Summary
Este protocolo descreve uma abordagem eficaz de hibridização in situ para detectar os níveis de expressão mRNA e padrões espaciais de genes-alvo em fluido coelomico Sipunculus nudus.
Abstract
In situ hybridization (ISH) é uma técnica muito informativa para apresentar padrões de distribuição celular de genes específicos (por exemplo, mRNA e ncRNA) em tecidos. O verme sipunculid Sipunculus nudus é um recurso crucial da pesca, pois possui altos valores nutricionais e medicinais. Atualmente, a pesquisa sobre a biologia molecular do Sipunculus nudus ainda está em sua infância. O objetivo deste artigo é desenvolver um método sensível para localizar mRNA específico em fluido coelomico Sipunculus nudus. O protocolo inclui etapas detalhadas do ISH, incluindo tratamento antisense e sense riboprobe com rótulo de digoxigenina, coleta de fluidos coelómicos e preparação de seção, hibridização específica de ribosque, incubação de anticorpos, coloração e tratamentos pós-coloração. Os resultados representativos obtidos a partir de um experimento bem sucedido usando este método são demonstrados. O protocolo deve ser aplicável a outras espécies de Sipuncula também.
Introduction
ISH, usando uma sonda de ácido nucleico rotulado para detectar a seqüência específica de interesse do DNA ou RNA, é um método útil para descrever o padrão de expressão espacial dos genes-alvo em tecidos morfologicamente preservados1,2,3. Normalmente, a seqüência de destino é gerada por reação em cadeia de polimerase (PCR), e então usada como modelo para sintetizar a sonda RNA antisense/sense rotulada com digoxigenina uridina-5'-triphosphate. As amostras são fixas e permeabilizadas antes da incubação com riboprobe. Após a lavagem da sonda em excesso, a hibridização é visualizada pela imunohistoquímica usando um anticorpo anti-digoxygenin, que é alcalino fosphatase conjugado3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordem Sipunculida: Sipunculidae) é um verme marinho não segmentado, coelomato e bilateralmente simétrico7,8. Sipunculus nudus é uma espécie cosmopolita amplamente distribuída em águas costeiras tropicais e temperadas. É também um importante recurso de pesca marinha no sul da China devido aos seus altos valores nutricionais e medicinais9,10. No entanto, sipunculus nudus em biologia molecular ainda está em sua infância. Para entender completamente o papel biológico dos genes, a investigação de padrões de expressão de genes em uma resolução celular é de grande interesse. No organismo não modelo Sipunculus nudus, o método ISH, que é um método ideal para detectar os padrões de expressão dos genes, ainda não foi estabelecido. Seu fluido coelómico contém vários tipos de células, incluindo granulócitos, células de urna, células vesiculares, células germinativas, eritrócitos,etc. O fator de transcrição relacionado ao sexo duplo/mab-3 -1 (dmrt1), usado como gene representativo neste método, é um regulador transcricional altamente conservado de determinação e diferenciação sexual na maioria das espécies que variam de invertebrados a mamíferos12,13. Em uma variedade de espécies (ou seja, porgy preto, etc.) 14, dmrt1 foi expresso nas células sertoli, em torno das células germinais, cuja função é semelhante às células trophoblastas de Sipunculus nudus. Portanto, nós imaginamos que dmrt1 de Sipunculus nudus é expresso em células trophoblast as espermatozeugmata, e o resultado do método ISH confirmou claramente a hipótese.
Este protocolo pela primeira vez descreve ish, com sondas antisense/sense mRNA rotuladas de digoxigenina, para determinar padrões de expressão mRNA em sua mancha de fluido coelómico. As condições de reação ideais são fornecidas, que permitem uma visualização muito sensível da expressão mRNA em alta resolução. O método ISH desenvolvido poderia ser potencialmente aplicado em mais espécies sipunculida além de Sipunculus nudus.
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Protocol
O procedimento animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Bem-Estar Animal da Universidade de Huaqiao.
1. Preparação riboprobe
- Design de primer
- Abra o programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copie a seqüência dmrt1 (GenBank: MK182259) na janela de seqüência.
- Definir o comprimento do primer (23-25 bp), a temperatura de fusão (55-60 °C) e o conteúdo G/C (40-60%). Clique em Escolher primers.
NOTA: O tamanho mínimo necessário para a sonda RNA é de aproximadamente 500 bp. As sondas mais longas normalmente têm maior especificidade. - Adicione a seqüência de promotor de polimerase T7 RNA (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) a um dos primers selecionados. As seqüências de primer dmrt1 para ISH são mostradas na Tabela 1.
