Summary
Denne protokollen beskriver en effektiv in situ hybridisering tilnærming for å oppdage mRNA uttrykksnivåer og romlige mønstre av målgener i Sipunculus nudus coelomic væske.
Abstract
In situ hybridisering (ISH) er en svært informativ teknikk for å presentere cellulære distribusjonsmønstre av spesifikke gener (f.eks. mRNA og ncRNA) i vev. Den sipunculid ormen Sipunculus nudus er en avgjørende fiskeriressurs som den har høye ernæringsmessige og medisinske verdier. For tiden er forskningen på molekylærbiologien til Sipunculus nudus fortsatt i sin barndom. Formålet med denne artikkelen er å utvikle en sensitiv metode for lokalisering av spesifikke mRNA i Sipunculus nudus coelomic væske. Protokollen inneholder detaljerte trinn av ISH, inkludert digoxigenin-merket antisense og følelse riboprobe forberedelse, coelomic væske samling og seksjon forberedelse, spesifikk riboprobe hybridisering, antistoff inkubasjon, fargestoffer og post-coloration behandlinger. De representative resultatene hentet fra et vellykket eksperiment ved hjelp av denne metoden er demonstrert. Protokollen skal også gjelde for andre Sipuncula-arter.
Introduction
ISH, ved hjelp av en merket nukleinsyresonde for å oppdage den spesifikke DNA- eller RNA-sekvensen av interesse, er en nyttig metode for å beskrive det romlige uttrykksmønsteret til målgener i morfologisk bevart vev1,,2,3. Normalt genereres målsekvensen av polymerasekjedereaksjon (PCR), og brukes deretter som mal for å syntetisere antisansen /sense RNA-sonden merket med digoksigeninuridine-5'-triphosfat. Prøvene er faste og permeabiliserte før inkubasjon med riboprobe. Etter å ha vasket av overflødig sonde, visualiseres hybridisering av immunohistokjemi ved hjelp av et anti-digoxygenin antistoff, som er alkalisk fosfatase-konjugert3,4,5,6.6
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; orden Sipunculida: Sipunculidae) er en unsegmented, coelomate og bilateralt symmetrisk marine orm7,8. Sipunculus nudus er en kosmopolitisk art utbredt i tropiske og tempererte kystnære farvann. Det er også en viktig marin fiskeriressurs i Sør-Kina på grunn av sine høye ernæringsmessige og medisinske verdier9,10. Sipunculus nudus i molekylærbiologi er imidlertid fortsatt i sin barndom. For å fullt ut forstå geners biologiske rolle, er undersøkelsen av generuttrykksmønstre med en cellulær oppløsning av stor interesse. I den ikke-modell organismen Sipunculus nuduser ISH-metoden, som er en ideell metode for å oppdage genenes uttrykksmønstre, ennå ikke etablert. Dens coelomic væske inneholder flere celletyper, inkludert granulocytter, urne celler, vesikulære celler, bakterieceller, erytrocytter, etc11. Den doble sex /mab-3 relaterttranskripsjon faktor-1 (dmrt1), brukt som et representativt gen i denne metoden, er en svært bevart transkripsjonsregulator av sex bestemmelse og differensiering i de fleste arter som spenner fra virvelløse dyr til pattedyr12,13. I en rekke arter (dvs. svart porgy, etc.) 14, dmrt1 ble uttrykt i Sertoli cellene, rundt germinal celler, hvis funksjon ligner trophoblast celler av Sipunculus nudus. Derfor hypotetiserte vi at dmrt1 av Sipunculus nudus uttrykkes i trophoblastceller av spermatozeugmata, og resultatet av ISH-metoden bekreftet tydelig hypotesen.
Denne protokollen beskriver for første gang ISH, med digoxigenin-merkede antisense / sense mRNA-sonder, for å bestemme mRNA-uttrykksmønstre i sitt koelomisk væskesmøring. De optimale reaksjonsforholdene leveres, noe som tillater svært sensitiv visualisering av mRNA-uttrykk ved høy oppløsning. Den utviklede ISH-metoden kan potensielt brukes i flere sipunculida arter enn Sipunculus nudus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprosedyren ble godkjent av Dyre- og velferdskomiteen ved Huaqiao University.
1. Riboprobe forberedelse
- Primer design
- Åpne programmet Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopier dmrt1-sekvensen (GenBank: MK182259) inn i sekvensvinduet.
- Still inn primerlengde (23-25 bp), smeltetemperatur (55-60 °C) og g/c-innhold (40-60 %). Klikk velg primerer.
