Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen effektiven In-situ-Hybridisierungsansatz, um die mRNA-Expressionsniveaus und räumlichen Muster von Zielgenen in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu erkennen.
Abstract
Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine sehr informative Technik, um zelluläre Verteilungsmuster bestimmter Gene (z. B. mRNA und ncRNA) in Geweben darzustellen. Der Sipunculid-Wurm Sipunculus nudus ist eine wichtige Fischereiressource, da er hohe nährwert- und medizinische Werte hat. Derzeit steckt die Erforschung der Molekularbiologie von Sipunculus nudus noch in den Kinderschuhen. Der Zweck dieses Artikels ist es, eine empfindliche Methode zur Lokalisierung spezifischer mRNA in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu entwickeln. Das Protokoll enthält detaillierte Schritte der ISH, einschließlich Digoxigenin-markierter Antisense- und Sense-Riboprobe-Vorbereitung, coelomischer Flüssigkeitssammlung und Abschnittsvorbereitung, spezifischer Riboprobe-Hybridisierung, Antikörperinkubation, Färbung und Nachfärbungsbehandlungen. Die repräsentativen Ergebnisse eines erfolgreichen Experiments mit dieser Methode werden demonstriert. Das Protokoll sollte auch für andere Sipuncula-Arten gelten.
Introduction
Die ISH ist mit Hilfe einer markierten Nukleinsäuresonde, um die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz von Interesse zu erkennen, eine nützliche Methode, um das räumliche Expressionsmuster von Zielgenen in morphologisch konservierten Geweben1,2,3zu beschreiben. Normalerweise wird die Zielsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt und dann als Vorlage zur Synthese der antisense/sense RNA-Sonde mit Digoxigenin-Uridin-5'-Triphosphat verwendet. Die Proben werden vor der Inkubation mit Riboprobe fixiert und permeabilisiert. Nach dem Abwaschen der überschüssigen Sonde wird die Hybridisierung durch Immunhistochemie mit einem Anti-Digoxygenin-Antikörper visualisiert, der alkalische Phosphatase-konjugierte3,4,5,6ist.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; Ordnung Sipunculida: Sipunculidae) ist ein unsegmentierter, koeloatischer und bilateral symmetrischer Meereswurm7,8. Sipunculus nudus ist eine kosmopolitische Art, die in tropischen und gemäßigten Küstengewässern verbreitet ist. Es ist auch eine wichtige Meeresfischerei Ressource in Südchina wegen seiner hohen Nährwert und medizinische Werte9,10. Sipunculus nudus in der Molekularbiologie steckt jedoch noch in den Kinderschuhen. Um die biologische Rolle von Genen vollständig zu verstehen, ist die Untersuchung von Genexpressionsmustern bei einer zellulären Auflösung von großem Interesse. Im Nichtmodellorganismus Sipunculus nudusist die ISH-Methode, die eine ideale Methode zum Nachweis der Genexpressionsmuster ist, noch nicht etabliert. Seine koelomische Flüssigkeit enthält mehrere Zelltypen, einschließlich Granulozyten, Urnenzellen, vesikuläre Zellen, Keimzellen, Erythrozyten, etc11. Der Doppelsex/mab-3-bezogene Transkriptionsfaktor-1 (dmrt1), der als repräsentatives Gen bei dieser Methode verwendet wird, ist ein hochkonservierter Transkriptionsregulator für die Geschlechtsbestimmung und -differenzierung bei den meisten Arten, die von Wirbellosen bis zu Säugetieren reichen12,13. In einer Reihe von Arten (z. B. schwarze Porgie, etc.) 14, dmrt1 wurde in den Sertoli-Zellen ausgedrückt, die die Keimzellen umgeben, deren Funktion den Trophoblastenzellen von Sipunculus nudusähnelt. Daher vermuteten wir, dass dmrt1 von Sipunculus nudus in Trophoblastenzellen von Spermatozeugmata exprimiert wird, und das Ergebnis der ISH-Methode bestätigte eindeutig die Hypothese.
