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Biology

सिपन्यूकुलस नुडस कोलोमिक फ्लूइड के लिए सीटू संकरण में

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/61022
Automatic Translation
1, 1, 1
1Key Laboratory of Xiamen Marine and Gene Drugs, School of Biomedical Sciences, Huaqiao University

Summary

यह प्रोटोकॉल सिपुकुलस नुडस कॉस्लोमिक द्रव में एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर और लक्ष्य जीन के स्थानिक पैटर्न का पता लगाने के लिए सीटू संकरण दृष्टिकोण में एक प्रभावी का वर्णन करता है।

Abstract

सीटू संकरण (ईश) में ऊतकों में विशिष्ट जीन (जैसे, एमआरएनए और एनसीआरएनए) के सेलुलर वितरण पैटर्न पेश करने के लिए एक बहुत ही जानकारीपूर्ण तकनीक है। सिपन्यूक्यूलिड वर्म सिपन्यूकुलस न्यूडस एक महत्वपूर्ण मत्स्य संसाधन है क्योंकि इसमें उच्च पोषण और औषधीय मूल्य हैं। वर्तमान में, सिपन्यूकुलस नुडस के आणविक जीव विज्ञान पर शोध अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है। इस लेख का उद्देश्य सिपुंगकुलस नुडस कोलोमिक द्रव में विशिष्ट एमआरएनए को स्थानीयकृत करने के लिए एक संवेदनशील विधि विकसित करना है। प्रोटोकॉल में ईश के विस्तृत कदम शामिल हैं, जिनमें डाइगोक्सीजेनिन-लेबल एंटीसेंस और सेंस राइबोप्रोब तैयारी, कॉस्लोमिक फ्लूइड कलेक्शन और सेक्शन तैयारी, विशिष्ट राइबोप्रोब हाइब्रिडाइजेशन, एंटीबॉडी इनक्यूबेशन, कलरेशन और पोस्ट-कलरेशन उपचार शामिल हैं। इस विधि का उपयोग करके एक सफल प्रयोग से प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों का प्रदर्शन किया जाता है। प्रोटोकॉल अन्य सिपकुला प्रजातियों पर भी लागू होना चाहिए।

Introduction

ईश, विशिष्ट डीएनए या ब्याज के आरएनए अनुक्रम का पता लगाने के लिए एक लेबल न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग करना, रूपात्मक रूप से संरक्षित ऊतकों1,2,2,3में लक्ष्य जीन के स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। आम तौर पर, लक्ष्य अनुक्रम बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) द्वारा उत्पन्न होता है, और फिर डिगोक्सिजेनिन उरीडीन-5'-त्रिपोस्फेट के साथ लेबल किए गए एंटीसेंस/सेंस आरएनए जांच को संश्लेषित करने के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है। रिबोप्रोजांच के साथ इनक्यूबेशन से पहले नमूने तय और पार्म्यबिल किए जाते हैं । अतिरिक्त जांच को धोने के बाद, संकरण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा एंटी-डिगऑक्सीजनइन एंटीबॉडी का उपयोग करके कल्पना की जाती है, जो क्षारीय फॉस्फेट-कंजुगेड3,,4,,5,,6है।

