Summary
פרוטוקול זה מתאר יעיל באתר היברידיזציה באתרו כדי לזהות את רמות ביטוי mRNA ודפוסי מרחבית של גנים היעד בנוזל הסיפונקולוס nuomic .
Abstract
באתרו היברידיזציה (ISH) היא טכניקה מאוד אינפורמטיבי להציג דפוסי הפצה תאית של גנים ספציפיים (g., mRNA ו ncRNA) ברקמות. התולעת הסיפנעית מהווה משאב-דיג מכריע, שכן הוא בעל ערכי תזונה ומרפא גבוהים. כיום, המחקר על הביולוגיה המולקולרית של סיפונקולוס נודוס עדיין בחיתוליו. מטרת מאמר זה היא לפתח שיטה רגישה לאיתור mRNA מסוים בנוזל הסיפונקולוס nudus . הפרוטוקול כולל צעדים מפורטים של ISH, כולל digoxigenin-התווית אנטי הגיוני הכנה החלקה, לאסוף נוזלים קולוממית והכנה מקטע, הכלאה החוצה באופן ספציפי, הדגירה הנוגדן, צבע ושלאחר צבע טיפולים. תוצאות הנציג שהתקבלו מניסוי מוצלח באמצעות שיטה זו מומחש. הפרוטוקול צריך להיות רלוונטי גם. למינים אחרים של האחרים
Introduction
ISH, באמצעות בדיקה חומצה גרעין בתווית כדי לזהות את ה-DNA הספציפי או רצף RNA של עניין, היא שיטה שימושית כדי לתאר את תבנית הביטוי המרחבי של גנים היעד ברקמות שנשמרו מורפולוגית1,2,3. בדרך כלל, רצף היעד מופק על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ולאחר מכן משמש כתבנית כדי לסנתז את antisense/תחושה RNA בדיקה מתויג עם digoxigenin uridine-5'-triphosphate. הדגימות קבועות ומופרחות לפני הדגירה. לאחר שטיפת המקדח עודף, היברידיזציה היא דמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן אנטי digoxygenin, שהוא בסיסי פוספטאז-מצומת3,4,5,6.
סיפונקולוס נודוס (מאכל שמנת; הזמנת סיקולידה: סיפונקולרוב) היא תולעת מחולקת, קומטואט ובקיעים ימית של התולעים7,8. סיפונקולוס נודוס הוא זן קוסמופוליטי המופץ באופן נרחב במימי חוף טרופיים וממוזגים. זהו גם משאב הדיג הימי החשוב בדרום סין בשל ערכי התזונה והמרפא הגבוהים שלה9,10. עם זאת, הסיפונקולוס נודוס בביולוגיה מולקולרית עדיין בחיתוליו. כדי להבין באופן מלא את התפקיד הביולוגי של הגנים, החקירה של ביטויים גנים דפוסי ברזולוציה תאית הוא מעניין מאוד. באורגניזם הלא מודל Sipunculus nudus, השיטה ISH, שהיא שיטה אידיאלית כדי לזהות את דפוסי הביטוי גנים, עדיין לא הוקם. נוזל קולאומית שלו מכיל מספר סוגי תאים, כולל גרנולוציטים, בתאי urn, תאים vesicular תאי הנבט, אריתרופוציטים, וכו '11. מין כפול/mab-3 מקדם התעתיק הקשור-1 (dmrt1), משמש כג מייצג בשיטה זו, הוא מווסת הטרנססקריפט שימור מאוד של קביעת מין ובידול ברוב המינים החל מיצורים חסרי חוליות ליונקים12,13. במגוון מינים (כלומר, פורגיה שחורה וכו ') 14, dmrt1 ביטא בתאי sertoli, סביב התאים נבטי, שתפקידם דומה לתאי הפיצוץ של סיפונקולוס nudus. לכן, אנו שיערו שdmrt1 של הסידקולוס נודוס באה לידי ביטוי בתאי הפיצוץ של spermatozeugmata, והתוצאה של שיטת ISH אישרה בבירור את ההשערה.
