C에서 세척 버퍼로 2 회, 부드러운 교반으로 세척 당 30 분. 65°C에서 0.2배 식염수 나트륨(SSC)으로 2회, 부드러운 교반으로 세척당 30분간 세척하십시오. 실온에서 Tween 20 (MABT)을 함유 한 남성산 완충제로 2 회, 부드러운 교반으로 씻을 때 30 분.
- 블로킹 버퍼에서 3-4 시간 동안 실온에서 슬라이드를 배양합니다. 1 mL 안티 디고시겐-AP 파브 단편 용액에서 슬라이드를 1/5000에서 희석하고 블로킹 버퍼를 밤새 4°C에서 배양합니다.
- 3일차
- 항체 용액을 제거하고 MABT에서 슬라이드를 간략하게 세척합니다. MABT로 실온에서 4회, 부드러운 교반으로 세척당 25분 동안 씻으시기.
- 실온에서 알칼리 성 인산염 완충제로 슬라이드를 3 회, 세척 당 5 분 배양하십시오. 알칼리성 인산염 완충액을 제거하고 5-브로모-4-클로로-3-인도릴 인산염(BCIP)/니트로 블루 테트라졸륨(NBT) 염색 용액 1mL을 첨가합니다. 슬라이드를 어둠 속에서 유지합니다.
- 광학 현미경으로 주기적으로 색상 반응을 관찰하십시오. 색상이 완전히 개발되면 (1-4 h 범위의 반응 시간) 슬라이드를 실온에서 MABT로 2 회, 부드러운 교반으로 씻을 때마다 5 분.
- 실온에서 스톱 용액으로 2 회, 부드러운 교반으로 씻을 때 15 분. 메탄올에 슬라이드를 배양하여 30 분 동안 실온에서 과도한 얼룩을 제거하십시오. 배경색에 따르면, 메탄올 세척은 2~3회 할 수 있으며 탈색 시간을 연장할 수 있다.
- MABT로 실온에서 2회, 부드러운 교반으로 세척당 5분동안 씻으시기. 슬라이드를 새 필터 용지로 옮김으로 옮김을 옮김. 글리세롤 50 μL을 넣으세요. 커버립을 추가하고 현미경으로 관찰하십시오.
참고: 용액 조성물은 표 2에나타내고 있습니다.
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Representative Results
ISH와 관련된 단계에 대한 요약은 그림 1에나와 있습니다. dmrt1에 대한 안티센스 및 상응하는 감각 리보프로브는 COELOMIC 유체 cDNAs로부터 증폭된 PCR 제품으로부터 합성되었다. PCR 제품의 진위는 직접 시퀀싱을 통해 확인되었습니다. 리보프로브는 제조사의 프로토콜및 이전 보고서4에 따라 T7 RNA 폴리머라제와 약간의 수정을 사용하여 합성되었다. ISH의 대표적인 신호는 그림 2에나와 있습니다. dmrt1을 표적으로 하는 안티센스 리보프로브를 가진 시분누스 누두스 coelomic 유체의 ISH는 정자의 트로포블라스트 세포에 집중된 보라색 염색을 밝혀냅니다(그림2A, B,적색 화살표). 센스 리보프로브는 음성 대조군으로 사용되었고, dmrt1에 대한 센스 리보프로브는 어떠한 혼성화 신호도 검출하지못했다(도 2C).
그림 1. ISH의 흐름 다이어그램. 파란색 상자는 리보프로브를 합성하는 단계입니다. 연한 녹색 상자는 시적 절차에 대한 단계입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. ISH에 의해 검출된 시분큘러스 누두스 코로믹 유체에서 dmrt1의 발현. (A, B) dmrt1 안티센스 리보프로브와의 혼성화. (C) dmrt1 센스 리보프로브를 가진 혼성화. 빨간색 화살표는 트로포블라스트 세포에서 혼성화 신호를 나타냅니다. sz, 정자. 스케일 바: 50 μm. 이 수치는 Li 외15에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 시퀀스 (5′-3′) |
| 안티 프로브 F | 아카트그타그그트타트타트타트 |
| 안티 프로브 R | 타타그액트액타그그그틀트CTCTCTATATA |
| 감지 프로브 F | 타타그액트액타그가아카아카아타그그트타타트타트TGG |
| 감지 프로브 R | CTGTTCTCTATATATA |
표 1. dmrt1 프라이머 서열.
