Summary
반복-관련 비-ATG 의존적 번역 제품은 여러 반복 확장 기반 질병의 새로운 병원성 특징이다. 기재된 프로토콜의 목적은 모델 시스템 C. elegans에서행동 및 세포 분석술을 사용하여 이들 펩티드에 의한 독성을 평가하는 것이다.
Abstract
C. 예쁜꼬마선충은 근위축성 측삭경화증(ALS) 및 헌팅턴병과 같은 반복적인 팽창 돌연변이로 인한 노화 관련 신경퇴행성 질환을 모델링하는 데 일반적으로 사용됩니다. 최근, 반복 팽창-함유 RNA는 반복-관련 비-8월 의존적(RAN) 번역이라고 불리는 단백질 번역의 새로운 유형에 대한 기질로 나타났다. 표준 번역과 달리 RAN 번역은 시작 코돈이 필요하지 않으며 반복이 임계값 길이를 초과하는 경우에만 발생합니다. 판독 프레임을 결정하는 시작 코돈이 없기 때문에, RAN 번역은 반복 확장 서열을 포함하는 센스 및 안티센스 RNA 템플릿 모두에서 모든 판독 프레임에서 발생한다. 따라서 RAN 번역은 가능한 질병 관련 독성 펩티드의 수를 1개에서 6개로 확장합니다. 지금까지, RAN 번역은 8개의 상이한 확장 기반 신경퇴행성 및 신경근육 질환에서 문서화되었다. 각각의 경우에, RAN 제품이 유독한, 뿐만 아니라 독성의 그들의 기계장치, 이 펩티드가 질병 병리생리학에 어떻게 기여하는지 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 이 백서에서는 모델 시스템 C. elegans에서RAN 펩타이드의 독성을 측정하는 전략을 제시합니다. 첫째, 우리는 C. elegans개발의 성장 그리고 운동성에 RAN 펩티드 독성을 측정하기위한 절차를 설명합니다. 둘째, 우리는 운동성에 RAN 펩티드의 후 개발, 연령 의존적 효과를 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 우리는 신경 형태에 RAN 펩티드의 효력을 평가하기 위한 신경 독성 분석학을 기술합니다. 이 시험은 RAN 펩티드 독성의 광범위한 평가를 제공하고 질병 기계장치 또는 치료를 확인하기 위하여 대규모 유전 또는 작은 분자 스크린을 능력을 발휘하기 위하여 유용할 지도 모릅니다.
Introduction
DNA 반복 서열의 부적절한 확장은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 치매(FTD), 헌팅턴병(HD)1과같은 여러 신경 퇴행성 질환에 대한 유전적 기초이다. 이 질병을 위한 설치한 세포와 동물 모형이 있는 동안, 이 조건의 밑에 기계장치는 잘 정의되지 않습니다. 예를 들어, 헌팅틴 단백질Htt2에대한 코딩 서열에서 CAG 반복 서열의 확장에 의해 헌팅턴파가 발생한다. CAG는 아미노산 글루타민을 인코딩하기 때문에, CAG 반복 팽창은 Htt. 확장폴리Q 단백질 형성 길이 및 연령에 따른 단백질 응집체를 형성하여 폴리글루타민 또는 폴리Q의 삽입을 초래한다3,,4. 놀랍게도, 2개의 최근 연구는 polyQ 서열의 길이가 헌팅턴병 발병의 주요 동인이 아니라는 것을 시사하며, 폴리Q 독립적 인 요인이 또한 질병5,,6에기여할 수 있음을 시사한다.
한 가지 가능한 polyQ 독립적 인 메커니즘은 Repeat A연관 된 N온 - AUG 의존적 (RAN) 번역7이라고불리는 새로 발견된 유형의 단백질 번역을 포함한다. 이름에서 알 수 있듯이 RAN 번역은 확장된 반복 시퀀스가 있고 표준 시작 코돈이 필요하지 않은 경우에만 발생합니다. 따라서 RAN 번역은 3개의 뚜렷한 폴리펩티드를 생성하기 위해 반복의 세 개의 판독 프레임 에서 모두 발생한다. 또한, 많은 유전자가 또한 확장된 반복 서열의 역보체를 포함하는 안티센스 전사체를 생성하기 때문에, RAN 번역은 또한 안티센스 전사체의 세 개의 판독 프레임 에서 발생한다. 함께, RAN 번역은 1개의 펩티드에서 6개의 펩티드에 확장된 반복 함유 DNA 서열에서 생성된 단백질의 수를 확장합니다. 현재까지, RAN 번역은 적어도 8개의 상이한 반복 확장장애8에서관찰되었다. RAN 펩티드는 사후 환자 샘플에서 관찰되며 환자가 확장 된 반복을운반하는 경우에만9,10. 이 펩티드는 참을성 있는 세포에서 명확하게 나타나있는 동안, 질병 병리생리학에 그들의 기여는 불분명합니다.