NOTA: Para sondas de sentido, o promotor de polimerase T7 RNA está localizado na extremidade de 5' dos primers dianteiros. Para sondas antisense, o promotor de polimerase T7 RNA está localizado na extremidade de 5'-end dos primers reversos.
- Amplificação pcr
- Coloque os tubos de microfuge no gelo e prepare a seguinte mistura de reação (para uma reação de 50 μL): 1x mistura de polimerase de DNA Taq, 1 μg de cDNA (que é preparado a partir de 100 μL de fluido coelómico), 1 μM primer dianteiro, primer reverso de 1 μM e água sem nuclease.
- Misture a reação pcr por pipetting e centrífuga brevemente.
- Coloque o tubo de reação em um ciclador térmico e execute o PCR utilizando as seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C por 2 min seguido de 36 ciclos de desnaturação a 95 °C para 30 s, recozimento a 55-60 °C para 30 s, extensão a 72 °C para 30 s e uma extensão final a 72 °C para 7 min.
NOTA: A temperatura de recozimento deve ser otimizada de acordo com os primers.
- Purificação e verificação de produtos PCR
- Carregue a mistura de 50 μL de PCR diretamente em um gel de agarose de 1%. Execute o gel de agarose em 150-180 V por 10 min em 0,5x TBE. Isole os fragmentos específicos de DNA do gel de agarose de 1%.
NOTA: O DNA deve aparecer como uma única banda e não como uma mancha. - Purifique os fragmentos de DNA usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante. Quantifique os produtos purificados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm.
- Verifique a autenticidade dos produtos PCR por seqüenciamento.
NOTA: (Ponto de pausa) Os produtos PCR purificados podem ser armazenados a -20 °C por vários meses.
- Carregue a mistura de 50 μL de PCR diretamente em um gel de agarose de 1%. Execute o gel de agarose em 150-180 V por 10 min em 0,5x TBE. Isole os fragmentos específicos de DNA do gel de agarose de 1%.
- Síntese de ribosque
- Coloque os tubos de microfusão sem RNase no gelo e adicione o seguinte ao tubo de microfuge (para uma reação de 10 μL): 1x Mistura de Rotulagem de RNA digoxygenin, tampão de transcrição 1x, 0,5 μL de inibidores de RNase, 1 μL de polimerases De RNA T7, 1 μg de produto PCR e água livre de RNase. Misture a reação por pipetting e centrífuga brevemente. Incubar por 2h a 37 °C.
- Adicione 2 μL de DNase I. Misture a reação por pipetting e centrífuga brevemente. Incubar por 15 min a 37 °C.
- Adicionar 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8.0). Misture a reação por pipetting e centrífuga brevemente.
- Adicione 2,5 μL de 4 M LiCl e 75 μL de etanol pré-resfriado à reação acima. Misture bem. Deixe por 30 min a -70 °C.
- Centrífuga a 12.000 x g por 10 min a 4 °C. Decante o etanol. Adicione 1 mL de etanol pré-resfriado (v/v) e lave a precipitação misturando suavemente.
- Centrífuga a 12.000 x g por 5 min a 4 °C. Decante os 70% de etanol e seque a precipitação brevemente perto de uma lâmpada de álcool. Dissolva a precipitação adicionando 30 μL de água livre de RNase e misture suavemente.
- Carregue 2 μL de RNA sintetizado em um gel de agarose de 1%. Execute o gel de agarose a 180 V por 5-10 min em 0,5x TBE. Meça a concentração do RNA rotulado usando um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 260 nm.
- Use tubos de microfusão sem RNase e pontas de filtro para evitar a contaminação do RNase.
NOTA: (Ponto de pausa) As sondas com rótulo de digoxygenin podem ser armazenadas a -70 °C por vários meses.
- Use tubos de microfusão sem RNase e pontas de filtro para evitar a contaminação do RNase.
2. Coleta de fluido sélomico
- Fixe o S. nudus na mesa de dissecção com alfinetes. Abra o corpo do S. nudus com uma pequena tesoura autoclaved. Isole o fluido coelómico com uma pipeta.
- Coletar e transferir 1 mL de fluido coelómico com uma pipeta para lâminas de microscópio tratadas com poli-D. Aplique o fluido coelómico uniformemente com uma ponta de pipeta. Seque o ar das lâminas por 1h a 37 °C.
3. Hibridização in situ
- Dia 1º
- Reidrate as lâminas em um frasco de coloração de slides contendo 100 mL de 1x de pirocarbonato de pirocarbonato de 1x tratado de fosfato tamponado (DEPC-PBS). Reidratar 3 vezes com 1x DEPC-PBS, 5 min por lavagem com agitação suave.