פרוטוקול זה בפעם הראשונה מתאר ISH, עם digoxigenin-התווית אנטי sense/תחושה mRNA, כדי לקבוע דפוסי ביטוי mRNA במכתם נוזל קולאומית שלה. תנאי התגובה האופטימליים מסופקים, המאפשרים הדמיה מאוד רגישה של ביטוי mRNA ברזולוציה גבוהה. שיטת ה-ISH המפותחת יכולה להיות מיושמת בעוד מינים של סיפונקולידה מלבד סיפנקולוס נודוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נוהל בעלי החיים אושר על ידי ועדת הבריאות והרווחה של אוניברסיטת Huaqao.
1. הכנה לריבוחלוק
- פריימר עיצוב
- פתח את התוכנית פריימר 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). העתק את רצף dmrt1 (genbank: MK182259) לתוך חלון הרצף.
- הגדר אורך פריימר (23-25 bp), טמפרטורת ההיתוך (55-60 ° c), ו-G/C תוכן (40-60%). לחץ על בחר התחל.
הערה: הגודל המינימלי הנדרש עבור בדיקה RNA הוא כ 500 bp. הבדיקות הארוכות בדרך כלל כוללים ספציפיות יותר. - הוסיפו את רצף המקדם של T7 RNA פולימראז (5, -taאטקg, טטקקאכא2-3,) לאחד מצבעי היסוד שנבחרו. רצפי dmrt1 פריימר עבור ISH מוצגים בטבלה 1.
הערה: לבדיקות הגיוניות, היזם T7 RNA פולימראז ממוקם בקצה של 5 התחל הקדמי. עבור בדיקה נגד היגיון, היזם T7 RNA פולימראז ממוקם ב 5 '-סוף של התחל לאחור.
- הגברה הPCR
- מניחים את הצינורות microfuge על הקרח, ולהכין את תערובת התגובה הבאה (עבור התגובה μL 50): 1x Taq DNA פולימראז לערבב, 1 μg של cDNA (אשר מוכן 100 μL של נוזל קולוממית), 1 μM קדימה פריימר, 1 μM הפוכה פריימר ו nuclease מים ללא.
- מערבבים את תגובת ה-PCR באמצעות ליטוף וצנטריפוגה בקצרה.
- מניחים את צינור התגובה ב ציקלייר תרמית, ולהפעיל את ה-PCR באמצעות התנאים הבאים: דנטורציה הראשונית ב 95 ° c עבור 2 דקות ואחריו 36 מחזורים של דנטורציה ב 95 ° צ' עבור 30 s, ריפוי ב 55-60 ° c עבור 30, הארכה בשעה 72 ° צלזיוס עבור 30 ו הארכה הסופית בשעה 72 °
הערה: טמפרטורת הריפוי צריכה להיות ממוטבת לפי התחל.
- מוצר הטיהור והאימות של מוצרי PCR
- לטעון את 50 μL של התערובת PCR ישירות על 1% agarose ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 150-180 V עבור 10 דקות ב 0.5 x TBE. בודד את קטעי ה-DNA הספציפיים מ 1% הצמח ג'ל.
הערה: הדנ א אמור להופיע כלהקה אחת ולא ככתם. - לטהר את קטעי ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ ג'ל על פי פרוטוקול של היצרן. לכמת את המוצרים מטוהרים ידי ספקטרופוטומטר באורך גל של 260 ננומטר.
- בדוק את אמיתות מוצרי ה-PCR לפי רצף.
הערה: (נקודת השהיה) ניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR המטוהרים ב-20 ° c במשך מספר חודשים.
- לטעון את 50 μL של התערובת PCR ישירות על 1% agarose ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 150-180 V עבור 10 דקות ב 0.5 x TBE. בודד את קטעי ה-DNA הספציפיים מ 1% הצמח ג'ל.
- סינתזה של ריבוגלימה
- מניחים את RNase-microfuge לשחרר את הצינורות על קרח, ולהוסיף את הבאות לצינור microfuge (עבור התגובה 10 μL): 1x Digoxygenin-RNA תיוג שילוב, 1x שעתוק מאגר, 0.5 μL של מעכבי RNase, 1 μL של T7 RNA פולימס, 1 μg של המוצר PCR ערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה. דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
- הוסף 2 μL של RNase-חינם DNase לערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה. דגירה של 15 דקות ב 37 ° c.