Dieses Protokoll beschreibt zum ersten Mal die ISH mit digoxigenin-markierten Antisense/Sense mRNA-Sonden, um mRNA-Expressionsmuster in ihrem coelomischen Flüssigkeitsabstrich zu bestimmen. Es werden optimale Reaktionsbedingungen bereitgestellt, die eine sehr empfindliche Visualisierung der mRNA-Expression bei hoher Auflösung ermöglichen. Die entwickelte ISH-Methode könnte möglicherweise bei mehr Sipunculida-Arten außer Sipunculus nudus angewendet werden.
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Protocol
Das Tierverfahren wurde vom Animal Care and Welfare Committee der Huaqiao University genehmigt.
1. Riboprobe Vorbereitung
- Primer-Design
- Öffnen Sie das Programm Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopieren Sie die dmrt1-Sequenz (GenBank: MK182259) in das Sequenzfenster.
- Grundierungslänge (23-25 bp), Schmelztemperatur (55-60 °C) und G/C-Gehalt (40-60%). Klicken Sie auf Primer auswählen.
HINWEIS: Die für die RNA-Sonde erforderliche Mindestgröße beträgt ca. 500 bp. Längere Sonden haben normalerweise eine höhere Spezifität. - Fügen Sie die T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) zu einem der ausgewählten Primer hinzu. Die dmrt1 Primersequenzen für ISH sind in Tabelle 1dargestellt.
HINWEIS: Bei Sinnessonden befindet sich der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende der Vorwärtsprimer. Bei Antisense-Sonden befindet sich der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende der Reverse-Primer.
- PCR-Verstärkung
- Legen Sie die Mikrofugenrohre auf Eis und bereiten Sie den folgenden Reaktionsmix vor (für eine 50-L-Reaktion): 1x Taq-DNA-Polymerase-Mix, 1 g cDNA (die aus 100 l coelomischer Flüssigkeit hergestellt wird), 1 'M Vorwärtsprimer, 1 'M Reverse Primer und nukleasefreies Wasser.
- Mischen Sie die PCR-Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz.
- Legen Sie das Reaktionsrohr in einen thermischen Cycler und führen Sie die PCR unter folgenden Bedingungen aus: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 min, gefolgt von 36 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 55-60 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 30 s und Endverlängerung bei 72 °C für 7 min.
HINWEIS: Die Glühtemperatur sollte entsprechend den Primern optimiert werden.
- PCR-Produktreinigung und -verifizierung
- Laden Sie die 50 l PCR-Mischung direkt auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 150-180 V für 10 min in 0.5x TBE. Isolieren Sie die spezifischen DNA-Fragmente aus dem 1% Agarose-Gel.
HINWEIS: DNA sollte als einzelnes Band und nicht als Abstrich erscheinen. - Reinigen Sie die DNA-Fragmente mit einem Gel-Extraktions-Kit gemäß dem Herstellerprotokoll. Quantifizieren Sie die gereinigten Produkte durch Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 260 nm.
- Überprüfen Sie die Authentizität der PCR-Produkte durch Sequenzierung.
HINWEIS: (Pausepunkt) Die gereinigten PCR-Produkte können mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
- Laden Sie die 50 l PCR-Mischung direkt auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 150-180 V für 10 min in 0.5x TBE. Isolieren Sie die spezifischen DNA-Fragmente aus dem 1% Agarose-Gel.
- Riboprobe-Synthese
- Legen Sie die RNase-freien Mikrofuge-Röhren auf Eis und fügen Sie dem Mikrofugenrohr Folgendes hinzu (für eine 10-L-Reaktion): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x Transkriptionspuffer, 0,5 l RNase-Inhibitoren, 1 L T7-RNA-Polymerasen, 1 g PCR-Produkt und RNase-freies Wasser. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz. 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Fügen Sie 2 L RNase-freie DNase I hinzu. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz. 15 min bei 37 °C inkubieren.
- Fügen Sie 2 L 0,2 M EDTA (pH 8,0) hinzu. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz.
