Summary
このプロトコルは、シプンキュラス・ヌダス・コエロミック流体中の標的遺伝子のmRNA発現レベルおよび空間パターンを検出するための、その場合のハイブリダイゼーションアプローチに有効であることを説明する。
Abstract
situハイブリダイゼーション(ISH)では、組織に特異的な遺伝子(例えばmRNAおよびncRNA)の細胞分布パターンを提示する非常に有益な技術である。シプンキュリドワームシプンクルスヌドゥスは、栄養価と薬効が高いため、重要な漁業資源です。現在、シプンクルス・ヌドゥスの分子生物学に関する研究はまだ初期段階にあります。この記事の目的は、シプンクルスヌダコエロミック流体中の特定のmRNAを局所化するための敏感な方法を開発することです。このプロトコルには、ジゴキシゲニン標識アンチセンスおよびセンスリボプローブ製剤、コエロミック流体採取およびセクション調製、特異的リボプローブハイブリダイゼーション、抗体インキュベーション、着色およびポスト着色治療を含む、ISHの詳細なステップが含まれる。この方法を用いた実験の成功から得られた代表的な結果を示す。このプロトコルは、他のシプンキュラ種にも適用可能である必要があります。
Introduction
ISHは、目的とする特異的DNAまたはRNA配列を検出するために標識核酸プローブを用いて、形態学的に保存された組織11、2、32,3における標的遺伝子の空間発現パターンを記述するのに有用な方法である。通常、標的配列はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成され、次いで、二ゴキシゲニンウリジン-5'-三リン酸で標識されたアンチセンス/センスRNAプローブを合成する鋳型として使用される。サンプルはリボプローブでインキュベーションする前に固定され、透過化される。過剰なプローブを洗浄した後、ハイブリダイゼーションは、アルカリホスファターゼ共役,33、4、5、6である抗ジガオキシゲニン抗体を用いた免疫ヒステクストケミストリーによって可視化される。5,6,4
シプンキュラスヌドゥス(フィラムシプンキュラ;オーダーシプンクリダ:シプンクリダ)は、セグメント化されていない、コエロメートと両側対称海洋ワーム77、88です。シプンクルスヌドゥスは、熱帯および温帯沿岸海域に広く分布する国際的な種です。また、栄養価と薬効値が9,1010であるため、中国南部の重要な海洋漁業資源でもあります。しかし、分子生物学におけるシプンクルス・ヌーダスはまだ初期段階にあります。遺伝子の生物学的役割を十分に理解するために、細胞分解能における遺伝子発現パターンの調査は大きな関心事である。非モデル生物シプンクルスヌドゥスでは、遺伝子発現パターンを検出する理想的な方法であるISH法はまだ確立されていない。その血中流体は、顆粒球、骨壷細胞、胞子細胞、生殖細胞、赤血球、11など、いくつかの細胞タイプを含む。この方法において代表的な遺伝子として用いられる二重性/mab-3関連転写因子-1(dmrt1)は、無脊椎動物から哺乳類12、13,13に至るまでのほとんどの種において性決定および分化の高度に保存された転写調節因子である。種の範囲で(すなわち、黒いポーギー、等)14 14、dmrt1はセルトリ細胞で発現し、胚細胞を取り囲み、その機能はシプンクルスヌドゥスの栄養芽細胞に類似している。そこで、シプンキュラス・ヌドゥスのdmrt1が精子の栄養芽細胞で発現すると仮定し、かつ、この仮説を明確に確認した。
このプロトコルは、初めて、イシュ、ジゴキシゲニン標識アンチセンス/センスmRNAプローブを用いて、その血中流体スミア中のmRNA発現パターンを決定する記述する。最適な反応条件が提供され、高分解能でmRNA発現を非常に敏感に可視化できます。開発されたISH法は、シプンクルスヌドゥス以外のより多くのシプンキュラ種に適用される可能性がある。
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Protocol
動物の手順は、華橋大学の動物ケアと福祉委員会によって承認されました.