- הוסף 2 μL 0.2 M EDTA (pH 8.0). ערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה.
- הוסף 2.5 μL של 4 M LiCl ו 75 μL של אתנול מקורר לתגובה לעיל. . תערבב היטב השאירו 30 דקות ב-70 ° c.
- צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. . מדקלת את האתנול הוסף 1 מ ל של מקורר 70% אתנול (v/v) ולשטוף את המשקעים על ידי ערבוב בעדינות.
- צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. Decant 70% אתנול ויבש את המשקעים בקצרה ליד מנורת אלכוהול. מתמוסס את המשקעים על ידי הוספת 30 μL של מים ללא RNase-חינם ולערבב בעדינות.
- טען 2 μL של רנ א מסונתז על 1% צמח ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 180 V עבור 5-10 דקות ב 0.5 x TBE. למדוד את הריכוז של ה-RNA שכותרתו באמצעות ספקטרוסקופיה באורך גל של 260 ננומטר.
- השימוש RNase-microfuge בחינם צינורות וטיפים מסנן כדי למנוע זיהום RNase.
הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן את הבדיקות המסומנות ב-digoxygenin-70 ° c במשך מספר חודשים.
- השימוש RNase-microfuge בחינם צינורות וטיפים מסנן כדי למנוע זיהום RNase.
2. אוסף נוזלים קולאומית
- . תקן את ס. נודוס על שולחן הניתוח עם סיכות פתח את גופתו של ה . nudus עם מספריים אוטוקליים קטנים. בודד את נוזל קולוממית עם פיפטה.
- לאסוף ולהעביר 1 mL הנוזל קולוממית עם פיפטה כדי פולי-D-ליזין מיקרוסקופ שקופיות. החל את הנוזל הקולאומית באופן שווה עם טיפ פיפטה. מייבשים את השקופיות ב-37 ° c.
3. באתרו היברידיזציה
- היום הראשון
- מימה מחדש את השקופיות בצנצנת מכתים שקופית המכילה 100 mL של מלוחים באגירה מפוספז של 1x דיאתיל פירוקרבונט (depc-PBS). מייבשים 3 פעמים עם 1 x DEPC-PBS, 5 דקות לכל כביסה עם עצבנות עדינה.
- החדירות הכתם של נוזל קולוממית על ידי עיכול עם 10 μg/mL פרוטטינואז K בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. מארג השקופיות ב 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) עבור 20 דקות כדי לעצור את העיכול. שטוף את השקופיות ב-1x-PBS עם עצבנות עדינה למשך 5 דקות 3 פעמים.
- הוסף 50 μL של תערובת היברידיזציה (HM) המכילה את הגלימה של התחושה/החושים על השקופיות והוסף תגית כיסוי.
- הוסף מאגר תיבות רטובות לתוך התיבה הרטובה. שים את השקופיות לתוך הקופסה רטוב לאטום היטב עם סרט פרפין. Hybridize לילה (לפחות 16 h) ב 60 ° c.
- היום השני
- מחממים את מאגר הכביסה ב-65 ° c. הישאב את השקופית לצנצנת המכתים שקופיות המכילה את מאגר הכביסה והעמד אותו עד להצגת השקופיות באופן אוטומטי. . זה לוקח בערך 5 דקות
- רוחצים 2 פעמים עם מאגר כביסה ב 65 ° c, 30 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. רוחצים 2 פעמים עם מלוחים של 0.2 x-נתרן ציטראט ב65 ° c, 30 דקות לכביסה בעצבנות עדינה. שטוף 2 פעמים עם מאגר חומצה מלפימית המכילה את הטמפרטורה 20 (מאבטי) בטמפרטורת החדר, 30 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
- מודיית את השקופיות בטמפרטורת החדר עבור 3 – 4 h במאגר חסימת. מודלת את השקופיות ב-1 mL anti-digoxigenin-AP שברי הפתרון מדולל ב 1/5000 עם מאגר חסימת ב 4 ° c לילה.