सिपन्यूकुलस नुडस (फिलम सिपुंगुला; ऑर्डर सिपुंगकुलाइडा: सिपुंगकुलिडे) एक अखंडित, कोलोमेट और द्विपक्षीय सममित समुद्री कृमि7,,8है । सिपुंगकुलस नुडस एक महानगरीय प्रजाति है जो उष्णकटिबंधीय और शीतोष्ण तटीय जल में व्यापक रूप से वितरित की जाती है। दक्षिणी चीन में यह एक महत्वपूर्ण समुद्री मत्स्य संसाधन भी है क्योंकि इसके उच्च पोषण और औषधीय मूल्य9,10. हालांकि, आणविक जीव विज्ञान में सिपन्यूकुलस नुडस अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है । जीन की जैविक भूमिका को पूरी तरह से समझने के लिए, एक सेलुलर संकल्प पर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच बहुत रुचि है । गैर-मॉडल जीव सिपन्यूकुलस नुडसमें, ईश विधि, जो जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने के लिए एक आदर्श विधि है, अभी तक स्थापित नहीं की गई है। इसके लौकोपिक तरल पदार्थ में कई कोशिका प्रकार होते हैं, जिनमें ग्रैनुलोसाइट्स, कलश कोशिकाएं, वेसिकुलर कोशिकाएं, रोगाणु कोशिकाएं, एरिथ्रोसाइट्स आदिशामिलहैं। इस विधि में प्रतिनिधि जीन के रूप में उपयोग किया जाने वाला डबल सेक्स/एमएबी-3 संबंधित प्रतिलेखन कारक-1(dmrt1),अकशेरुकी से लेकर स्तनधारियों तक की अधिकांश प्रजातियों में लिंग निर्धारण और भेदभाव का एक अत्यधिक संरक्षित प्रतिलेखन नियामक है12,,13। प्रजातियों की एक श्रृंखला में (यानी, काला पोर्गी, आदि) 14, DMrt1 सर्टली कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, अंकुरित कोशिकाओं के आसपास, जिसका कार्य सिपन्यूकुलस नुडसकी ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के समान है । इसलिए, हमने परिकल्पना की कि सिपन्यूकुलस नुडस के डीएमआरटी1 को शुक्राणुओं की ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, और ईश विधि के परिणाम ने स्पष्ट रूप से परिकल्पना की पुष्टि की।

पहली बार के लिए इस प्रोटोकॉल ISH का वर्णन करता है, digoxigenin लेबल एंटीसेंस के साथ/भावना mRNA जांच, अपने लौकिक द्रव धब्बा में mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न निर्धारित करने के लिए । इष्टतम प्रतिक्रिया शर्तों की आपूर्ति की जाती है, जो उच्च संकल्प पर एमआरएनए अभिव्यक्ति के बहुत संवेदनशील दृश्य की अनुमति देते हैं। विकसित ईश विधि को संभावित रूप से सिपन्यूकुलस नुडस के अलावा अधिक सिपुंगलिडा प्रजातियों में लागू किया जा सकता है।

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Protocol

पशु प्रक्रिया को हुआकियाओ विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. रिबोप्रोजांच की तैयारी