- Permeabilizar a mancha de fluido coelómico por digestão com 10 μg/mL proteinase K à temperatura ambiente por 5 min. Incubar as lâminas em 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 min para parar a digestão. Lave os slides em 1x DEPC-PBS com agitação suave por 5 min 3 vezes.
- Adicione 50 μL de mistura de hibridização (HM) contendo a ribofon de sentido/antisentido nos slides e adicione um deslizamento de tampa.
- Adicione o tampão da caixa molhada na caixa molhada. Coloque os slides na caixa molhada e sele bem com filme de parafina. Hibridização durante a noite (pelo menos 16 horas) a 60 °C.
- Dia 2
- Pré-aqueça o tampão de lavagem a 65 °C. Mergulhe o slide no frasco de coloração de slides contendo o tampão de lavagem e deixe-o em pé até que a tampa deslize automaticamente. Leva cerca de 5 min.
- Lave 2 vezes com tampão de lavagem a 65 °C, 30 min por lavagem com agitação suave. Lave 2 vezes com citrato de sódio salino de 0,2x (SSC) a 65 °C, 30 min por lavagem com agitação suave. Lave 2 vezes com tampão de ácido maleico contendo Tween 20 (MABT) à temperatura ambiente, 30 min por lavagem com agitação suave.
- Incubar os slides à temperatura ambiente por 3-4 h no tampão de bloqueio. Incubar os slides em 1 mL anti-digoxigenina-AP Solução fab diluída a 1/5000 com o tampão de bloqueio a 4 °C durante a noite.
- Dia 3.
- Remova a solução de anticorpos e lave os slides brevemente em MABT. Lave 4 vezes com MABT em temperatura ambiente, 25 min por lavagem com agitação suave.
- Incubar os slides com tampão de fosfatase alcalina à temperatura ambiente 3 vezes, 5 min por lavagem. Remova o tampão de fosfatase alcalina e adicione 1 mL de solução de coloração 5-bromo-4-cloro-3-indolyl fosfato (BCIP)/nitro blue tetrazolium (NBT). Mantenha os slides no escuro.
- Observe a reação de cores periodicamente sob um microscópio óptico. Quando a cor estiver totalmente desenvolvida (tempo de reação na faixa de 1-4 h), lave as lâminas 2 vezes com MABT à temperatura ambiente, 5 min por lavagem com agitação suave.
- Lave 2 vezes com solução de parada à temperatura ambiente, 15 min por lavagem com agitação suave. Incubar as lâminas em metanol para remover o excesso de manchas, em temperatura ambiente por 30 min. De acordo com a cor de fundo, a lavagem de metanol pode ser feita 2 ou 3 vezes e o tempo de descoloração pode ser estendido.
- Lave 2 vezes com MABT em temperatura ambiente, 5 min por lavagem com agitação suave. Transfira os slides para um papel filtro fresco. Adicione 50 μL de glicerol. Adicione as tampas e observe microscopicamente.
NOTA: A composição da solução é mostrada na Tabela 2.
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Representative Results
Um resumo das etapas envolvidas no ISH é ilustrado na Figura 1. As ribofs de sentido antisentido e correspondente para dmrt1 foram sintetizadas a partir de produtos PCR amplificados a partir do fluido coelómico cDNAs. A autenticidade dos produtos PCR foi verificada por sequenciamento direto. As ribosques foram sintetizadas usando polimerases De acordo com os protocolos do fabricante e um relatório anterior4 com algumas pequenas modificações. Os sinais representativos do ISH são mostrados na Figura 2. ISH de fluido coelomico Sipunculus nudus com riboprobe antisense que tem como alvo dmrt1 revela coloração roxa concentrada em células trophoblastas do espermatozeugmata(Figura 2A, B,setas vermelhas). Um ribosque de sentido foi usado como um controle negativo, e a ribofapara dmrt1 não detectou nenhum sinal de hibridização(Figura 2C).