1. リボプローブ製剤
- プライマーデザイン
- プログラムのプライマー 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) を開きます。dmrt1シーケンス (GenBank: MK182259) をシーケンス・ウィンドウにコピーします。
- プライマー長(23~25bp)、融解温度(55~60°C)、G/C含有量(40~60%)を設定します。[プライマーを選択]をクリックします。
注: RNA プローブに必要な最小サイズは約 500 bp です。 - T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列(5,-TAATACGACTACTATAGGG-3)を,選択したプライマーの1つに加えます。 ISH のdmrt1プライマーシーケンスを表 1に示します。
注:センスプローブの場合、T7 RNAポリメラーゼプロモーターは、フォワードプライマーの5'末端に位置しています。アンチセンスプローブの場合、T7 RNAポリメラーゼプロモーターは逆プライマーの5'末端に位置しています。
- PCR 増幅
- マイクロフュージチューブを氷の上に置き、次の反応ミックス(50 μL反応用)を調製します:1x Taq DNAポリメラーゼミックス、1 μgのcDNA(100 μLのコエロミック流体から調製)、1 μMフォワードプライマー、1 μMリバースプライマーおよびヌクレアーゼフリー水。
- ピペットと遠心分離機でPCR反応を簡単に混ぜます。
- 反応チューブをサーマルサイクラーに入れ、95°Cで95°Cで最初の変性を2分間実行し、30sで95°Cで36サイクル、30sで55-60°Cでアニーリングし、72°Cで延長して70min72°Cで延長します。
注: アニーリング温度はプライマーに従って最適化する必要があります。
- PCR製品の精製と検証
- 50 μL の PCR 混合物を 1% アガロースゲルに直接ロードします。アガロースゲルを150-180 Vで0.5x TBEで10分間実行します。1%アガロースゲルから特異的なDNA断片を分離する。
注:DNAは、スミアとしてではなく、単一のバンドとして表示される必要があります。 - メーカーのプロトコルに従ってゲル抽出キットを使用してDNA断片を精製します。260nmの波長で分光光度法により精製物を定量化します。
- シーケンシングにより PCR 産物の信頼性を検証します。
注:(一時停止点)精製PCR製品は、数ヶ月間-20°Cで保存することができます。
- 50 μL の PCR 混合物を 1% アガロースゲルに直接ロードします。アガロースゲルを150-180 Vで0.5x TBEで10分間実行します。1%アガロースゲルから特異的なDNA断片を分離する。
- リボプローブ合成
- RNaseフリーマイクロフュージチューブを氷の上に置き、マイクロフュージチューブに次の(10 μL反応用)を加えます:1x Digoxygenin RNAラベリングミックス、1x転写緩衝液、0.5μLのRNase阻害剤、T7 RNAポリメラーゼ1 μL、PCR産物1μgおよびRNaseフリーウォーター。ピペットと遠心分離機で反応を簡単に混ぜます。37°Cで2時間インキュベートする。
- 2 μLのRNaseフリーDNase Iを加え、ピペットと遠心分離機で反応を簡単に混ぜます。37°Cで15分間インキュベートします。
- 2 μL 0.2 M EDTA (pH 8.0) を加えます。ピペットと遠心分離機で反応を簡単に混ぜます。
- 上記の反応に、4 M LiClの2.5 μLとプレチルエタノール75μLを加えます。よく混ぜます。-70°Cで30分間放置します。
- 遠心分離機 12,000 x gで 4 °C で 10 分間エタノールをデカントします。1 mLのプレチル70%エタノール(v/v)を加え、穏やかに混ぜて沈殿物を洗います。
- 遠心分離機 12,000 x gで 5 分 4 °C.70%エタノールをデカントし、アルコールランプの近くで沈殿物を短時間乾燥させます。30μLのRNaseフリー水を加えて沈殿を溶かし、軽く混ぜます。
- 合成したRNAを2μLの1%アガロースゲルにロードします。アガロースゲルを180 Vで5~10分間0.5倍TBEで実行します。分光光度計を用いて260nmの波長で標識したRNAの濃度を測定します。
- RNaseの汚染を避けるためにRNaseフリーマイクロフュージチューブとフィルターチップを使用してください。
注:(一時停止点)ジゲオキシジン標識プローブは、数ヶ月間-70°Cで保存することができます。
- RNaseの汚染を避けるためにRNaseフリーマイクロフュージチューブとフィルターチップを使用してください。
2. コエロミック流体収集
- 解剖テーブルのS.ヌダスをピンで固定します。小さなオートクレーブハサミでS.ヌーダスの体を開きます。ピペットでコエロミック流体を分離します。
- ポリD-リジン処理顕微鏡スライドにピペットを用いて1 mLのコエロミック流体を収集し、転送します。ピペットチップでコエロミック流体を均等に塗布します。スライドを37°Cで1時間エアドライします。