RAN 펩티드와 관련된 잠재적 독성을 더 잘 정의하기 위해, 여러 그룹은 효모, 파리, 마우스 및 조직 배양 세포11,,12,,13,,14,,15,,16과같은 다양한 모델 시스템에서 각 펩티드를 발현하였다. 발현을 위한 반복 서열을 이용하는 대신, 이 모형은 반복 순서가 제거되고 아미노산 순서가 보존되는 코돈 변이 접근을 채택합니다. 번역 개시는 정식 ATG를 통해 발생하고 펩티드는 전형적으로 N- 또는 C-말단에서 형광 단백질에 융합되며, 둘 중 어느 것도 RAN 펩티드 독성을 방해하는 것으로 나타나지 않습니다. 따라서 각 구문은 단일 RAN 펩티드를 과발현합니다. RAN 펩타이드 독성을 측정하는 간단한 분석을 통해 다세포 유기체에서 상이한 RAN 제품을 모델링하는 것은 각 질병을 유발하는 반복 확장으로부터의 상이한 RAN 생성물이 세포 기능 장애 및 신경 변성에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 매우 중요합니다.
다른 모델 시스템과 마찬가지로 C. elegans는 RAN 펩타이드 독성과 같은 새로운 질병 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 하는 유연하고 효율적인 실험 플랫폼을 제공합니다. 웜은 RAN 펩티드 독성의 다른 모델에서 현재 사용할 수없는 몇 가지 독특한 실험 특성을 제공합니다. 첫째, C. 예쁜꼬마선충은 태어날 때부터 죽음까지 광학적으로 투명합니다. 이것은 살아있는 동물에 있는 신경 변성의 생체 내 분석 뿐만 아니라 RAN 펩티드 발현 및 현지화의 간단한 시각화를 허용합니다. 둘째, RAN 펩티드 발현 모델을 생성하기 위한 형질전환 방법은 저렴하고 빠릅니다. C. elegans의짧은 3 일 수명 주기를 감안할 때, 세포 형 특정 방식으로 임의의 주어진 RAN 펩티드를 발현하는 안정적인 형질전환 라인은 1 주일 이내에 생성 될 수있다. 셋째, 간단한 자형질 출력은 화학적 돌연변이 발생 또는 RNAi 스크리닝과 같은 유전자 스크리닝 방법과 결합되어 RAN 펩타이드 독성에 필수적인 유전자를 신속하게 식별할 수 있습니다. 마지막으로, C. elegans의 짧은 수명 (~20 일)은 대부분의 반복 확장 질병에 대한 가장 큰 위험 인자인 노화가 RAN 펩티드 독성에 미치는 영향을 결정하는 방법을 조사합니다. 함께, 실험 속성의이 조합은 다른 모델 시스템에서 타의 추종을 불허하 고 RAN 펩 티 드 독성의 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공 합니다.
여기에서 우리는 RAN 펩티드의 독성을 측정하고 이 독성의 유전 수정자를 확인하기 위하여 C. elegans의 실험적인 이점을 활용하는 몇몇 측정을 기술합니다. 코돈-다양한 ATG-개시 RAN 펩타이드는 GFP로 태그가 지정되고 myo-3 프로모터 아래의 근육 세포 또는 unc-47 프로모터 하에서 GABAergic 운동 뉴런에서 개별적으로 발현됩니다. 근육 세포에서의 발현을 위해, 독성 RAN 펩타이드는 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 RNAi 공급 벡터로 표적화될 수 있는 다른 형광 단백질(FP) 태그로 태그가 지정되는 것이 중요합니다. 이는 독성 RAN 펩타이드 발현이 일반적으로 성장을 차단하기 때문에 이러한 균주를 불가능시로 렌더링합니다. gfp (RNAi)의 사용은 조건부 RAN 펩타이드 발현을 비활성화하고 긴장 유지, 유전 십자가 등을 허용합니다. 검안의 경우, 이들 동물은 gfp(RNAi)에서제거되어 RAN 펩타이드및 생성된 표현형의 발현을 허용한다. 코돈-다양한 RAN 펩타이드 발현 구조를 설계하기 위한 분자 전략 외에도, 우리는 발달 독성(애벌레 운동성 및 성장 분석), 개발 후 연령 관련 독성(마비 분석) 및 신경 형태학적 결함(commissure assay)을 측정하기 위한 분석서를 설명합니다.
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Protocol
1. 코돈 다양한 RAN 펩타이드 발현 구문 생성
- 기본 반복 DNA / RNA 구조를 제거하지만 오버 레이딩 아미노산 서열을 보존하기 위해 동의어 코돈활용 개별 RAN 펩타이드 코딩 서열을 설계합니다.