  1. प्राइमर डिजाइन
    1. कार्यक्रम प्राइमर 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) खोलें। अनुक्रम खिड़की में dmrt1 अनुक्रम (GenBank: MK182259) कॉपी करें ।
    2. प्राइमर की लंबाई (23-25 बीपी), पिघलने का तापमान (55-60 डिग्री सेल्सियस), और जी/सी कंटेंट (40-60%) सेट करें। क्लिक करें पिक प्राइमर.
      नोट: आरएनए जांच के लिए आवश्यक न्यूनतम आकार लगभग 500 बीपी है। लंबी जांच में सामान्य रूप से अधिक विशिष्टता होती है।
    3. चयनित प्राइमर में से एक में T7 आरएनए पॉलीमरेज प्रमोटर अनुक्रम (5,-TAATACGACTCACTATAGG-3), जोड़ें। , ईश के लिए dmrt1 प्राइमर दृश्यों तालिका 1में दिखाया गया है ।
      नोट: भावना जांच के लिए, T7 आरएनए बहुलक प्रमोटर फॉरवर्ड प्राइमर के 5 ' अंत में स्थित है । एंटीसेंस जांच के लिए, T7 आरएनए बहुलक प्रमोटर रिवर्स प्राइमर के 5'-अंत में स्थित है।
  2. पीसीआर प्रवर्धन
    1. बर्फ पर माइक्रोफ्यूज ट्यूब रखें, और निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें (50 माइक्रोन प्रतिक्रिया के लिए): 1x टैक डीएनए पॉलीमरेज मिश्रण, सीडीएनए का 1 μg (जो कोलोमिक द्रव के 100 माइक्रोन ल से तैयार किया जाता है), 1 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर, 1 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर और न्यूक्लीज-मुक्त पानी।
    2. पीसीआर प्रतिक्रिया को पाइपिंग और सेंट्रलाइज द्वारा संक्षेप में मिलाएं।
    3. प्रतिक्रिया ट्यूब को थर्मल साइकिलर में रखें, और निम्नलिखित परिस्थितियों का उपयोग करके पीसीआर चलाएं: 2 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक निंदा और इसके बाद 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 36 चक्र, 30 एस के लिए 55-60 डिग्री सेल्सियस पर, 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार और 7 00 के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
      नोट: एनेलिंग तापमान को प्राइमर के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  3. पीसीआर उत्पाद शुद्धिकरण और सत्यापन
    1. पीसीआर मिश्रण के 50 माइक्रोन को सीधे 1% अगारोज जेल पर लोड करें। 0.5x TBE में 10 मिन के लिए 150-180 वी पर अगारोज जेल चलाएं। विशिष्ट डीएनए टुकड़ों को 1% अगारोज जेल से अलग करें।
      नोट: डीएनए एक बैंड के रूप में दिखाई देना चाहिए और एक धब्बा के रूप में नहीं ।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए टुकड़ों को शुद्ध करें। 260 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा शुद्ध उत्पादों की मात्रा निर्धारित करें।
    3. अनुक्रमण द्वारा पीसीआर उत्पादों की प्रामाणिकता का सत्यापन करें।
      नोट: (ठहराव बिंदु) शुद्ध पीसीआर उत्पादों को कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. रिबोप्रोब संश्लेषण
    1. बर्फ पर RNase-मुक्त माइक्रोफ्यूज ट्यूब रखें, और माइक्रोफ्यूज ट्यूब (10 माइक्रोन प्रतिक्रिया के लिए) में निम्नलिखित जोड़ें: 1x डिगऑक्सीजनिन आरएनए लेबलिंग मिक्स, 1x ट्रांसक्रिप्शन बफर, आरएनसे अवरोधकों के 0.5 माइक्रोन, टी7 आरएनए पॉलीमरेज के 1 माइक्रोन, पीसीआर उत्पाद के 1 μg और RNase-मुक्त पानी। प्रतिक्रिया को पाइपिंग और अपकेंद्रित्र द्वारा संक्षेप में मिलाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    2. RNase के 2 μL जोड़ें-मुक्त DNase I. पाइपिंग और अपकेंद्रित्र द्वारा प्रतिक्रिया संक्षेप में मिलाएं । 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    3. 2 माइक्रोन 0.2 एम EDTA (पीएच 8.0) जोड़ें। प्रतिक्रिया को पाइपिंग और अपकेंद्रित्र द्वारा संक्षेप में मिलाएं।
    4. उपरोक्त प्रतिक्रिया में 4 एम एलआईसीएल के 2.5 माइक्रोन और 75 माइक्रोन का प्रीचिलेड इथेनॉल जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं। -70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए छोड़ दें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। इथेनॉल को डिडेंट कर दें। प्रीचिलेड 70% इथेनॉल (v/v) का 1 मिलील जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाकर वर्षा को धोएं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। 70% इथेनॉल को डिडेंट करें और एक अल्कोहल लैंप के पास संक्षेप में वर्षा को सुखा लें। रनौज-मुक्त पानी के 30 माइक्रोन जोड़कर वर्षा को भंग करें और धीरे-धीरे मिलाएं।
    7. 1% अगारोज जेल पर संश्लेषित आरएनए का लोड 2 माइक्रोन। 0.5x TBE में 5-10 min के लिए 180 वी पर अगारोज जेल चलाएं। 260 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके लेबल आरएनए की एकाग्रता को मापें।
      1. RNase संदूषण से बचने के लिए RNase मुक्त माइक्रोफ्यूज ट्यूब और फिल्टर युक्तियों का उपयोग करें।
        नोट: (ठहराव बिंदु) डिगऑक्सीजनिन लेबल जांच कई महीनों के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. कोलोमिक द्रव संग्रह

  1. एस नुडस को पिन के साथ विच्छेदन तालिका पर ठीक करें। एस नुडस के शरीर को छोटी ऑटोक्लेव कैंची से खोलें। एक पिपेट के साथ लौकिक तरल पदार्थ को अलग करें।
  2. पॉली-डी-लायसिन इलाज माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए एक पिपेट के साथ 1 एमएल लौकोमिक तरल पदार्थ इकट्ठा करें और स्थानांतरित करें। एक पिपेट टिप के साथ लौकिक तरल पदार्थ समान रूप से लागू करें। स्लाइड्स में है 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक हवा सूखी।