3. その中でのハイブリダイゼーション
- 1日目
- 1xジエチルピロカーボネートの100 mLを含むスライド染色瓶中のスライドを水分補給し、リン酸緩衝生理食塩水(DEPC-PBS)を処理した。1x DEPC-PBSで3回水分補給し、穏やかな攪拌で1回の洗浄につき5分。
- 室温で10μg/mLプロテイナーゼKで消化して5分間、コエロメミック流体の塗抹を透過し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)でスライドを20分間インキュベートして消化を止めます。1x DEPC-PBSでスライドを5分間3回穏やかな攪拌で洗浄します。
- センス/アンチセンスリボプローブを含むハイブリダイゼーションミックス(HM)50 μLをスライドに追加し、カバースリップを追加します。
- ウェットボックスにウェットボックスバッファを追加します。スライドを濡れた箱に入れ、パラフィンフィルムでよく密封します。60°Cで一晩(少なくとも16時間)ハイブリダイズする。
- 2日目
- 洗浄バッファーを 65 °C で予熱します。洗浄バッファーを含むスライド染色瓶にスライドを浸し、カバースリップが自動的に滑り落ちるまで立たせます。所要時間は約5分です。
- 65°Cの洗浄バッファーで2回洗浄し、1回の洗浄につき30分を穏やかな攪拌で洗浄します。65°Cで0.2倍の生理食塩水ナトリウム(SSC)で2回洗浄し、1回30分を穏やかな攪拌で洗浄します。室温でTween 20(MABT)を含むマレイン酸緩衝液で2回洗浄し、1回の洗浄につき30分を穏やかな攪拌で洗浄します。
- ブロッキングバッファー内で3~4時間、室温でスライドをインキュベートします。1 mL抗ジゴキシゲニン-AP Fabフラグメント溶液でスライドをインキュベートし、ブロッキングバッファーを一晩4°Cで1/5000で希釈します。
- 3日目
- 抗体溶液を取り除き、MABTでスライドを短時間洗います。室温でMABTで4回洗浄し、1回25分を穏やかな攪拌で洗浄します。
- 室温3回、洗浄1回5分でアルカリホスファターゼバッファーでスライドをインキュベートします。アルカリホスファターゼバッファーを取り出し、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)/ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)染色液を1 mL加えます。スライドを暗闇の中に保管してください。
- 光学顕微鏡で定期的に色反応を観察します。色が完全に発達したら(反応時間は1〜4時間)、スライドを室温でMABTで2回、穏やかな攪拌で洗浄1回5分洗浄します。
- 室温で停止液で2回洗浄し、15分の洗浄で穏やかな攪拌を行います。余分な汚れを除去するために、30分間室温でスライドをインキュベートします。背景色によれば、メタノール洗浄は2回又は3回行い、脱色時間を延長することができる。
- 室温で2回MABTで洗浄し、1回で5分、穏やかな攪拌で洗浄します。スライドを新しいフィルター用紙に転送します。グリセロールを50μL加えます。カバーリップを追加し、顕微鏡で観察します。
注: ソリューションの構成は表 2に示されています。
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Representative Results
ISH に関連する手順の概要を図 1に示します。dmrt1用のアンチセンスおよび対応するセンスリボプローブを、コエロミック流体cDNAから増幅したPCR産物から合成した。PCR産物の真正性は、直接シーケンシングによって検証された。リボプローブは、メーカーのプロトコルに従ってT7 RNAポリメラーゼを用いて合成し、以前のレポート4を若干の変更を加えた。ISHの代表的なシグナルを図2に示します。dmrt1を標的とするアンチセンスリボプローブを有するシプンキュラスヌドゥスコエロミック流体のISHは、精子の栄養芽細胞に濃縮された紫色の染色を明らかにする(図2A、B、赤矢印)。センスリボプローブを陰性対照として用い、dmrt1用のセンスリボプローブはハイブリダイゼーション信号を検出しなかった(図2C)。
図 1.ISHのフロー図。青い箱は、リボプローブを合成するためのステップです。ライトグリーンのボックスは、その段階の手順です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.ISHによって検出されたシプンキュラス・ヌドゥス・コエロミック流体におけるdmrt1の発現(A, B)dmrt1アンチセンス リボプローブによるハイブリダイゼーション。(C) dmrt1センスリボプローブによるハイブリダイゼーション。赤い矢印は、トロフォブラスト細胞のハイブリダイゼーション信号を表します。sz,精子ゼウグマタ。スケールバー:50 μm。この図はLiら15から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | シーケンス(5′-3′) |