- 스터디에 필요한 반복 길이(일반적으로 5-100회 반복)에서 사용자 지정 코돈 서열을 상업적으로 주문합니다. pPD95.79와 같은 C. elegans 발현 벡터로 의 클로닝을 용이하게 하기 위해 5' 말단에 HindIII 제한 사이트와 3' 끝에 BamHI 제한 사이트를 포함한다.
참고: 더 큰 구목의 합성이 어렵다는 것이 입증되면, 더 작은 빌딩 블록 서열을 합성한 다음 방향성 결찰전략(17)을사용하여 더 큰 반복으로 내장될 수 있다. - 표준 T4 결찰 방법을 사용하여 펩티드 서열을 C. elegans 발현 벡터로 서브클론.
- 서브클론 조직 특이적 RAN 펩티드-GFP 발현을 구동하기 위해 RAN 펩티드 서열 의 앞에 PCR에 의해 생성된 세포 유형 별 프로모터 서열.
- RAN 펩타이드 구조를 야생형 C. 예쁜꼬마조충의 고나드내로 미세주입하여 표준 방법18을사용하여 염색성 어레이를 포함하는 형질전환 균주를 생성한다. 공동 주입 마커의 경우, 다른 마커도 활용될 수 있지만, 근육 특이적 RFP리포터(myo-3p::RFP(pCFJ104))를 활용하였다.pCFJ104
- 표준 C. elegans 통합 스크리닝 방법을 사용하여 게놈에 안정한 이식유전자를통합하는 방법 19.
- RAN 펩티드가 독성및 형질전환동물이 살아남지 못하는 경우, 동물gfp(RNAi)에게 독성 단백질의 발현을 침묵시키기 위해 주입 전 및 사후 세균을 발현한다.
참고: gfp (RNAi)에서 동물의 제거는 아래에 기술된 분석학을 사용하여 표현형 분석을 위한 RAN 펩티드 발현을 가능하게 합니다.
2. RNAi 기반 유전자 녹다운 에 따른 RAN 펩타이드의 발달 독성 측정: 비디오 속도 분석 프로토콜
- 표준 선충 성장 배지 (NGM) RNAi 24 잘 플레이트 1 mMM 이소 프로필 β-D-1-티오 갈라 크토피라 노 사이드 (IPTG) 및 25 μg /mL 카베니실린.
- 루리아 국물 (LB) + 카르베니실린 (25 μg / mL) 한천 플레이트에 테스트 할 HT115 박테리아에서 RNAi 공급 클론을 줄 무늬 및 24 시간 동안 37 °C에서 박테리아를 성장. 독성 및 gfp (RNAi)에 대한 긍정적 인 대조군으로 빈 벡터 (RNAi)를 포함.
- 각 클론에 대해, LB + 카르베니실린 액체 매체의 1 mL로 단일 콜로니를 선택하고 분당 250 회전 (RPM)에서 흔들면서 37 °C에서 18 시간 동안 밤새 박테리아를 성장시다.
- NGM RNAI 24 웰의 4개의 개별 우물을 다음 야간 세균 배양물의 20 μL로 스팟: 컬럼 1 웰 = gfp(RNAi); 열 2 우물 = (EV)RNAi; 열 3-6 우물 = 유전자에 대한 RNAi 테스트 할 수 있습니다. RNAi 박테리아가 실온(RT)에서 하룻밤 사이에 dsRNA 생산을 유도하도록 허용하십시오.
- 표준 하이포아염소산염 방법을 사용하여 통합 RAN 펩타이드 이식유전자를 발현하는 성인 C. 예쁜꼬마선충을 NGM RNAi 24 웰 플레이트의 각 웰내로 분리하였다. C. elegans
- 24웰을 20°C에서 7일 동안 배양한다.
참고: 이 배양 시간은 PR50 또는 GR50과 같은 독성 C9orf72 RAN 디펩티드를 발현하는 균주를 위한 것입니다. 그밖 긴장은 세균성 음식 근원 및 연속적인 기아의 고갈을 방지하기 위하여 더 짧은 배양 시간을 요구할 수 있습니다. - 라이카 AF 비디오 수집 소프트웨어(버전 2.6.0.7266)를 실행하는 Windows 호환 PC에 연결된 DFC345FX 흑백 카메라가 장착된 라이카 MZ16FA 스테레오 해부 현미경을 사용하여 전송된 광 비디오를 획득합니다.
- 웰 간의 일관된 비디오 수집 설정을 사용하여 각 RNAi 조건에 대해 두 개의 별도 우물에서 두 개의 비디오를 획득합니다. 각 동영상의 경우 18.6배 배율(AF 소프트웨어의 1.49줌 설정)을 사용하여 800 x 600 픽셀 해상도에서 10초, 초당 13.16프레임(시간 복셀 치수 = 0.076초)을 얻습니다. 이미지 노출 시간을 4밀리초로 설정합니다. 각 비디오에 스트레인, RNAi 상태 및 음량으로 즉시 레이블을 지정합니다.