3. सीटू संकरण में

  1. 1 दिन
    1. स्लाइड्स में है धुंधला जार 1x डायथिल पायरोकार्बोनेट का इलाज फॉस्फेट बफरेड लवण (डीईपीसी-पीबीएस) के 100 मिलीएल वाले स्जाल में स्लाइड्स में है। 1x DEPC-PBS के साथ 3 बार रिहाइड्रेट, कोमल आंदोलन के साथ प्रति धोने 5 मिन ।
    2. पाचन के साथ कोलोमिक द्रव के धब्बा को 5 मिन के लिए कमरे के तापमान पर 10 μg/mL प्रोटीन के के साथ प्रस्तुत करें । पाचन को रोकने के लिए 20 न्यूनतम के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में स्लाइड्स इनकरें । आगे की स्लाइड्स में देखें 1x DEPC- PBS में 5 मिन के लिए कोमल आंदोलन के साथ 3 बार।
    3. स्लाइड्स पर सेंस/एंटीसेंस राइबोप्रोब युक्त हाइब्रिडाइजेशन मिक्स (एचएम) के 50 माइक्रोन जोड़ें और एक कवर स्लिप जोड़ें।
    4. गीले बॉक्स बफर को गीले बॉक्स में डालें। स्लाइड्स में रखें गीले बॉक्स में परफिन फिल्म के साथ अच्छी तरह से सील करें। 60 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (कम से कम 16 घंटे) संकरण करें।
  2. दूसरा दिन
    1. वॉश बफर को 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें। स्लाइड में स्लाइड विसर्जित धोने बफर युक्त जार धुंधला और यह जब तक कवरस्लिप स्वचालित रूप से स्लाइड बंद खड़े हो जाओ । इसमें करीब 5 मिन लगते हैं।
    2. कोमल आंदोलन के साथ 65 डिग्री सेल्सियस, 30 मिन प्रति वॉश पर वॉश बफर के साथ 2 बार धोएं। कोमल आंदोलन के साथ 0.2x खारा-सोडियम साइट्रेट (एसएससी) 65 डिग्री सेल्सियस, 30 मिन प्रति वॉश के साथ 2 बार धोएं। कमरे के तापमान पर ट्वीन 20 (एमएबीटी) युक्त मैलिक एसिड बफर के साथ 2 बार धोएं, कोमल आंदोलन के साथ प्रति धोने के लिए 30 न्यूनतम।
    3. स्लाइड्स में ब्लॉकिंग बफर में 3-4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर। स्लाइड्स में 1 mL एंटी-डाइगोक्सिजेनिन-एपी फैब के टुकड़े हल 1/5000 पर पतला होगया, जिसमें अवरुद्ध बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
  3. 3 दिन
    1. एंटीबॉडी समाधान निकालें और एमएबीटी में संक्षेप में स्लाइड धोएं। कमरे के तापमान पर एमएबीटी के साथ 4 बार धोएं, कोमल आंदोलन के साथ प्रति धोने के लिए 25 न्यूनतम।
    2. स्लाइड्स में इनक्यूबेट कमरे के तापमान पर क्षारीय फॉस्फेटेज बफर के साथ 3 गुना, 5 न्यूनतम प्रति वॉश। क्षारीय फॉस्फेटेज बफर निकालें, और 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिनफॉट (BCIP) /नाइट्रो ब्लू टेट्राजोलियम (एनबीटी) धुंधला समाधान के 1 एमएल जोड़ें। स्लाइड्स में अंधेरे में रखें।
    3. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के नीचे समय-समय पर रंग प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें। जब रंग पूरी तरह से विकसित हो जाता है (1-4 घंटे की सीमा में प्रतिक्रिया समय), स्लाइड 2 बार कमरे के तापमान पर MABT के साथ धोने, कोमल आंदोलन के साथ धोने के प्रति 5 न्यूनतम ।
    4. कमरे के तापमान पर स्टॉप समाधान के साथ 2 बार धोएं, कोमल आंदोलन के साथ प्रति धोने के लिए 15 न्यूनतम। स्लाइड्स में इनक्यूल में अतिरिक्त दाग को दूर करने के लिए, कमरे के तापमान पर 30 min के लिए। बैकग्राउंड कलर के मुताबिक मेथनॉल वॉश 2 या 3 बार किया जा सकता है और डिकलराइजेशन का समय बढ़ाया जा सकता है।
    5. कमरे के तापमान पर एमएबीटी के साथ 2 बार धोएं, सौम्य आंदोलन के साथ प्रति धोने के लिए 5 न्यूनतम। स्लाइड्स को नए फिल्टर पेपर में ट्रांसफर करें। ग्लाइसेरोल के 50 माइक्रोन जोड़ें। कवरस्लिप जोड़ें और सूक्ष्म रूप से निरीक्षण करें।
      नोट: समाधान संरचना तालिका 2में दिखाया गया है ।