- היום השלישי
- הסר את פתרון הנוגדן ושטוף את השקופיות לזמן קצר ב-מאבט. שטפו 4 פעמים עם מאבט בטמפרטורת החדר, 25 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
- מודאת השקופיות עם מאגר פוספספטאז אלקליין בטמפרטורת החדר 3 פעמים, 5 דקות לכביסה. להסיר את מאגר פוספספטאז בסיסי, ולהוסיף 1 מ ל 5-bromo-4-כלורט-3-indolyl פוספט (BCIP)/ניטרו כחול הטטרזויום (NBT) כתמים הפתרון. . שמור את השקופיות בחושך
- שימו לב לתגובת הצבע מידי פעם תחת מיקרוסקופ אופטי. כאשר הצבע מפותח במלואו (זמן התגובה בטווח של 1-4 h), שטוף את השקופיות 2 פעמים עם מייבט בטמפרטורת החדר, 5 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.
- שטוף 2 פעמים עם פתרון הפסקה בטמפרטורת החדר, 15 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. דגירה את השקופיות ב מתנול להסיר כתם עודף, בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. על פי צבע הרקע, שטיפת מתנול יכול להיעשות 2 או 3 פעמים את הזמן decolorization ניתן להאריך.
- שטוף 2 פעמים עם מאבט בטמפרטורת החדר, 5 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. העבר את השקופיות לנייר סינון טרי. הוסף 50 μL של גליצרול. הוסף את הכיסויים ובדוק את המיקרוסקוזה.
הערה: הרכב הפתרון מופיע בטבלה 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סיכום השלבים המעורבים ב-ISH מומחש באיור 1. Antisense ואת התחושה המתאימה riboprobes עבור dmrt1 היו מסונתז מ-PCR מוצרים הוגדל מתוך cdomic נוזלים. האותנטיות של מוצרי ה-PCR אומתה באמצעות רצף ישיר. ריבוגלימות היו מסונתז באמצעות T7 RNA פולימות לפי פרוטוקולי היצרן ודוח קודם4 עם כמה שינויים משניים. האותות הנציגים של ISH מוצגים באיור 2. איש של סיפונקולוס nudus מנוזל קווממית עם הריבוכי מטרות dmrt1 מגלה מכתים סגול מרוכז בתאי trophoblast פיצוץ של הspermatozeugmata (איור 2A, B, חיצים אדומים). תחושה של הגלימה הייתה שימוש כשליטה שלילית, והתחושה הdmrt1 לא איתרה אות הכלאה (איור 2c).
איור 1. דיאגרמת זרימה של ISH. תיבות כחולות הן הצעדים לסינתזה. התיבות הירוקות באור הן צעדים להליכים באתרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
. איור 2 הביטוי של dmrt1 בסיגקולוס נודוס נוזל קולוממית שזוהה על ידי ISH. (א, ב) היברידיזציה עם dmrt1 . מנוגד לחושים (ג) היברידיזציה עם dmrt1 חוש מבשיל. החיצים האדומים מייצגים אותות. היברידיזציה בתאי הפיצוץ ש', spermatozeugmata. סרגל קנה מידה: 50 μm. דמות זו שונתה מ-Li et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | רצף (5 ′-3 ′) |
| אנטי בדיקה F | מיכל ברקת |
| אנטי-בדיקה R | TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTTTCTCTATGCATCCAGTAA |
| היגיון-בדיקה F | מלון הקיסר ב, ברוך הוא |
| היגיון-בדיקה R | CTGTTTTCTCTATGCATCCAGTAA |
. שולחן 1 . הרצפים של dmrt1 פריימר
| ריאגנט | רכב |
| 5 × TBE (1 ל) | 54 g של טריס, 27.5 g של חומצה חומצת ו 20 מ"ל 0.5 M edta (pH 8.0). |
| 10 × PBS (5 ליטר) | 400 g של הנאל, 10 גרם של KCl, 72 g של Na2ההפו4 ו 12 גרם KH2פו4. |
| DEPC-PBS (1 ל) | 1 L של 1 × PBS ו 1 mL DEPC. |