- 동영상의 순서를 무작위로 지정하고 동영상 이름을 숫자로 변경하여 각 비디오 파일과 관련된 유전자형에 대한 실험자의 눈을 멀게 합니다. 이 비디오 그룹을 새 파일로 저장합니다. 분석이 완료된 후 실험자의 눈가를 돋우지 않습니다.
- 각 비디오에서 20개의 다른 동물에 대한 '이동 거리'와 각 동물의 길이를 측정하고, 각 RNAi 조건에 대해 총 ~40개의 웜을 조사합니다.
- 소프트웨어에서 추가 도구 단추를 선택한 다음 그리기 텍스트 도구를 선택합니다. 비디오의 첫 번째 프레임에서 측정되는 웜 중앙의 점을 클릭하고 숫자로 표시합니다. 웜의 이동 경로를 시각적으로 추적하면서 비디오를 끝까지 진행합니다. 마지막 프레임에서 측정중인 웜 의 중심에있는 점을 클릭하고 다음 해당 숫자를 표시합니다. 그런 다음 드로우 스케일바 도구를 사용하여 첫 번째 숫자에서 두 번째 숫자로 선을 그려 "이동거리"를 기록합니다.
- '이동 거리'는 두 중심 점 사이의 거리입니다. 이 거리는 측정 선에 인접하여 표시됩니다. 이 측정값을 스프레드시트에 기록합니다. 분석 창에서 각 개별 측정을 유지하면서 비디오의 다른 웜 19개에 대해 이 측정을 반복합니다.
- 움직임을 보이지 않는 동물의 선택을 피하고 마비쪽으로 데이터를 편향하는 것을 피하기 위해 가장 강력한 움직임을 보이는 동물의 측정을 합니다. 측정이 완료되면 모든 측정 라인을 보여주는 최종 비디오 프레임의 스냅샷을 찍어 데이터가 생성된 동물로 다시 추적될 수 있도록 합니다.
- 4개의 열 스프레드시트를 사용하여 데이터를 분석합니다. 열 1은 웜 "식별자", 열 2는 이동 거리/시간(speed)입니다.
- 각 비디오의 시간은 실험에서 비디오를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 비디오의 속성으로 이동하여 찾을 수 있습니다.
- 정량화, 다음 소프트웨어에 대한 통계를 선택하여 각 동물의 길이를 찾아 속도 측정을 정규화합니다. 비디오 디스플레이의 부호 도구 아이콘을 클릭하면 "폴리선 그리기" 도구를 사용할 수 있습니다. 그런 다음 이 도구를 사용하여 머리 끝에서 꼬리 끝까지 비디오에서 C. 예쁜 꼬마를 자유롭게 추적할 수 있습니다. 줄의 길이는 통계에 따라 기록됩니다.
- 데이터가 생성 된 동물로 다시 추적 할 수 있도록 C. 예쁜 꼬마의 크기를 조정하는 데 사용되는 폴리 라인의 모든 것을 보여주는 최종 비디오 프레임의 스냅 샷을 합니다.
- 스프레드시트에 두 개의 열을 추가하여 데이터를 분석합니다. 열 3은 "동물 길이"이고 열 4는 "정규화 속도"(속도/동물 길이)입니다. 빈 벡터 (RNAi)대사후 테스트와 단방향 ANOVA를 사용하여 정규화 된 속도 데이터를 분석합니다.
3. RAN 펩타이드의 발달 독성 측정 : 성장 분석
- ~ 30 마리의 그라비드 동물을 50 μL의 하이포아염소산염 용액 (표백제 10 mL, N NaOH 10 N NaOH 의 2.5 mL, 37.5 mL의 dH2O)으로 gfp (RNAi), (EV)RNAi 또는 (유전자 별) 6cm RNAi 플레이트로 선택하십시오.
- 24시간 후, 하이포아염소산염 용액 스폿에서 크롤링한 6개의 형질전환 자손을 저염화액 용액 처리를 행한 플레이트 상에서 RNAi 조건과 동일한 새로운 6 cm RNAi 플레이트로 이동시켰다. 이러한 자손(F1)을 20°C에서 넣어 재배하고 재현합니다.
- 24-48시간 후, 동물이 성장하고 있는 RNAi 조건과 일치하는 6 cm RNAi에 10마리의 형질전환 L4 동물을 선택합니다. 동물이 20°C 인큐베이터에서 24시간 동안 알을 펄스하도록 한다.
- 24 시간 후, 성인 동물을 제거하고 폐기. 기계식 핸드헬드 카운터를 사용하여 24시간 동안 누워 있는 알과 L1 애벌레의 수를 계산한다. 이것은 총 무리 크기입니다.