| アンチプローブF | アカートタグカッググッタクトクトッグ |
| アンチプローブR | タータカパクチャタタグガガクトクトクトクトクトクトGCATカプタグター |
| センスプローブF | タータカプラクタタタグガガガガガガタグタグッタクトクトクトッグ |
| センスプローブR | CTGTTTCTCTATGCATATAGTAA |
表 1.dmrt1プライマー シーケンス。
| 試薬 | 組成 |
| 5 × TBE (1 L) | トリスの54グラム、ホウ酸27.5g、0.5 M EDTA(pH 8.0)を20 mL。 |
| 10×PBS(5L) | NaClの400g、KClの10g、KH2PO4のNa2HPO4および12gの472g。 |
| デプ・PBS (1 L) | 1Lの1×PBSおよび1 mL DEPC。 |
| 4% PFA 1×PBS (100 mL、pH 7.4) | PFAの4gおよび100 mL PBS。 |
| 10 mg/mL プロテイナーゼ K (1 mL) | 10 プロテイナーゼ K の mg. |
| 20×SSC(1L) | NaClの175.3gおよび88.2gのクエン酸三ナトリウム塩。 |
| ウェットボックスバッファ(50mL) | 20×SSCの2.5mL、RNaseフリーウォーター22.5mL、脱イオンホルムアミド25mL。 |
| ハイブリダイゼーションミックス(HM、200mL) | 100 mLの脱イオン化ホルムアミド、50 mLの20×SSC、10mgのヘパリン、100mgのtRNA、0.39gのクエン酸、200μLのTween-20およびRNaseフリー水200mLに。 |
| 洗浄バッファー (1 L) | 50 mL 20×SSC、500 mLの脱イオン化ホルムアミド、450 mLの無菌水および1 mL Tween-20。 |
| MABT (1 L) | マレイン酸11.6g、NaCl8.77g、NaOHの8.25g、1 mL Tween-20。 |
| ブロッキング バッファ | 1 ×MABT、2%の羊血清(vol/vol)および2mg/ mL BSA。 |
| アルカリホスファターゼバッファー | 100 mM NaCl、100 mM トリス HCl (pH 9.5)、50 mM MgCl2、および 0.1% トゥイーン 20 (vol/vol)。 |
| ソリューションを停止する | 0.1 Mグリシン、pH 2.2. |
表 2.ISH プロトコルで使用されるソリューションの構成。
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Discussion
これまでの研究では、ISHは複数の標的RNA16、17、18,17,18を検出するのに適している。本プロトコルでは、血中流体中のmRNAを検出する高分解能のISH法を説明し、Sipunculus nudusの最適化されたハイブリダイゼーション条件を強調した。我々が観察したdmrt1の明らかなシグナルは、遺伝子発現の検出においてこのプロトコルの応用が成功したことを示した(図2)。
実験中、一連のステップは特に注意を払う必要があります。まず、標的遺伝子のセンスリボプローブをコントロールとして合成する必要があります。合成後、リボプローブの品質はゲルでチェックする必要があります。RNAの合成が不十分な場合、セクションに染色は発生しません。第二に、サンプル採取プロセスは細胞の変形を防ぐために穏やかにする必要があり、実験はRNAの分解を防ぐために、血中流体採取の直後に行われなければなりません。第三に、インキュベーションの時間と時間は、短縮または延長することなく、すべてのステップで正確に従う必要があります。特に、プロテナーゼK治療のタイミングに注意を払う。プロテイナーゼKの処理時間が長すぎると、サンプルの細胞構造が破壊され、処理時間が短すぎるとリボプローブが細胞に適切に入り込むのができません。最後に、実験中にスライドが乾燥しないようにします。この方法は、試薬の蒸発のリスクを高める60°Cでのハイブリダイゼーションステップを伴います。プロトコルセクションで述べたように、スライドは濡れた箱に入れ、蒸発を避けるためにパラフィンフィルムで覆われなければなりません。
このプロトコルの1つの制限は、非モデル生物シプンクルスヌドゥスにおけるリボプローブ配列の獲得であり、不十分な配列のmRNAがリボプローブの低特異性を与える可能性があるためである。シーケンシング技術の開発に伴い、Sipunculusヌドゥスの高品質なシーケンスがますますリリースされ、この状況が大幅に改善されます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(グラント31801034)、中国福建省自然科学財団(2016J01161)、華橋大学科学研究基金(15BS306)、大学院生の華橋大学の革新的な科学研究基金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
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