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Representative Results

ईश में शामिल चरणों का सारांश चित्र 1में दर्शाया गया है । डीआरटी1 के लिए एंटीसेंस और इसी सेंस रिबोप्रोब्स को कॉस्लोमिक फ्लूइड सीडीएनए से परिलक्षित पीसीआर उत्पादों से संश्लेषित किया गया था। पीसीआर उत्पादों की प्रामाणिकता का सत्यापन प्रत्यक्ष अनुक्रमण द्वारा किया गया था। रिबोप्रोब्स को निर्माता के प्रोटोकॉल और कुछ मामूली संशोधनों के साथ पिछली रिपोर्ट4 के अनुसार T7 आरएनए बहुलकों का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। ईश के प्रतिनिधि संकेतों को चित्रा 2में दिखाया गया है । एंटीसेंस राइबोप्रोब के साथ सिपन्यूकुलस नुडस कॉलोमिक तरल पदार्थ का ईश जो dmrt1 को लक्षित करता है, शुक्राणुओं की ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं में केंद्रित बैंगनी धुंधला पनपता है(चित्रा 2ए, बी,लाल तीर)। एक सेंस राइबोप्रोब का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और DMRT1 के लिए भावना राइबोप्रोब ने किसी भी संकरण संकेत(चित्रा 2 C)का पता नहीं लगाया।

Figure 1
चित्रा 1. ईश के प्रवाह आरेख। नीले बक्से रिबोप्रोब संश्लेषण के लिए कदम हैं । हल्के हरे बक्से सीटू प्रक्रियाओं में के लिए कदम हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2. ईश द्वारा पाए गए सिपन्यूकुलस नुडस कॉलोमिक तरल पदार्थ में DMrt1 की अभिव्यक्ति। (ए, बी) DMRT1 एंटीसेंस राइबोप्रोब के साथ संकरण। (ग) डीएमआरटी1 सेंस रिबोप्रोब के साथ संकरण। लाल तीर ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं में संकरण संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं। sz, शुक्राणु। स्केल बार: 50 माइक्रोन। इस आंकड़े को ली एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नाम अनुक्रम (5'-3′)
एंटी-प्रोब एफ ACAATGCAGGGTTTATCTTTTGG
एंटी-प्रोब आर TAATACGACTCACTATAGGAGACTGTTCTCTCTGCATTAA
सेंस-प्रोब एफ TAATACGACTCACTATAGGAGAACAATTAGCAGTTTTTTTTGG
सेंस-प्रोब आर सीटीजीटीसीटीसीटीसीटीजीसीटीएएटीएए