- 다음 72 시간 동안, L4 이상 단계에 도달 하는 동물의 수를 계산 합니다. 각 동물을 세면 접시에서 제거합니다.
- 총 무리 크기 에서 L4 이상 단계에 도달 하는 동물의 백분율로 "백분율 성장"을 정량화 합니다.
- 2 x 2 피셔의 정확한 테스트와 빈 벡터(RNAi)를 수행하여 백분율 성장이 통계적으로 유의한지 확인합니다. 비교를 위한 카테고리는 "성장"(72h에서 L4 이상 단계에 도달한 동물의 #) 및 "무성장"(총 무리 크기에서 L4 또는 72h의 이전 단계에 도달하는 동물의 수를 뺀 값)입니다.
4. 개발 후 RAN 펩타이드 마비 분석
- 6 cm gfp(RNAi) 플레이트에 4-6 형질 전환 L4를 배치하여 gfp(RNAi)에 근육에서 RAN 펩티드-GFP를 발현하는 통합 C. elegans 트랜스제닉 균주를 유지하고 20 °C에서 웜을 성장시다.
- 실험은 RAN 펩티드 독성에 대한 유전 적 효과를 테스트하기 위해 RNAi를 활용하는 경우, 이동 10 살없는 플레이트에서 두 개의 6cm 빈 벡터(RNAi) (마비에 대한 긍정적 인 제어, 유전 효과에 대한 부정적인 제어), gfp (RNAi) (마비에 대한 부정적인 제어, 유전자 효과에 대한 긍정적 인 제어), 유전자 별(RNAi) (성인 10)
- 돌연변이체가 RAN 펩타이드 독성에 대한 유전적 효과를 분석하는 데 사용되는 경우, 2개의 6 cm 빈 벡터(RNAi) 또는 gfp(RNAi) 플레이트 각각에 동일한 RAN 이식유전자를 발현하는 10그라비드 WT 또는 돌연변이 동물을 배치한다. empty vector 48 시간 동안 20 °C에서 벌레를 성장시다.
- 6 cm RNAi 플레이트에서 10 세트의 형질전환 L4 세트를 선택하고 각 세트를 3cm RNAi 플레이트 (즉, n = 각 유전자형에 대해 100 마리의 동물)에 놓습니다. 검소한 L4가 모두 표면적으로 정상적인 운동성을 가지고 있는지 확인합니다. 접시를 지퍼 수납 백 안에 넣어 습기를 유지합니다.
- 25°C 인큐베이터에 L4와 함께 포장된 플레이트를 놓습니다.
- 25°C 인큐베이터에서 24시간 후 동물을 제거하여 RT에서 나가는 시간을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 균주를 제거한다.
- 해부 현미경의 플레이트를 탭하여 움직임을 확인합니다. 동물이 몸 길이 보다 더 이동 하는 경우, 이동으로 동물을 계산 하 고 새로운 3 cm RNAi 플레이트에 전송. 백금 선택을 사용하여 머리 또는 꼬리에 남은 벌레를 누릅니다. 동물이 몸 길이 보다 더 이동 하는 경우, 이동으로 동물을 계산 하 고 새로운 3 cm RNAi 접시에 전송.
참고: 옮길 때 접시당 웜 10마리를 초과하지 마십시오. 분석은 나이 든 동물을 따르는 경우에만 달려 있기 때문에 새로운 RNAi 판에 자손을 이동하지 않도록주의하십시오. - 몸 길이 이상의 움직임을 쉽게 감지할 수 있도록 모든 움직이지 않는 웜을 그룹화합니다. 동물에게 1분 이상 몸길이를 이동하도록 하십시오. 여전히 움직이지 않으면 마비되거나, 포장되거나(즉, 애벌레가 어머니 안에서 부화됨) 또는 죽은 것입니다.
- 포장을 전시 하는 검열 동물, 접시의 측면에 담 착 질, 전시 압출 창 자, 굴, 분실, 또는 탐지 시 분석에서 죽는다. 마비 된 벌레는 계산되고, 오래된 RNAi 접시에 남아 있으며, 폐기됩니다.
- 단계 4.6-4.9에 설명된 대로 5-7 일 동안 매일 마비에 대 한 동물 점수.
- 수명을 분석하는 데 사용된 것과 동일한 로그 랭크 테스트를 사용하여 마비 데이터를 분석합니다. 이 통계 분석에서 움직이는 벌레는 "살아있는"으로 채점되고, 마비 된 벌레는 "죽은"으로 채점되며, 죽은, 짐, 창자 압출, 건조, 잠복 또는 잃어버린 벌레는 "검열"로 채점됩니다.
참고: 이 분석에서 "백분율"숫자는 "움직이는 백분율" 동물을 나타냅니다. 역은 "마비 퍼센트"를 나타냅니다. 온라인 분석 도구 인 OASIS(https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)를사용하여 로그 랭크 통계 분석을 수행합니다.