MERK: Den minimale størrelsen som kreves for RNA-sonden er ca. 500 bp. Lengre prober har normalt høyere spesifisitet. - Legg til T7 RNA polymerase promoter sekvens (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) til en av de valgte primere. Dmrt1 primer sekvenser for ISH er vist i tabell 1.
MERK: For sansesonder ligger T7 RNA-polymerasearrangøren på 5's enden av de fremre primere. For antisense-prober ligger T7 RNA-polymerasearrangøren på 5'-enden av de omvendte primere.
- PCR forsterkning
- Plasser mikrofugerørene på is, og klargjør følgende reaksjonsblanding (for en 50 μL-reaksjon): 1x Taq DNA polymeraseblanding, 1 μg cDNA (som fremstilles fra 100 μL koelomisk væske), 1 μM fremoverprimer, 1 μM revers og kjernekjernevann.
- Bland PCR-reaksjonen ved å pipetting og sentrifuge kort.
- Plasser reaksjonsrøret i en termisk syklus, og kjør PCR ved hjelp av følgende forhold: innledende avkok ved 95 °C i 2 min etterfulgt av 36 sykluser med avnaturasjon ved 95 °C i 30 s, glødved 55-60 °C i 30 s, forlengelse ved 72 °C i 30 s og en endelig forlengelse ved 72 °C i 7 min.
MERK: Glødetemperaturen bør optimaliseres i henhold til primere.
- PCR-produktrensing og -verifisering
- Last 50 μL PCR-blandingen direkte på en 1% agarose gel. Kjør agarose gel på 150-180 V for 10 min i 0,5x TBE. Isoler de spesifikke DNA-fragmentene fra 1% agarose gel.
MERK: DNA skal vises som et enkelt bånd og ikke som et smør. - Rense DNA-fragmentene ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens protokoll. Kvantifiser de rensede produktene ved spektrotometri ved en bølgelengde på 260 nm.
- Kontroller ektheten av PCR-produktene ved sekvensering.
MERK: (Pausepunkt) De rensede PCR-produktene kan oppbevares ved -20 °C i flere måneder.
- Last 50 μL PCR-blandingen direkte på en 1% agarose gel. Kjør agarose gel på 150-180 V for 10 min i 0,5x TBE. Isoler de spesifikke DNA-fragmentene fra 1% agarose gel.
- Riboprobe syntese
- Plasser rnasefrie mikrofugerør på is, og legg følgende til mikrofugerøret (for en 10 μL-reaksjon): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x transkripsjonsbuffer, 0,5 μL RNase-hemmere, 1 μL T7 RNA-polymeraser, 1 μg PCR-produkt og RNase-fritt vann. Bland reaksjonen ved pipettering og sentrifuge kort. Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
- Tilsett 2 μL RNase-fri DNase I. Bland reaksjonen ved å pipetting og sentrifuge kort. Inkuber i 15 min ved 37 °C.
- Tilsett 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8,0). Bland reaksjonen ved pipettering og sentrifuge kort.
- Tilsett 2,5 μL av 4 M LiCl og 75 μL forhåndskjølt etanol til ovennevnte reaksjon. Bland godt. La stå i 30 min ved -70 °C.
- Sentrifuge ved 12 000 x g i 10 min ved 4 °C. Dekanter etanolen. Tilsett 1 ml forhåndskjølt 70% etanol (v/ v) og vask nedbøren ved å blande forsiktig.
- Sentrifuge ved 12 000 x g i 5 min ved 4 °C. Dekanter 70% etanol og tørk nedbøren kort nær en alkohollampe. Oppløs nedbøren ved å tilsett 30 μL rnasefritt vann og bland forsiktig.
- Last 2 μL syntetisert RNA på en 1% agarose gel. Kjør agarose gel på 180 V for 5-10 min i 0,5x TBE. Mål konsentrasjonen av merket RNA ved hjelp av et spektrotometer med en bølgelengde på 260 nm.
- Bruk RNase-frie mikrofugerør og filterspisser for å unngå RNase-kontaminering.
MERK: (Pausepunkt) De digoksygeninmerkede sondene kan oppbevares ved -70 °C i flere måneder.
- Bruk RNase-frie mikrofugerør og filterspisser for å unngå RNase-kontaminering.
2. Koelomisk væskesamling
- Fest S. nudus på disseksjonstabellen med pinner. Åpne kroppen til S. nudus med liten autoklet saks. Isoler den koelomiske væsken med en pipette.
- Samle og overfør 1 ml koelomisk væske med en pipette til poly-D-lysin behandlet mikroskop lysbilder. Påfør den koelomiske væsken jevnt med en pipettespiss. Lufttørk lysbildene i 1 t ved 37 °C.