तालिका 1. dmrt1 प्राइमर दृश्यों।

अभिकर्मक संरचना
5 × TBE (1 एल) ट्रिस का 54 ग्राम, 27.5 ग्राम बोरिक एसिड और 20 एमएल 0.5 मीटर ईटीए (पीएच 8.0)।
10 × पीबीएस (5 एल) एनसीएल के 400 ग्राम, केसीएल के 10 ग्राम, एनए2एचएमओ4 के 72 ग्राम और 12 ग्राम के एचएएच2पीओ4।
डीपीसी-पीबीएस (1 एल) 1 × पीबीएस और 1 एमएल डीईपीसी के एल।
1 × पीबीएस में 4% पीएफए (100 mL, पीएच 7.4) पीएफए के 4 ग्राम और 100 एमएल पीबीएस।
10 मिलीग्राम/mL प्रोटीन के (1 mL) 10 मिलीग्राम प्रोटीन के.
20 × एसएससी (1 एल) 175.3 ग्राम नैल और 88.2 ग्राम साइट्रिक एसिड ट्राइसोडियम नमक।
गीला बॉक्स बफर (50 लाख) 20 × एसएससी का 2.5 एमएल, आरनैस मुफ्त पानी का 22.5 मीटर और डिओनाइज्ड फॉर्ममाइड का 25 एमएल।
संकरण मिश्रण (एचएम, 200 मिलीएल) 100 मिलीग्राम डिओनाइज्ड फॉर्ममाइड, 20 × एसएससी का 50 मिलीग्राम, 10 मिलीग्राम हेपरिन, 100 मिलीग्राम टीआरएनए, 0.39 ग्राम साइट्रिक एसिड, ट्वीन-20 का 200 माइक्रोन और आरएनएएस मुफ्त पानी 200 मिलीग्राम तक।
बफर धोएं (1 एल) 20 × एसएससी का 50 एमएल, डिओनाइज्ड फॉर्मामाइड का 500 एमएल, बाँझ पानी का 450 एमएल और 1 एमएल ट्वीन-20।
एमएबीटी (1 एल) 11.6 ग्राम मैलिक एसिड, 8.77 ग्राम नैल, 8.25 ग्राम नाओएच और 1 एमएल ट्वीन-20।
बफर को अवरुद्ध करना 1 × एमएबीटी, 2% भेड़ सीरम (vol/vol) और 2 मिलीग्राम/mL बीएसए ।
क्षारीय फॉस्फेटेज़ बफर 100 एमएम एनसीएल, 100 एमएम ट्रिस एचसीएल (पीएच 9.5), 50 एमएम एमजीसीएल2और 0.1% ट्वीन 20 (vol/vol) ।
समाधान बंद करो 0.1 एम ग्लाइसिन, पीएच 2.2।

तालिका 2। ईश प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों की संरचना।

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Discussion

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ईश कई लक्ष्य आरएनए16,17,,18का पता लगाने के लिए उपयुक्त है । इस प्रोटोकॉल में, हमने कॉस्लोमिक तरल पदार्थ में एमआरएनए का पता लगाने और सिपन्यूकुलस नुडस में अनुकूलित संकरण की स्थिति पर जोर देने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन ईश विधि का वर्णन किया। हमने देखा DMrt1 के स्पष्ट संकेतों जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने में इस प्रोटोकॉल के सफल आवेदन का प्रदर्शन किया(चित्रा 2)।