5. 신경 병리학 측정 : 커미셔너 분석
- unc-47 프로모터를 사용하여 GABAergic 뉴런에 관심있는 RAN 펩티드를 발현하는 형질전환 C. 철충을 생성한다. 또한 표현 unc-47p::GFP 또는 unc-47p::RFP GABA 뉴런의 세포 형태를 공개.
- 50마리의 형질전환 L4 동물을 선택하고 24시간 동안 25°C에서 6cm OP50 플레이트에 놓습니다.
- 50마리의 형질전환 동물을 24시간 동안 25°C에서 새로운 6 cm OP50 플레이트에 옮김.
- 넓은 필드 현미경 검사법에서 동물을 이미징을위한 아가로즈 패드를 확인합니다.
- 두 개의 현미경 슬라이드 위에 두 개의 테이프를 놓습니다. 두 개의 테이핑된 슬라이드 중간에 테이프 없이 청소된 슬라이드를 놓습니다.
- 일회용 멸균 전달 파이펫으로 중간 슬라이드에 3 % 용융 된 아가로스의 ~ 100 μL (일회용 플라스틱 파스퇴르 파이펫에서 1 방울)를 분배하십시오.
- 즉시 녹은 아가로즈 의 방울을 가로 질러 두 번째 깨끗한 슬라이드를 배치하여 테이핑 된 슬라이드에 놓고 슬라이드 사이에 얇고 균일 한 아가로즈 층을 만듭니다.
- 아가로즈가 냉각되고 응고된 후, 두 개의 슬라이드를 분리하지 않고 분리하지 않고 아가로오스 층으로 조심스럽게 제거하고 그 아래에 젖은 종이조각으로 비닐 봉지에 넣습니다. 웜 10개당 하나의 슬라이드를 세 개의 추가 슬라이드와 함께 검사합니다.
- 25°C 인큐베이터에서 형질전환 C. 예쁜꼬마선충을 제거하고 C. elegans 100 μL 의 강하로 100 μL 드롭으로 유리 우울증 슬라이드를 선택합니다. 10 분 동안 또는 동물이 마비 될 때까지 배양하십시오.
- 비닐 봉지에서 슬라이드 쌍을 제거하고 조심스럽게 분리하십시오. 유전자형으로 아가로즈로 슬라이드에 라벨을 붙이고 아가로스 의 중간에 10 mM 레바미솔 2 μL을 추가합니다. 10마리의 동물을 아가로즈 패드의 레바미솔에 옮기입니다. #1 두께 의 커버 슬립으로 동물을 커버.
- 외음부방향이 동물의 오른쪽에 있는 이미지 동물. 외음부가 머리의 왼쪽에 있는 경우에, 모터 뉴런의 통신은 동물의 밑에 있고 명확하게 보이지 않을 것입니다, 정확한 정량화를 어렵게 만드는. 이 동물들로부터 정량화를 생략한다. 이 방향에서, 모터 뉴런의 통신은 커버 슬립에 가장 가깝고 거꾸로 된 광시야 형광 현미경에서 명확하게 볼 수 있습니다. 63X 1.4X NA 오일 침지 렌즈와 라이카 L5 GFP 필터 세트(Ex480/40nm)로 IICA DMI4000B 반전 광시야 형광 현미경으로 GFP를 표현하는 뉴런 커미션을 시각화합니다. Em527/30nm). 뉴런 커미셔너가 GFP 대신 RFP를 발현하는 경우 라이카 TX2 RFP 필터 세트를 활용하십시오(Ex560/40nm; Em645/75nm).
- 63x 1.4x NA 오일 침지 렌즈와 GFP 필터 세트(Ex480/40 nm)로 반전된 광시야 형광 현미경으로 GFP를 표현하는 뉴런 커미션을 시각화합니다. Em527/30 nm). 뉴런 이GFP 대신 RFP를 발현하는 경우, 적색 형광 단백질(RFP) 필터 세트(Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
- 고정으로 인한 독성을 최소화하기 위해 벌레에 덮개를 놓은 후 45분 이내에 웜을 이미지화합니다.
- 각 웜에 대해 표시되는 커밋 수를 계산합니다. 야생형 동물에는 16개의 눈에 보이는 커미션이 있습니다. 또한 커미션에 큰 구슬(즉, blebs)이 있는 커미션의 수와 깨진 커미셔클의 수를 계산합니다. 커미셔너가 파손되었는지 확인하려면 초점 평면을 조정하여 등대 코드에서 복부 코드로 의한 커미셔스를 따르십시오.