3. In situ hybridisering
- Dag 1
- Rehydrere lysbildene i en lysbildefargekrukke som inneholder 100 ml 1x dietylpyrokarbonatbehandlet fosfatbufret saltvann (DEPC-PBS). Rehydrere 3 ganger med 1x DEPC-PBS, 5 min per vask med mild agitasjon.
- Permeabilize smøring av coelomisk væske ved fordøyelsen med 10 μg/ ml proteinase K ved romtemperatur i 5 min. Inkuber lysbildene i 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter for å stoppe fordøyelsen. Vask lysbildene i 1x DEPC-PBS med mild agitasjon i 5 min 3 ganger.
- Tilsett 50 μL hybridiseringsblanding (HM) som inneholder sansen/antisense riboprobe på lysbildene og legg til en dekselseddel.
- Legg til buffer for våt boks i våtboksen. Sett lysbildene i den våte boksen og forsegle godt med parafinfilm. Hybridiserover natten (minst 16 timer) ved 60 °C.
- Dag 2
- Forvarm vaskebufferen ved 65 °C. Senk lysbildet i skyvefargeglasset som inneholder vaskebufferen, og la den stå til dekselet glir av automatisk. Det tar ca 5 min.
- Vask 2 ganger med vaskebuffer ved 65 °C, 30 min per vask med mild agitasjon. Vask 2 ganger med 0,2 x saltvannsnatriumsitrat (SSC) ved 65 °C, 30 min per vask med mild agitasjon. Vask 2 ganger med malesyrebuffer som inneholder Tween 20 (MABT) ved romtemperatur, 30 min per vask med mild agitasjon.
- Inkuber lysbildene ved romtemperatur i 3–4 timer i blokkeringsbufferen. Inkuber lysbildene i 1 ml anti-digoxigenin-AP Fab fragmenter løsning fortynnet på 1/5000 med blokkering buffer ved 4 °C over natten.
- Dag 3
- Fjern antistoffoppløsningen og vask lysbildene kort i MABT. Vask 4 ganger med MABT ved romtemperatur, 25 min per vask med mild agitasjon.
- Inkuber lysbildene med alkalisk fosfatasebuffer ved romtemperatur 3 ganger, 5 min per vask. Fjern alkalisk fosfatbufferen, og tilsett 1 ml 5-bromo-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP)/nitroblå tetrazolium (NBT) fargeoppløsning. Hold lysbildene i mørket.
- Vær oppmerksom på fargereaksjonen med jevne mellomrom under et optisk mikroskop. Når fargen er fullt utviklet (reaksjonstiden i området 1-4 h), vask lysbildene 2 ganger med MABT ved romtemperatur, 5 min per vask med mild agitasjon.
- Vask 2 ganger med stoppoppløsning ved romtemperatur, 15 min per vask med mild agitasjon. Inkuber lysbildene i metanol for å fjerne overflødig flekk, ved romtemperatur i 30 min. Ifølge bakgrunnsfargen kan metanolvasken gjøres 2 eller 3 ganger, og avfargingstiden kan forlenges.
- Vask 2 ganger med MABT ved romtemperatur, 5 min per vask med mild agitasjon. Overfør lysbildene til et ferskt filterpapir. Tilsett 50 μL glyserol. Tilsett dekkleppene og observer mikroskopisk.
MERK: Løsningssammensetningen vises i tabell 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et sammendrag av trinnene som er involvert i ISH er illustrert i figur 1. Antisans og tilsvarende følelse riboprobes for dmrt1 ble syntetisert fra PCR-produkter forsterket fra coelomic væske cDNAs. Ektheten av PCR-produktene ble verifisert ved direkte sekvensering. Riboprobes ble syntetisert ved hjelp av T7 RNA polymeraser i henhold til produsentens protokoller og en tidligere rapport4 med noen mindre modifikasjoner. De representative signalene fra ISH vises i figur 2. ISH av Sipunculus nudus coelomic væske med antisense riboprobe som retter seg mot dmrt1 avslører lilla farging konsentrert i trophoblast celler i spermatozeugmata (Figur 2A, B, røde piler). En følelse riboprobe ble brukt som en negativ kontroll, og forstanden riboprobe for dmrt1 oppdaget ikke noe hybridiseringssignal (figur 2C).