प्रयोग के दौरान कई कदमों पर विशेष ध्यान देने की जरूरत है। सबसे पहले, लक्ष्य जीन के लिए भावना राइबोप्रोब्स नियंत्रण के रूप में संश्लेषित किया जाना चाहिए । संश्लेषण के बाद, एक जेल पर राइबोप्रोब की गुणवत्ता की जांच की जानी चाहिए। खराब आरएनए संश्लेषण के परिणामस्वरूप वर्गों में कोई धुंधला नहीं होगा। दूसरे, नमूना संग्रह प्रक्रिया सेल विरूपण को रोकने के लिए कोमल होना चाहिए और आरएनए क्षरण को रोकने के लिए ब्रह्मांडीय द्रव संग्रह के तुरंत बाद प्रयोग किया जाना चाहिए। तीसरा, इनक्यूबेशन समय और समय को छोटा या लंबा किए बिना सभी चरणों में बिल्कुल पालन किया जाना चाहिए । खासतौर पर प्रोटीनके ट्रीटमेंट के टाइमिंग पर ध्यान दें। प्रोटीन के बहुत लंबे उपचार समय नमूना की कोशिका संरचना के विनाश के लिए नेतृत्व करेंगे, जबकि बहुत कम उपचार समय राइबोप्रोब को ठीक से सेल में प्रवेश करने की अनुमति नहीं देगा। अंत में, प्रयोग के दौरान स्लाइड सूखना नहीं चाहिए। इस विधि में 60 डिग्री सेल्सियस पर एक संकरण कदम शामिल है, जो अभिकर्मक वाष्पीकरण के जोखिम को बढ़ाएगा। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में कहा गया है, स्लाइड को गीले बक्से में रखा जाना चाहिए और वाष्पीकरण से बचने के लिए पैराफिन फिल्म से ढका जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा गैर-मॉडल जीव सिपुकुलस नुडसमें राइबोप्रोब दृश्यों का अधिग्रहण है, क्योंकि खराब अनुक्रमित एमआरएनए राइबोप्रोब की कम विशिष्टता प्रदान कर सकता है। अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के विकास के साथ, सिपन्यूकुलस नुडस के अधिक से अधिक उच्च गुणवत्ता वाले दृश्यजारी किए जाएंगे, जिससे इस स्थिति में काफी सुधार होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 31801034), फुजियान प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, चीन (2016J01161), हुआकिओ विश्वविद्यालय के वैज्ञानिक अनुसंधान कोष (15BS306) और हुआकिओ विश्वविद्यालय के वैज्ञानिक अनुसंधान में स्नातकोत्तर अभिनव कोष के युवा वैज्ञानिक कोष द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Biowest 111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments Roche 11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit Beyotime C3206
Bovine Serum Albumin Sigma B2064
Centrifuge Eppendorf 5415R
Citric acid Sinopharm Chemical Reagent Co. 5949-29-1
Citric acid trisodium Sinopharm Chemical Reagent Co. 4/3/6132
Coverslips Beyotime FCGF60
Deionized formamide Amresco 12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPC Sigma D5758 Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix Roche 11277073910
DNase I, RNase-free Invitrogen 18047019
EDTA Sigma 431788
Electrophoresis gel imaging Bio-Rad Universal Hood III
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co. 64-17-5
Gel extraction kits Omega D2500
Gel-electrophoresis apparatus Beijing Liuyi Instrument Factory DYY-6C
Glycerol Sinopharm Chemical Reagent Co. 56-81-5
Glycine Sigma G5417
Heparin Sigma 8/1/9041
KCl Sinopharm Chemical Reagent Co. 7447-40-7
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent Co. 7778-77-0
LiCl Sigma 203637
Maleic acid Sinopharm Chemical Reagent Co. 110-16-7
Methanol Sinopharm Chemical Reagent Co. 67-56-1 Noxious substance
MgCl2 Sinopharm Chemical Reagent Co. 7786-30-3
Na2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent Co. 7558-79-4
NaCl Biofount JT0001
NaOH Sinopharm Chemical Reagent Co. 1310-73-2 Corrosive
Paraffin film Bemis Company, Inc. PM-996
Paraformaldehyde, PFA Sigma 158127 Noxious substance
PCR Instrument Life Technology Proflex
Pins Deli 16
Pipette Eppendorf plus G
Poly-D-lysine treated microscope slides Liusheng VER_A01
Proteinase K Sigma SRE0005
RNase free water HyClone SH30538. 02
RNase inhibitor Roche 3335399001
S. nudus
Sheep serum Beyotime C0265
Slide staining jar Beyotime FG010
Slide storage box Beyotime FBX011
Small autoclaved scissors Shuanglu sku_8330
Spectrophotometers Thermo Fisher NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerases Roche 10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X) Thermo Scientific K1081
Tris HCl Sigma RES3098T
tRNA Roche 10109517001
Tween-20 Sigma P1379
Water bath Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial HH-S2

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References

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जीव विज्ञान अंक 159 आरएनए स्थानीयकरण डिगोक्सीजेनिन एंटीसेंस रिबोप्रोब सेंस रिबोप्रोब अभिव्यक्ति पैटर्न समुद्री कीड़ा
<i>सिपन्यूकुलस नुडस</i> कोलोमिक फ्लूइड के लिए सीटू संकरण में
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Li, W., Yuan, M., Wu, Y. In situ… More

Li, W., Yuan, M., Wu, Y. In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid. J. Vis. Exp. (159), e61022, doi:10.3791/61022 (2020).

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