Figura 1. Diagrama de fluxo de ISH. Caixas azuis são os passos para sintetizar riboprobe. Caixas verdes claros são etapas para procedimentos in situ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A expressão de dmrt1 em fluido coelomic o nudus sipunculus detectado pelo ISH. (A, B) Hibridização com riboprobe antisense dmrt1. (C) Hibridização com ribosque de sentido dmrt1. As setas vermelhas representam sinais de hibridização em células trophoblastas. sz, espermatozeugmata. Barra de escala: 50 μm. Esta figura foi modificada a partir de Li et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Seqüência (5′-3′) |
| Anti-Sonda F | ACAATGTAGGGTTTATTGG |
| Anti-Sonda R | TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTTCTATGCATCCAGTAAA |
| Sonda de sentido F | TAATACGACTCACTATAGGACACATGTAGGGTTTATTGG |
| Sonda de sentido R | CTGTTCTCTTGCATCCAGTAA |
Tabela 1. As seqüências do primer dmrt1.
| Reagente | Composição |
| 5 × TBE (1 L) | 54 g de Tris, 27,5 g de ácido bórico e 20 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0). |
| 10 × PBS (5 L) | 400 g de NaCl, 10 g de KCl, 72 g de Na2HPO4 e 12 g de KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 L de 1 × PBS e 1 mL DEPC. |
| 4% PFA em 1 × PBS (100 mL, pH 7.4) | 4 g de PFA e 100 mL PBS. |
| 10 mg/mL proteinase K (1 mL) | 10 mg de proteinase K. |
| 20 × SSC (1 L) | 175,3 g de NaCl e 88,2 g de ácido cítrico de sal trissódico. |
| Tampão de caixa molhada (50 mL) | 2,5 mL de 20 × SSC, 22,5 mL de água livre rnase e 25 mL de formamide deionizada. |
| Mistura de hibridização (HM, 200 mL) | 100 mL de formamide deionizada, 50 mL de 20 × SSC, 10 mg de heparina, 100 mg de tRNA, 0,39 g de ácido cítrico, 200 μL de água livre de Tween-20 e RNase a 200 mL. |
| Tampão de lavagem (1 L) | 50 mL de 20 × SSC, 500 mL de formamide deionizada, 450 mL de água estéril e 1 mL Tween-20. |
| MABT (1 L) | 11,6 g de ácido maleico, 8,77 g de NaCl, 8,25 g de NaOH e 1 mL Tween-20. |
| Tampão de bloqueio | 1 × MABT, 2% de soro de ovelha (vol/vol) e 2 mg/mL BSA. |
| Tampão de fosfatase alcalina | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl (pH 9.5), 50 mM MgCl2, e 0.1% Tween 20 (vol/vol). |
| Solução de parada | 0,1 M glicina, pH 2.2. |
Tabela 2. A composição das soluções utilizadas no protocolo ISH.
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Discussion
Estudos anteriores mostraram que o ISH é adequado para detectar múltiplas rnas alvo16,,17,18. Neste protocolo, descrevemos um método ISH de alta resolução para detectar o mRNA em fluido coelómico e enfatizar as condições de hibridização otimizadas em Nudus Sipunculus. Os sinais óbvios de dmrt1 que observamos demonstraram a aplicação bem sucedida deste protocolo na detecção da expressão genética (Figura 2).
Durante o experimento, uma série de passos precisam ser dadas atenção especial. Em primeiro lugar, as ribofs sense para os genes alvo devem ser sintetizadas como o controle. Após a síntese, a qualidade da ribosque deve ser verificada em um gel. A má síntese de RNA não resultará em manchas nas seções. Em segundo lugar, o processo de coleta da amostra deve ser suave para evitar a deformação celular e o experimento deve ser realizado imediatamente após a coleta de fluido sélomico para evitar a degradação do RNA. Em terceiro lugar, o tempo e os tempos de incubação devem ser exatamente seguidos em todas as etapas sem encurtar ou alongar. Em particular, preste atenção ao tempo do tratamento proteinase K. Tempo de tratamento muito longo da proteinase K levará à destruição da estrutura celular da amostra, enquanto o tempo de tratamento muito curto não permitirá que a ribofaque entre na célula corretamente. Finalmente, os slides não devem secar durante o experimento. Este método envolve uma etapa de hibridização a 60 °C, o que aumentará os riscos de evaporação do reagente. Conforme indicado na seção de protocolo, os slides devem ser colocados em uma caixa molhada e cobertos com filme de parafina para evitar a evaporação.
Uma limitação deste protocolo é a aquisição de seqüências de ribosqueprobe em organismo não modelo Sipunculus nudus,porque o mRNA mal sequenciado pode conferir baixa especificidade da riboprobe. Com o desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento, serão lançadas mais e mais sequências de alta qualidade do Sipunculus nudus, o que melhorará muito essa situação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Jovens Cientistas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant nº 31801034), da Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (2016J01161), do Fundo de Pesquisa Científica da Universidade huaqiao (15BS306) e do Fundo Inovador de Pós-Graduação em Pesquisa Científica da Universidade de Huaqiao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
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