참고 : unc-47p ::GFP 형광이 갭을 나타내는 커미션은 깨진 것으로 간주됩니다. 깨진 커밋은 일반적으로 휴식의 양쪽에 흠이 있으며, 이는 커밋이 끊어졌음을 보여주는 데 도움이 됩니다. 20개의 웜에 대한 번잡과 파손의 양을 계산합니다. - 각 동물에 대한 관찰 된 커미션의 총 수를 통해 bb또는 나누기와 통신의 분율을 계산합니다. 동물당 계산된 절대 수(야생 유형, 블리브 및 깨진 이벤트 포함)도 측정할 수 있습니다.
- 각 범주에 대해 평균 ± SD를 계산하고 두 모집단 간의 비교를 위해 학생의 t 검정을 사용하여 통계적으로 분석하거나 3개 이상의 모집단 간의 비교를 위한 단방향 ANOVA를 사용하여 분석합니다.
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Representative Results
우리는G4C2 반복 확장을 가진 ALS 환자에서 발견되는 RAN 디펩티드의 독성에 대한 상이한 유전자 억제의 효과를 평가하기 위하여 여기에서 기술된 분석을 이용했습니다. 성장 분석기를 사용하여 발달 독성을 측정하고, 근육 발현 PR50-GFP 독성의 게놈 전체 RNAi 스크린 억제기에서 확인된 몇몇 유전 녹아웃 돌연변이체의 효과를 분석했습니다. PR50-GFP의 발현만으로도 완전히 침투성 성장체포를 초래한 반면, 여러 유전자에서 기능 돌연변이의 손실은 PR 발달 독성을 12-94%(도1A)에서억제하였다.
또한 영상 속도 분석 방법을 사용하여 PR50 발현 동물의 발달 운동성에 대한 특정 유전자 녹다운의 효과를 측정했습니다. 예상대로, gfp(RNAi)는 PR50-GFP 발현의 저해로 인한 빈 벡터(RNAi)에 비해 운동성에서 큰 증가를 초래하였다. 우리는 또한 프로테아좀 서브유닛 rpn-7에 대하여 RNAi가 PR50 운동성에 있는 중요한 증가 귀착되었다는 것을 것을을 발견했습니다(그림 1B).
ALS는 많은 신경 퇴행성 질환과 마찬가지로 성인에서 발생합니다. 따라서, 연령 의존적 마비 분석등을 사용하여 성인 표현형을 분석했습니다. PR50-GFP는 5일까지 최대 80%의 마비를 나타냈다. 그러나, RNAi는 유전자 cul-6에 지시하여 현저하게 지연된 마비를, 컬-6가 PR50-GFP 독성을 위해 필요하다는 것을 시사한다(도1C). 이 효과는 컬-1(RNAi)이 PR50-GFP 독성을 변화시키지 않았기 때문에 컬6(RNAi)에 특이적이었다.
독성 RAN 펩티드와 같은 신경 퇴행성 단백질은 일반적으로 C. elegans4,20,,,21,,22의신체 벽에 모델링됩니다. 그러나, RAN 단백질이 C. elegans 뉴런에서 표현될 때 신경병리학을 일으키는 원인이 되는지 결정하는 것이 또한 중요합니다, 신경 특이적 독성은 많은 신경 퇴행성 질병의 일반적인 특징이기 때문에. 우리는 통신 분석을 사용하여 신경 특이적 독성을 조사했습니다. 2일째성인, 운동 뉴런에서의 PR50-GFP 발현은 운동 뉴런 블리핑의 현저한 증가를 이끌었다. 이러한 신경병리학은 여러 신경퇴행성 단백질의 독성 특성을 지연시키는 인슐린/IGF 수용체 유전자 상동단 daf-2의 돌연변이에 의해 유의하게억제되었다(도 2B).