| 시약 | 구성 |
| 5 × TBE (1L) | 트리스 54 g, 붕산 27.5 g 및 20 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0). |
| 10 × PBS (5 L) | NaCl 400 g, KCl 10 g, Na2HPO 4 72g, KH2PO412 g. |
| DEPC-PBS (1L) | 1 L 의 1 × PBS 및 1 mL DEPC. |
| 1 × PBS에 4 % PFA (100 mL, pH 7.4) | PFA 4 g 및 100 mL PBS. |
| 10 mg/mL 프로디칼라제 K (1 mL) | 10 mg의 단백질나제 K. |
| 20 × SSC (1 L) | NaCl 175.3 g과 구연산 삼나트륨 소금 88.2 g. |
| 습식 박스 버퍼(50 mL) | 2.5 mL 의 20 × SSC, 22.5 rNase 자유 물 25 mL 및 탈이온화 된 포름 아미드 25 mL. |
| 하이브리드화 믹스(HM, 200 mL) | 탈이온화된 포름아마이드 100 mL, 20 × SSC의 50 mL, 헤파린 10 mg, tRNA 100 mg, 구연산 0.39 g, 트웬-20 20 및 RNase 자유 물 200 mL. |
| 워시 버퍼(1L) | 50 mL 의 20 × SSC, 500 mL의 탈이온 화 포르 마미드, 450 mL의 멸균 수 및 1 mL 트웬-20. |
| MABT (1 L) | 11.6 g의 남성산, 8.77 g의 NaCl, 8.25 g의 NaOH 및 1 mL 트웬-20. |
| 블로킹 버퍼 | 1 × MABT, 2 % 양 세럼 (vol / vol) 및 2 mg / mL BSA. |
| 알칼리성 인산염 완충제 | 100 mM NaCl, 100 mM 트리스 HCl (pH 9.5), 50 mM MgCl2,0.1% 트웬 20 (vol/vol). |
| 스톱 솔루션 | 0.1 M 글리신, pH 2.2. |
표 2. ISH 프로토콜에 사용되는 솔루션의 구성입니다.
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Discussion
이전 연구는 ISH가 다중 표적 RNA16,,17,,18을검출하기에 적합하다는 것을 보여주었다. 이 프로토콜에서, 우리는 coelomic 액체에 있는 mRNA를 검출하고 Sipunculus nudus에 있는 최적화된 혼성화 조건을 강조하는 고분해능 ISH 방법을 기술했습니다. 우리가 관찰한 dmrt1의 명백한 신호는 유전자 발현의 검출에서 이 프로토콜의 성공적인 적용을 입증하였다(도2).
실험 중에 일련의 단계가 특별한 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 표적 유전자에 대한 감지 리보프로브는 대조군으로서 합성되어야 한다. 합성 후, 리보프로브의 품질은 겔상에서 확인되어야 한다. 불 쌍 한 RNA 합성 섹션에 아무 얼룩 귀 착될 것 이다. 둘째, 시료 수집 과정은 세포 변형을 방지하기 위해 순해야하며, 실험은 RNA 분해를 방지하기 위해 coelomic 유체 수집 직후에 수행되어야한다. 셋째, 배양 시간과 시간은 단축또는 길지 않고 모든 단계에서 정확하게 따라야합니다. 특히, 단백질성 K 치료의 타이밍에 주의를 기울이라. 단백질AASE K의 처리 시간이 너무 길면 시료의 세포 구조가 파괴될 수 있으며, 처리 시간이 너무 짧으면서 리보프로브가 세포에 제대로 진입하는 것을 허용하지 않을 것이다. 마지막으로, 슬라이드는 실험 중에 건조되지 않아야합니다. 이 방법은 60 °C에서 혼성화 단계를 수반하여 시약 증발의 위험을 증가시킵니다. 프로토콜 섹션에 명시된 바와 같이, 슬라이드는 젖은 상자에 넣고 증발을 피하기 위해 파라핀 필름으로 덮여 있어야합니다.
이 프로토콜의 한 가지 제한은 비모델 유기체인 시분큘러스 누두스에서리보프로브 서열을 획득하는 데, 왜냐하면 잘못 서열화된 mRNA는 리보프로브의 낮은 특이성을 부여할 수 있기 때문이다. 시퀀싱 기술의 개발과 함께, Sipunculus nudus의 점점 더 높은 품질의 시퀀스가 출시 될 예정이다, 이는 크게이 상황을 개선 할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단의 젊은 과학자 기금에 의해 지원되었다 (그랜트 번호 31801034), 푸젠 성의 자연 과학 재단, 중국 (2016J01161), 화차오 대학의 과학 연구 기금 (15BS306) 및 Huaqiao 대학의 과학 연구에 대학원생의 혁신적인 기금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
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