Figur 1. Flytdiagram av ISH. Blå bokser er trinnene for å syntetisere riboprobe. Lysegrønne bokser er trinn for in situ prosedyrer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Uttrykket av dmrt1 i Sipunculus nudus coelomic væske oppdaget av ISH. - Jeg har ikke noe åsi. Hybridisering med dmrt1 antisense riboprobe. (C) Hybridisering med dmrt1-sensor riboprobe. De røde pilene representerer hybridiseringssignaler i trofoblastceller. sz, spermatozeugmata. Skala stang: 50 μm. Dette tallet er endret fra Li et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| navn | Sekvens (5'-3') |
| Anti-Probe F | ACAATGTAGCAGGGTTTAATCTTGG |
| Anti-Probe R | TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTTCtCTATGCATCCAGTAA |
| Sans-Sonde F | TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATGTAGCAGGGTTTAATCTTGG |
| Sans-Probe R | CTGTTTCtCTATGCATCCAGTAA |
Tabell 1. Dmrt1 primer sekvenser.
| Reagens | Sammensetning |
| 5 × TBE (1 L) | 54 g Tris, 27,5 g borsyre og 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0). |
| 10 × PBS (5 L) | 400 g NaCl, 10 g KCl, 72 g Na2HPO4 og 12 g KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 L av 1 × PBS og 1 ml DEPC. |
| 4 % PFA i 1 × PBS (100 ml, pH 7.4) | 4 g PFA og 100 ml PBS. |
| 10 mg/ml proteinase K (1 ml) | 10 mg proteinase K. |
| 20 × SSC (1 L) | 175,3 g NaCl og 88,2 g sitronsyretrinatriumsalt. |
| Buffer for våtboks (50 ml) | 2,5 ml av 20 × SSC, 22,5 ml RNase fritt vann og 25 ml deionisert formamid. |
| Hybridisering mix (HM, 200 ml) | 100 ml deionisert formamid, 50 ml 20 × SSC, 10 mg heparin, 100 mg tRNA, 0,39 g sitronsyre, 200 μL Tween-20 og RNase fritt vann til 200 ml. |
| Vaskebuffer (1 L) | 50 ml av 20 × SSC, 500 ml deionisert formamid, 450 ml sterilt vann og 1 ml Tween-20. |
| MABT (1 L) | 11,6 g hannsyre, 8,77 g NaCl, 8,25 g NaOH og 1 ml Tween-20. |
| Blokkere buffer | 1 × MABT, 2% sauserum (vol/vol) og 2 mg/ml BSA. |
| Alkalisk fosfatasebuffer | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl (pH 9.5), 50 mM MgCl2og 0,1% Tween 20 (vol /vol). |
| Stopp løsning | 0,1 M glycin, pH 2.2. |
Tabell 2. Sammensetningen av løsninger som brukes i ISH-protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere studier viste at ISH er egnet for å oppdage flere mål RNAs16,17,18. I denne protokollen beskrev vi en høyoppløsnings ISH-metode for å oppdage mRNA i koelomisk væske og understreke de optimaliserte hybridiseringsforholdene i Sipunculus nudus. De åpenbare signalene fra dmrt1 vi observerte demonstrerte vellykket anvendelse av denne protokollen ved påvisning av genuttrykk (figur 2).
Under eksperimentet må en rekke trinn gis spesiell oppmerksomhet. For det første må sense riboprobes for målgenene syntetiseres som kontrollen. Etter syntesen bør kvaliteten på riboprobe kontrolleres på en gel. Dårlig RNA-syntese vil resultere i ingen flekker i seksjonene. For det andre bør prøveinnsamlingsprosessen være forsiktig for å forhindre celledeformasjon, og eksperimentet må utføres umiddelbart etter koelomisk væskeinnsamling for å forhindre RNA-nedbrytning. For det tredje bør inkubasjonstid og klokkeslett følges nøyaktig i alle trinn uten å forkorte eller forlenge. Spesielt ta hensyn til tidspunktet for proteinase K behandling. For lang behandlingstid av proteinase K vil føre til ødeleggelse av cellestrukturen i prøven, mens for kort behandlingstid ikke vil tillate riboprobe å komme inn i cellen riktig. Til slutt bør lysbilder ikke tørke ut under eksperimentet. Denne metoden innebærer et hybridiseringstrinn ved 60 °C, noe som vil øke risikoen for reagensfordampning. Som nevnt i protokolldelen, må lysbilder settes inn i en våt boks og dekkes med parafinfilm for å unngå fordampning.
En begrensning av denne protokollen er oppkjøpet av riboprobe sekvenser i ikke-modell organisme Sipunculus nudus, fordi dårlig sekvensert mRNA kan gi lav spesifisitet av riboprobe. Med utviklingen av sekvenseringsteknologi vil flere og flere sekvenser av sipunculus nudus bli utgitt, noe som i stor grad vil forbedre denne situasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), Natural Science Foundation of Fujian Province, Kina (2016J01161), Scientific Research Funds of Huaqiao University (15BS306) og Postgraduates' Innovative Fund in Scientific Research of Huaqiao University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A.
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
