Summary
Этот протокол описывает эффективный подход к гибридизации на месте для определения уровней экспрессии мРНК и пространственных моделей генов-мишеней в коеломной жидкости Sipunculus nudus.
Abstract
На месте гибридизация (ISH) является очень информативным методом представления клеточных моделей распределения конкретных генов (например, мРНК и ncRNA) в тканях. Сипункулидный червь Sipunculus nudus является важнейшим рыбным ресурсом, поскольку он имеет высокие питательные и лекарственные значения. В настоящее время исследования молекулярной биологии Sipunculus nudus все еще находятся в зачаточном состоянии. Целью данной статьи является разработка чувствительного метода локализации специфической мРНК в сипункулусе нудуса-келомической жидкости. Протокол включает в себя подробные шаги ISH, в том числе digoxigenin помечены антисмысл и смысл riboprobe подготовки, coelomic сбора жидкости и подготовки секции, конкретные гибридизации рибозонда, инкубации антител, окраски и пост-окраски лечения. Доказаны репрезентативные результаты успешного эксперимента с использованием этого метода. Протокол должен быть применим и к другим видам Сипункулы.
Introduction
ISH, используя помеченные нуклеиновой кислоты зонд для обнаружения конкретной ДНК или РНК последовательность интересов, является полезным методом для описания пространственной экспрессии картины генов-мишеней в морфологически сохраненныхтканей 1,2,3. Как правило, целевая последовательность генерируется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а затем используется в качестве шаблона для синтеза антисмыслового/чувстве РНК-зонда, помеченного дигоксигенином моридином-5'-трифосфатом. Образцы фиксируются и пронизаны перед инкубации с помощью рибозаза. После смыва избыточного зонда, гибридизация визуализируется иммуногистохимией с помощью антидигоксигенина антитела, которое щелочной фосфатазы-конъюгированных3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; заказ Sipunculida: Sipunculidae) является unsegmented, coelomate и двусторонним симметричным морским червем7,8. Sipunculus nudus является космополитическим видом, широко распространенным в тропических и умеренных прибрежных водах. Он также является важным морским промысловым ресурсом на юге Китая из-за его высокой питательной и целебной ценности9,,10. Тем не менее, Sipunculus nudus в молекулярной биологии все еще находится в зачаточном состоянии. Чтобы в полной мере понять биологическую роль генов, большой интерес представляет исследование моделей экспрессии генов в клеточном разрешении. В немодельном организме Sipunculus nudusметод ISH, который является идеальным методом обнаружения моделей экспрессии генов, до сих пор не установлен. Его кельомная жидкость содержит несколько типов клеток, в том числе гранулоциты, клетки урны, пузырькулярные клетки, зародышевые клетки, эритроциты и т.д.11. Двойной секс / mab-3 связанных транскрипции фактор-1(dmrt1), используется в качестве репрезентативного гена в этом методе, является весьма сохранены транскрипции регулятора определения пола и дифференциации в большинстве видов, начиная от беспозвоночных для млекопитающих12,13. В целом ряде видов (нат., черный порги и т.д.) 14, dmrt1 был выражен в клетках Sertoli, окружающих зародышевые клетки, функция которых похожа на трофобластные клетки Sipunculus nudus. Поэтому мы предположили, что dmrt1 из Sipunculus nudus выражается в трофобластных клетках сперматозiii,-и результат метода ISH четко подтвердил гипотезу.
Этот протокол впервые описывает ISH, с digoxigenin помечены антисмысл / смысл мРНК зондов, чтобы определить мРНК экспрессии моделей в его coelomic мазка жидкости. Обеспечиваются оптимальные условия реакции, которые позволяют очень чувствительновую визуализацию экспрессии мРНК в высоком разрешении. Разработанный метод ISH потенциально может быть применен в более sipunculida видов, кроме Sipunculus nudus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедура животных была одобрена Комитетом по уходу за животными и благополучию Университета Хуацяо.
1. Препарат Рибозонда
- Дизайн праймера
- Откройте программу Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Копируйте последовательность dmrt1 (GenBank: MK182259) в окне последовательности.
- Установите длину грунтовки (23-25 bp), температуру плавления (55-60 градусов по Цельсию) и содержание G/C (40-60%). Нажмите Выберите праймеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный размер, необходимый для ЗОНДа РНК составляет около 500 bp. Более длинные зонды обычно имеют более высокую специфичность. - Добавьте последовательность промотора t7 РНК-полимераза (5, -TAATACGACTActActATAGGG-3),к одному из выбранных праймеров. Последовательности праймеров dmrt1 для ISH отображаются в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для зондов чувств, промоутер Полимераза T7 РНК расположен в 5'end форвардных грунтовок. Для антисмысловых зондов, t7 РНК-полимераза промоутер расположен на 5'-конец обратного грунтовки.