- Fügen Sie der obigen Reaktion 2,5 l 4 M LiCl und 75 l vorgekühltes Ethanol hinzu. Gut mischen. 30 min bei -70 °C lassen.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Decant das Ethanol. 1 ml vorgekühltes 70% Ethanol (v/v) hinzufügen und den Niederschlag durch sanftes Mischen waschen.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C. Das 70% Ethanol dekantieren und den Niederschlag kurz in der Nähe einer Alkohollampe trocknen. Lösen Sie den Niederschlag auf, indem Sie 30 l RNase-freies Wasser hinzufügen und sanft mischen.
- Laden Sie 2 l synthetisierte RNA auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 180 V für 5-10 min in 0.5x TBE. Messen Sie die Konzentration der beschrifteten RNA mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm.
- Verwenden Sie RNase-freie Mikrofugenrohre und Filterspitzen, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden.
HINWEIS: (Pausepunkt) Die mit Digoxygenin beschrifteten Sonden können mehrere Monate bei -70 °C gelagert werden.
- Verwenden Sie RNase-freie Mikrofugenrohre und Filterspitzen, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden.
2. Coelomic Flüssigkeitssammlung
- Fixieren Sie den S. nudus auf dem Seziertisch mit Stiften. Öffnen Sie den Körper des S. nudus mit einer kleinen autoklaven Schere. Isolieren Sie die coelomische Flüssigkeit mit einer Pipette.
- Sammeln und übertragen Sie 1 ml coelomische Flüssigkeit mit einer Pipette auf poly-D-Lysin behandelte Mikroskopschlitten. Tragen Sie die coelomische Flüssigkeit gleichmäßig mit einer Pipettenspitze auf. Die Schlitten 1 h bei 37 °C lufttrocknen.
3. In-situ-Hybridisierung
- Tag 1
- Rehydrieren Sie die Dias in einem Dia-Färbeglas mit 100 ml 1x diethylpyrocarbonat behandelter Phosphat gepufferter Saline (DEPC-PBS). 3 mal mit 1x DEPC-PBS rehydrieren, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
- Permeabilisieren Sie den Abstrich von coelomischer Flüssigkeit durch Verdauung mit 10 g/mL-Proteinase K bei Raumtemperatur für 5 min. Inkubieren Sie die Dias in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min, um die Verdauung zu stoppen. Waschen Sie die Dias in 1x DEPC-PBS mit sanfter Rührung für 5 min 3 mal.
- Fügen Sie 50 l Hybridisierungsmix (HM) mit der Sense/Antisense-Riboprobe auf den Dias hinzu und fügen Sie einen Deckbedeckungsschlupf hinzu.
- Fügen Sie den Nasskastenpuffer in die Nassbox ein. Die Dias in die Nassbox stecken und mit Paraffinfolie gut versiegeln. Über Nacht (mindestens 16 h) bei 60 °C hybridisieren.
- Tag 2
- Den Waschpuffer bei 65 °C vorheizen. Tauchen Sie die Folie in das Gleitfärbeglasmitglas ein, das den Waschpuffer enthält, und lassen Sie ihn stehen, bis der Deckelrutsch automatisch abrutscht. Es dauert ca. 5 min.
- 2 Mal mit Waschpuffer bei 65 °C waschen, 30 min pro Waschgang mit sanfter Rührung. 2 Mal mit 0,2x Saline-Natriumcitrat (SSC) bei 65 °C waschen, 30 min pro Wäsche mit sanfter Rührung. 2 Mal mit Maleinsäurepuffer mit Tween 20 (MABT) bei Raumtemperatur waschen, 30 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
- Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für 3-4 h im Sperrpuffer. Inkubieren Sie die Dias in 1 ml Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmentlösung bei 1/5000 mit dem Sperrpuffer bei 4 °C über Nacht verdünnt.