| 4% בכיוון הערוץ ב 1 × PBS (100 mL, pH 7.4) | 4 גר' ו-100 מ ל PBS. |
| 10 מ"ג/mL פרוטטינואז K (1 mL) | 10 מ ג של פרוטטינואז K. |
| 20 × לפני המטה (1 ל) | 175.3 גר' חומצה ציטרית ו88.2 גר' מלח לימון |
| מאגר בתיבה רטובה (50 mL) | 2.5 mL של 20 × למטה, 22.5 מ ל של RNase מים חופשיים ו -25 מ ל של הטופסלפנה. |
| תערובת היברידיזציה (HM, 200 mL) | 100 מ ל של שימוש בטופסונה, 50 mL של 20 × למטה, 10 מ"ג של הפארין, 100 mg של tRNA, 0.39 g של חומצת לימון, 200 μL של רצף-20 ו-RNase מים בחינם כדי 200 mL. |
| שטיפת מאגר (1 ל) | 50 mL של 20 × למטה, 500 מ ל של הטופסיום, 450 מ ל של מים סטריליים ו 1 mL רצף-20. |
| מייבט (1 ל) | 11.6 גרם של חומצה מלפיאית, 8.77 g of הנאמל, 8.25 g של NaOH ו 1 mL ברצף-20. |
| חסימת מאגר | 1 × מאבט, 2% סרום כבשים (vol/vol) ו 2 מ"ג/mL BSA. |
| מאגר פוספספטאז בסיסי | 100 mM הנאקל, 100 mM טריס HCl (pH 9.5), 50 mM MgCl2, ו 0.1% הרצף 20 (vol/vol). |
| הפתרון ' עצור ' | 0.1 M גליצין, pH 2.2. |
. שולחן 2 הרכב הפתרונות המשמשים בפרוטוקול ISH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים קודמים הראו כי איש מתאים לזיהוי מרובים rnas מטרה16,17,18. בפרוטוקול זה, תיארנו שיטת ISH ברזולוציה גבוהה כדי לאתר את ה-mRNA בנוזל הקולאומית ולהדגיש את תנאי הכלאה הממוטבים בסיפונקולוס נודוס. האותות הברורים של dmrt1 הבחנו ביישום מוצלח של פרוטוקול זה בזיהוי של ביטוי גנים (איור 2).
במהלך הניסוי, צריך להעניק לסדרה של צעדים תשומת לב מיוחדת. ראשית, תחושה riboprobes עבור גנים היעד חייב להיות מסונתז כפקד. לאחר הסינתזה יש לבדוק את איכות הגלימה על ג'ל. סינתזה RNA המסכן יגרום ללא כתמים בסעיפים. שנית, תהליך האיסוף לדוגמה צריך להיות עדין כדי למנוע דפורמציה תא והניסוי חייב להתבצע מיד לאחר איסוף נוזל קולוממית כדי למנוע השפלה RNA. שלישית, הדגירה זמן ושעות צריך להיות בדיוק אחריו בכל השלבים ללא קיצור או הארכה. במיוחד, לשים לב לעיתוי של טיפול הפרוטטינואז K. זמן טיפול ארוך מדי של פרוטאינאז K יוביל להשמדת מבנה התא של המדגם, בעוד זמן הטיפול קצר מדי לא יאפשר את הגלימה כדי להיכנס לתא כראוי. לבסוף, אין לייבש את השקופיות במהלך הניסוי. שיטה זו כרוכה בשלב הכלאה ב-60 ° c, אשר יגדיל את הסיכונים של התאיידות מגיב. כאמור בסעיף הפרוטוקול, שקופיות יש לשים לתוך קופסה רטובה מכוסה בסרט פרפין כדי למנוע אידוי.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא רכישת רצפי מעטה באורגניזם שאינו מודל Sipunculus nudus, מכיוון mrna ברצף הגרוע עשוי להעניק ספציפיות של מעטה הגלימה. עם פיתוח טכנולוגיית רצף, רצפים באיכות גבוהה יותר ויותר של Sipunculus nudus ישוחררו, אשר לשפר מאוד את המצב הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי קרן המדענים הצעירים של הארגון הלאומי למדעי הטבע של סין (גרנט No. 31801034), הקרן המדע הטבעי של מחוז פוג'יין, סין (2016J01161), קרנות המחקר המדעי של אוניברסיטת Huaqiao (15BS306) ו פוסט בוגרי הקרן החדשנית מחקר מדעי של אוניברסיטת Huaqao
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A.
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