- Усиление ПЦР
- Поместите микрофуге трубки на лед, и подготовить следующую смесь реакции (для 50 мл реакции): 1x Taq ДНК полимеразы смесь, 1 мкг кДНК (которая готовится из 100 кЛ coelomic жидкости), 1 ММ вперед грунтовки, 1 ММ реверсивной грунтовки и нуклеаза воды.
- Смешайте реакцию ПЦР путем краткого типопетирования и центрифуги.
- Поместите реакционную трубку в тепловой цикл, и запустить ПЦР, используя следующие условия: начальная денатурация при 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин, а затем 36 циклов денатурации при 95 градусах по Цельсию в течение 30 с, аннулирование при 55-60 c для 30 с, расширение на 72 градусов по Цельсию на 30 с и окончательное расширение на 72 градусов по Цельсию в течение 7 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура аннулирования должна быть оптимизирована в соответствии с грунтовки.
- Очистка и проверка пЦР
- Загрузите смесь ПЦР на 50 л пЦР непосредственно на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 150-180 V в течение 10 минут в 0,5x TBE. Изолировать конкретные фрагменты ДНК из 1% агарозного геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК должна отображаться как одна полоса, а не как мазок. - Очистите фрагменты ДНК с помощью комплекта для извлечения геля в соответствии с протоколом производителя. Количественно очищенные продукты с помощью спектрофотометрии на длине волны 260 нм.
- Проверьте подлинность продуктов ПЦР путем секвенирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Точка паузы) Очищенные продукты ПЦР могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
- Загрузите смесь ПЦР на 50 л пЦР непосредственно на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 150-180 V в течение 10 минут в 0,5x TBE. Изолировать конкретные фрагменты ДНК из 1% агарозного геля.
- Синтез рибозонда
- Поместите RNase-бесплатные микрофугевые трубки на льду, и добавьте следующее к микрофуговой трубке (для реакции 10 л): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x транскрипционный буфер, 0,5 злингинговых ингибиторов RNase, 1 Зл полимеразы РНК T7, 1 мкг продукта ПЦР и безробиливая rNase. Смешайте реакцию путем пипетки и центрифуги кратко. Инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте 2 Зла без RNase DNase I. Смешайте реакцию трубацией и центрифугой кратко. Инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте 2 л 0,2 М ЭДТА (pH 8.0). Смешайте реакцию путем пипетки и центрифуги кратко.
- Добавьте к вышеуказанной реакции 2,5 л из 4 М ЛиКлал и 75 л прешилового этанола. Хорошо перемешать. Оставьте на 30 мин при -70 градусов по Цельсию.
- Центрифуга при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Декант этанол. Добавьте 1 мл прешилационного 70% этанола (v/v) и вымойте осадки, аккуратно перемешивая.
- Центрифуга при 12 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Decant 70% этанол и высушите осадки кратко около светильника спирта. Растворите осадки, добавив 30 кЛ безрычания воды и аккуратно перемешайте.
- Загрузите 2 Зл синтезированной РНК на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 180 V в течение 5-10 мин в 0,5x TBE. Измерьте концентрацию маркированной РНК с помощью спектрофотометра на длине волны 260 нм.
- Используйте RNase-бесплатные микрофуги трубки и фильтр советы, чтобы избежать загрязнения RNase.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Пауза точки) Digoxygenin помечены зонды могут храниться при -70 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
- Используйте RNase-бесплатные микрофуги трубки и фильтр советы, чтобы избежать загрязнения RNase.
2. Коллекция coelomic жидкости
- Зафиксните S. nudus на таблице вскрытия с булавками. Откройте корпус S. nudus с небольшими автоклавными ножницами. Изолировать коеломную жидкость пипеткой.
- Соберите и перенесите 1 мл коеломической жидкости с пипеткой на поли-D-лизина обработанных слайдов микроскопа. Нанесите coelomic жидкости равномерно с кончиком пипетки. Воздушно-сухие горки для 1 ч при 37 градусах Цельсия.
3. На месте гибридизации
- День 1
- Регидратировать слайды в слайд окрашивания банку, содержащую 100 мл 1x диэтил пиробунабоната обработаны фосфат буферного солей (DEPC-PBS). Регидратировать 3 раза с 1x DEPC-PBS, 5 мин на промывку с нежным возбуждением.