- Tag 3
- Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Dias kurz in MABT. 4 Mal mit MABT bei Raumtemperatur waschen, 25 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
- Inkubieren Sie die Dias mit alkalischen Phosphatasepuffer bei Raumtemperatur 3 mal, 5 min pro Wäsche. Entfernen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer und fügen Sie 1 ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP)/Nitroblautetrazolium (NBT) Färbelösung hinzu. Halten Sie die Dias im Dunkeln.
- Beobachten Sie die Farbreaktion periodisch unter einem optischen Mikroskop. Wenn die Farbe vollständig entwickelt ist (Reaktionszeit im Bereich von 1-4 h), waschen Sie die Dias 2 mal mit MABT bei Raumtemperatur, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
- 2 Mal mit Stop-Lösung bei Raumtemperatur waschen, 15 min pro Waschgang mit sanfter Rührung. Inkubieren Sie die Dias in Methanol, um überschüssige Flecken zu entfernen, bei Raumtemperatur für 30 min. Je nach Hintergrundfarbe kann die Methanolwäsche 2 oder 3 Mal durchgeführt und die Entfärbungszeit verlängert werden.
- 2 Mal mit MABT bei Raumtemperatur waschen, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung. Übertragen Sie die Dias auf ein frisches Filterpapier. Fügen Sie 50 l Glycerin hinzu. Fügen Sie die Abdeckungen hinzu und beobachten Sie mikroskopisch.
HINWEIS: Die Lösungszusammensetzung ist in Tabelle 2dargestellt.
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Representative Results
Abbildung 1ist eine Zusammenfassung der Schritte der ISH dargestellt. Antisense und entsprechende Sense-Ribosonden für dmrt1 wurden aus PCR-Produkten synthetisiert, die aus der coelomischen Flüssigkeit cDNAs verstärkt wurden. Die Echtheit der PCR-Produkte wurde durch direkte Sequenzierung überprüft. Riboprobes wurden mit T7-RNA-Polymerasen nach den Protokollen des Herstellers und einem früheren Bericht4 mit einigen geringfügigen Modifikationen synthetisiert. Die repräsentativen Signale der ISH sind in Abbildung 2dargestellt. ISH von Sipunculus nudus coelomic Fluid mit Antisense Riboprobe, die dmrt1 zielt zeigt lila Färbung konzentriert in Trophoblastzellen der Spermatozeugmata(Abbildung 2A, B,rote Pfeile). Eine Sense-Riboprobe wurde als Negativkontrolle verwendet, und die Sense-Riboprobe für dmrt1 erkannte kein Hybridisierungssignal (Abbildung 2C).
Abbildung 1. Flussdiagramm der ISH. Blaue Boxen sind die Schritte zur Synthese von Riboprobe. Hellgrüne Boxen sind Schritte für In-situ-Verfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Die Expression von dmrt1 in Sipunculus nudus coelomic Fluid von ISH nachgewiesen. (A, B) Hybridisierung mit dmrt1 Antisense-Riboprobe. (C) Hybridisierung mit dmrt1 Sinn Riboprobe. Die roten Pfeile stellen Hybridisierungssignale in Trophoblastzellen dar. sz, spermatozeugmata. Maßstabsleiste: 50 m. Diese Zahl wurde von Li et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Namen | Sequenz (5-3€) |
| Anti-Probe F | ACAATGTAGCAGGTTAATCTTGG |
| Anti-Probe R | TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTTTCTCTATGCATCCAGTAA |
| Sense-Sonde F | TAATACGACTActATAGGGAGAACAATGTAGCAGGTTTTTTAATCTTGG |
| Sense-Probe R | CTGTTTTCTCTATGCATCCAGTAA |
Tabelle 1. Die dmrt1 Primersequenzen.