- Пермяки мазок коеломической жидкости путем пищеварения с 10 мкг/мл протеиназы K при комнатной температуре в течение 5 мин. Инкубировать слайды в 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин, чтобы остановить пищеварение. Вымойте слайды в 1x DEPC-PBS с нежным возбуждением в течение 5 мин 3 раза.
- Добавьте 50 зл гибридизации смеси (HM), содержащий смысл / антисмысл рибозонд на слайдах и добавить крышку скольжения.
- Добавьте буфер мокрой коробки во влажную коробку. Положите слайды в мокрой коробке и печать хорошо с парафина пленки. Гибридизировать ночь (не менее 16 ч) при 60 градусах Цельсия.
- День 2
- Разогреть буфер для мытья при температуре 65 градусов по Цельсию. Погрузите слайд в слайдок окрашивания банку, содержащую мыть буфер и дайте ему стоять, пока coverslip соскальзывает автоматически. Это занимает около 5 минут.
- Вымойте 2 раза с мытьем буфера при 65 градусов по Цельсию, 30 минут на мытье с нежным возбуждением. Вымойте 2 раза с 0,2x солевым натриевым цитратом (SSC) при 65 градусах Цельсия, 30 мин на промывку с нежным возбуждением. Вымойте 2 раза с мужской кислотой буфера, содержащего Tween 20 (MABT) при комнатной температуре, 30 минут на мыть ежевый с нежным возбуждением.
- Инкубировать слайды при комнатной температуре 3-4 ч в блокирующем буфере. Инкубировать слайды в 1 мл анти-digoxigenin-AP Fab фрагменты раствора разбавленного на 1/5000 с блокирующим буфером на 4 градуса Цельсия в одночасье.
- День 3
- Удалите раствор антитела и кратко вымойте слайды в MABT. Вымойте 4 раза с MABT при комнатной температуре, 25 мин за стирку с нежным возбуждением.
- Инкубировать слайды щелочным буфером фосфатазы при комнатной температуре 3 раза, 5 мин на стирку. Удалите щелочный фосфатазный буфер и добавьте 1 мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP)/нитро синий тетразолий (NBT) окрашивающий раствор. Держите слайды в темноте.
- Периодически наблюдайте за цветовой реакцией под оптическим микроскопом. Когда цвет полностью развит (время реакции в диапазоне 1-4 ч), промойте горки 2 раза с MABT при комнатной температуре, 5 мин на промывку с нежным возбуждением.
- Вымойте 2 раза стоп-раствором при комнатной температуре, 15 мин на промывку с нежным возбуждением. Инкубировать горки в метаноле, чтобы удалить избыток пятна, при комнатной температуре в течение 30 минут. В зависимости от цвета фона, метанол мыть можно сделать 2 или 3 раза и время деколонации может быть продлен.
- Вымойте 2 раза с MABT при комнатной температуре, 5 мин за стирку с нежным возбуждением. Перенесите слайды на свежую фильтровальную бумагу. Добавьте 50 л глицерола. Добавить крышки и наблюдать микроскопически.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав решения показан в таблице 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Краткое изложение шагов, связанных с ISH, иллюстрируется на рисунке 1. Антисмысловые и соответствующие рибозонды для dmrt1 были синтезированы из продуктов ПЦР, усиленных из кДНС, кокломических жидкостей. Подлинность продуктов ПЦР была проверена путем прямого секвенирования. Рибозонды были синтезированы с использованием T7 РНК-полимеразы в соответствии с протоколами производителя и предыдущий доклад4 с некоторыми незначительными изменениями. Репрезентативные сигналы ISH показаны на рисунке 2. ISH Sipunculus nudus coelomic жидкости с антисмыслами рибозонд, что цели dmrt1 показывает фиолетовый окрашивания сосредоточены в трофобластных клеток сперматозюгмата (Рисунок 2A, B, красные стрелки). Чувство рибозонд был использован в качестве отрицательного контроля, и чувство рибозонд для dmrt1 не обнаружить какой-либо сигнал гибридизации (Рисунок 2C).
Рисунок 1. Диаграмма потока ISH. Синие коробки являются шагами для синтеза рибозаза. Светло-зеленые коробки шаги для in situ процедур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Выражение dmrt1 в Sipunculus nudus coelomic жидкости обнаружены ISH. (A, B) Гибридизация с дрмт1 антисмыслами рибозонд. (C) Гибридизация с dmrt1 чувство рибоз. Красные стрелки представляют собой сигналы гибридизации в трофобластных клетках. sz, spermatozeugmata. Шкала бар: 50 мкм. Эта цифра была изменена с Li et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя | Последовательность (5 "-3") |
| Анти-зонд F | АКААТГТАГГАГГГГТТАТКТТГГГ |
| Анти-зонд R | ТААТАКАКТАКАКТАСТАСТАГГАГАГАТТАГАТТАТТТККЦАГКАГКАГТАГАА |
| Чувство-зонд F | ТААТАКГАКТАКАКТАСТАСТАСТАГГАГАГАГАГАГАГААААААААААТГТАГГАГГГГТТАТАТКТТГГГ |
| Чувство-зонд R | CTGTTCTCTATCTATCCAGTAAA |
Таблица 1. Последовательности праймерd dmrt1.
| Реагента | Состав |
| 5 - ТБЕ (1 л) | 54 г Триса, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 м ЭДТА (рН 8,0). |
| 10 - PBS (5 л) | 400 г NaCl, 10 г KCl, 72 г Na2HPO4 и 12 г KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 л из 1 ПБС и 1 мл DEPC. |
| 4% PFA в 1 пБС (100 мл, рН 7,4) | 4 г ПБП и 100 мл PBS. |
| 10 мг/мл протеиназа K (1 мл) | 10 мг протеиназа К. |
| 20 - SSC (1 L) | 175,3 г NaCl и 88,2 г лимонной кислоты трехнатриевой соли. |
| Влажный буфер коробки (50 мл) | 2,5 мл 20 sSC, 22,5 мл свободной воды RNase и 25 мл деионизированного формамида. |
| Гибридизация смеси (HM, 200 мл) | 100 мл деионизированного формамида, 50 мл 20 геск, 10 мг гепарина, 100 мг тРНК, 0,39 г лимонной кислоты, 200 л Твин-20 и свободной воды RNase до 200 мл. |
| Буфер для мытья (1 л) | 50 мл 20 SSC, 500 мл деионизированного формамида, 450 мл стерильной воды и 1 мл Tween-20. |
| МАБТ (1 л) | 11,6 г мужской кислоты, 8,77 г NaCl, 8,25 г NaOH и 1 мл Tween-20. |
| Блокирующий буфер | 1 - MABT, 2% сыворотки овец (vol/vol) и 2 мг/мл BSA. |
| щелочный фосфатазный буфер | 100 мМ NaCl, 100 мм Tris HCl (pH 9.5), 50 мМ MgCl2,и 0,1% Tween 20 (vol/vol). |
| Остановить решение | 0,1 м глицин, рН 2,2. |
Таблица 2. Состав решений, используемых в протоколе ISH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие исследования показали, что ISH подходит для обнаружения нескольких целевых РНК16,,17,,18. В этом протоколе мы описали метод ISH высокого разрешения для обнаружения мРНК в коеломической жидкости и акцента на оптимизированные условия гибридизации в Sipunculus nudus. Очевидные сигналы dmrt1 мы наблюдали продемонстрировали успешное применение этого протокола при обнаружении экспрессии генов(рисунок 2).
В ходе эксперимента необходимо уделить особое внимание ряду шагов. Во-первых, рибозонды чувств для генов-мишеней должны быть синтезированы в качестве контроля. После синтеза, качество рибозонда должны быть проверены на гель. Плохой синтез РНК приведет к отсутствию окрашивания в секциях. Во-вторых, процесс сбора образцов должен быть мягким, чтобы предотвратить деформацию клеток, и эксперимент должен быть выполнен сразу после сбора коеломной жидкости, чтобы предотвратить деградацию РНК. В-третьих, время и время инкубации должны точно соблюдаться во всех шагах без сокращения или удлинения. В частности, обратите внимание на сроки лечения протеиназа K. Слишком длительное время лечения протеиназа K приведет к разрушению клеточной структуры образца, в то время как слишком короткое время лечения не позволит рибозаза войти в клетку должным образом. Наконец, горки не должны высыхать во время эксперимента. Этот метод включает в себя этап гибридизации при 60 градусах Цельсия, что увеличит риск испарения реагентов. Как указано в разделе протокола, слайды должны быть помещены в мокрый ящик и покрыты парафина пленки, чтобы избежать испарения.
Одним из ограничений этого протокола является приобретение последовательностей рибозонда в немодельном организме Sipunculus nudus,потому что плохо секвенированная мРНК может придать низкую специфичность рибозаза. С развитием технологии секвенирования будут выпускаться все больше и больше высококачественных последовательностей Sipunculus nudus, что значительно улучшит эту ситуацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом молодых ученых Национального фонда естественных наук Китая (Грант No 31801034), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2016J01161), Научно-исследовательскими фондами Университета Хуацяо (15BS306) и Инновационным фондом аспирантов в области научных исследований Университета Хуацяо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A.
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