| Reagenz | Zusammensetzung |
| 5 x TBE (1 L) | 54 g Tris, 27,5 g Borsäure und 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). |
| 10 x PBS (5 l) | 400 g NaCl, 10 g KCl, 72 g Na2HPO4 und 12 g KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 L von 1 x PBS und 1 ml DEPC. |
| 4% PFA in 1 x PBS (100 ml, pH 7,4) | 4 g PFA und 100 ml PBS. |
| 10 mg/ml Proteinase K (1 ml) | 10 mg Proteinase K. |
| 20 x SSC (1 L) | 175,3 g NaCl und 88,2 g Zitronensäuretrinatriumsalz. |
| Nasskastenpuffer (50 ml) | 2,5 ml mit 20 x SSC, 22,5 ml RNase-freies Wasser und 25 ml deionisiertem Formamid. |
| Hybridisierungsmix (HM, 200 ml) | 100 ml deionisiertes Formamid, 50 ml mit 20 x SSC, 10 mg Heparin, 100 mg tRNA, 0,39 g Zitronensäure, 200 l Tween-20 und RNase freies Wasser bis 200 ml. |
| Waschpuffer (1 L) | 50 ml mit 20 x SSC, 500 ml entionisiertem Formamid, 450 ml sterilem Wasser und 1 ml Tween-20. |
| MABT (1 L) | 11,6 g Maleinsäure, 8,77 g NaCl, 8,25 g NaOH und 1 ml Tween-20. |
| Blockierpuffer | 1 x MABT, 2% Schafserum (vol/vol) und 2 mg/ml BSA. |
| Alkalischer Phosphatasepuffer | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl (pH 9,5), 50 mM MgCl2und 0,1% Tween 20 (vol/vol). |
| Stop-Lösung | 0,1 M Glycin, pH 2,2. |
Tabelle 2. Die Zusammensetzung der im ISH-Protokoll verwendeten Lösungen.
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Discussion
Frühere Studien zeigten, dass ISH zum Nachweis mehrerer Ziel-RNAs16,17,18geeignet ist. In diesem Protokoll haben wir eine hochauflösende ISH-Methode beschrieben, um die mRNA in coelomischer Flüssigkeit zu detektieren und die optimierten Hybridisierungsbedingungen in Sipunculus nudus hervorzuheben. Die offensichtlichen Signale von dmrt1, die wir beobachteten, zeigten die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls beim Nachweis der Genexpression (Abbildung 2).
Während des Experiments muss einer Reihe von Schritten besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Erstens müssen Sinnesribosonden für die Zielgene als Kontrolle synthetisiert werden. Nach der Synthese sollte die Qualität der Riboprobe auf einem Gel überprüft werden. Schlechte RNA-Synthese führt zu keiner Färbung in den Abschnitten. Zweitens sollte der Probenentnahmeprozess schonend sein, um eine Zellverformung zu verhindern, und das Experiment muss unmittelbar nach der koelomischen Flüssigkeitssammlung durchgeführt werden, um den RNA-Abbau zu verhindern. Drittens sollten in allen Schritten in kubisieren dein kubisieren, ohne dass die Zeit verkürzt oder verlängert wird. Achten Sie insbesondere auf den Zeitpunkt der Proteinase-K-Behandlung. Eine zu lange Behandlungszeit der Proteinase K führt zur Zerstörung der Zellstruktur der Probe, während eine zu kurze Behandlungszeit es der Riboprobe nicht erlaubt, richtig in die Zelle einzudringen. Schließlich sollten Die Dias während des Experiments nicht austrocknen. Diese Methode beinhaltet einen Hybridisierungsschritt bei 60 °C, der das Risiko der Reagenzienverdampfung erhöht. Wie im Protokollabschnitt angegeben, müssen Dias in eine Nassbox gesteckt und mit Paraffinfolie überzogen werden, um Verdunstung zu vermeiden.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Erfassung von Riboprobesequenzen im Nichtmodellorganismus Sipunculus nudus, da schlecht sequenzierte mRNA eine geringe Spezifität der Riboprobe verleihen kann. Mit der Entwicklung der Sequenzierungstechnologie werden immer mehr hochwertige Sequenzen von Sipunculus nudus veröffentlicht, was diese Situation erheblich verbessern wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Young Scientists Fund der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), der Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J01161), den Scientific Research Funds der Huaqiao University (15BS306) und dem Innovative Fund in Scientific Research der Huaqiao University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
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