도 1: 근육 발현 RAN 펩티드의 독성을 평가하기 위한 시술. (A)RAN 펩타이드 성장 분석. 표시된 돌연변이체는 gfp(RNAi) 조건 하에서 drIs34(myo-3p::PR50-GFP) 유전적 배경을 교차하였다. drIs34 myo-3p::PR50-GFP 각 유전자형 위의 숫자는 성장을 위해 득점 된 자손의 수를 나타냅니다. 모든 유전자형은 야생 형에 비해 피셔의 정확한 테스트를 사용하여 p < 0.05를 가지고 있습니다. (B)개발 중 RAN 펩타이드 독성을 측정하기 위한 비디오 속도 분석. drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) 동물은 gfp (RNAi), 빈 벡터 (RNAi)또는 rpn-7 (RNAi) 조건 하에서 성장한 다음 설명된 바와 같이 운동성을 위해 득점하였다. 속도는 gfp(RNAi) 처리된 동물로 정규화하였다. 도시된 데이터는 각 유전자형에 대해 평균 ± SD, n = 40입니다. **-p < 0.01, ***- p & 0.001, 투키 사후 테스트와 편도 ANOVA. (C)마비 분석은 나이 발병 독성을 측정합니다. drIs34(myo-3p::P R50-GFP) 동물은 빈 벡터(RNAi)('WT'), 컬-1(RNAi)또는 컬-6(RNAi) 및 마비를 매 24h로 채점하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 운동 뉴런의 신경병리학을 측정하기 위한 분석은 RAN 펩티드를 발현한다. (A) unc-47p를 표현하는 성인 C. 예쁜꼬마선충의 이미지::GFP 모터 뉴런 리포터야생형 또는 unc-47p::PR50-GFP 표현 동물. 야생 유형에 대한 이미지는 정상적인 커미셔스 형태를 보여줍니다. 이미지는 광시야 형광 현미경 검사법에 의해 얻어진 평평한 Z 시리즈 스택을 나타냅니다. PR50 동물은 파손 및 출혈의 예를 보여줍니다. (B)PR50 커미션 블링에 daf-2 (e1370)의 효과. 포인트는 평균과 SD가 표시된 단일 동물의 백분율 블레빙 커밋을 나타냅니다. n = 유전자형당 20마리의 동물 **-p< 0.01, 던의 사후 검사를 통해 편도 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 근육또는 C. elegans의신경에서 모델링된 RAN 펩티드 독성을 분석하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보고합니다. 신경 퇴행성 단백질은 인간 환자에서 나이 개시 표현형을 가지고 있는 동안, 그(것)들은 또한 모형 시스템에서 과발현될 때 발달 독성을 전시할 수 있습니다. 과발현은 유의한 해석적 한계를 가지고 있지만, 독성 표현형을 역전시킬 수 있는 유전자 또는 약물을 식별하기 위한 유전적 또는 약리학적 스크린을 위한 강력한 출발점을 제공한다. 이는 질병의 가장 정밀한 동물 모델이24,,25,,26에대한 편견 없는 스크리닝 접근법에 적합하지 않은 표현형 또는 약한 표현형이 없다는 점을 감안할 때 특히 중요하다. 우리의 C. elegans RAN 펩티드 모형 및 애약은 이 새로 기술된 단백질의 독성을 위해 중요한 세포 통로를 이해하기 위한 효모 와 Drosophila와같은 그밖 RAN 펩티드 모형 시스템에 강력하고 상보적인 접근을 나타냅니다.
근육 발현 RAN 펩티드의 조건부 독성
RAN 펩티드 독성을 측정하려면 gfp(RNAi)의효과를 제거하기 위한 추적 기간이 필요합니다. 그러나, gfp (RNAi)에서 제거와 표현형의 출현 사이의 시간은 정확하게 실험의 개시, 단계동물의 선택, 온도 변화, 기타 시간을 촬영하지 않는 경우 일관성이 있을 수 있습니다. 우리가 이 assays로 더 많은 경험이 될 때, RAN 펩티드 표현형의 타이밍 그리고 침투는 상대적으로 일관되게 되었습니다. 이 어설수에서 가장 중요한 단계 중 하나는 25 °C로 동물의 적절한 이동이다. 이러한 변화없이, RAN 펩티드는 상당히 약한 독성을 나타낸다. 그러나, 동물은 RAN 펩티드의 더 높은 기준선 발현으로 인해 성장하고 재생되지 않기 때문에 25°C에서 지속적으로 성장할 수 없다. 이는 독성 RAN 펩티드를 발현하는 균주가 허용 조건(즉, 저온)에서 유지되지만 펩티드 발현을 향상시키기 위해분석13,,15 이전에 제한적인 조건(즉, 더 높은 온도)으로 급격하게 이동하는 효모 또는 드로소필라의 상황과 는 다르지 않다. 이러한 조건부 발현 시스템에서, 독성을 강화하거나 억제하는 유전적 조건은 펩티드 발현 수준의 변화로부터 발생할 수 있다. RAN 펩티드 독성의 유전 적 수정자가 이식 유전자 발현 수준에서 변경을 통해 작용하는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 두 가지 접근법을 취합니다. 첫째, 우리의 형질전환 균주의 대부분은 RAN 펩티드의 발현을 유도하는 데 사용되는 동일한 프로모터의 제어하에 제2 RFP 리포터를 발현한다. RAN 펩티드 발현을 감소 또는 증가시키는 프로모터 활성의 변화는 RFP 수준에서 유사한 감소 또는 증가를 야기한다. 우리는 RFP 수준을 현저하게 변화시키는 돌연변이 또는 RNAi 조건을 비특이적으로 작용하는 것으로 간주합니다. 둘째, 우리는 RAN 펩티드 mRNA 또는 단백질의 수준이 조건 사이에서 변경되는지 결정하기 위하여 양적 PCR 및 서쪽 blotting를 능력을 발휘합니다. 그러나, RAN 펩티드의 서양 기반 검출은 때때로 어렵거나 불가능한 증명할 수 있습니다, 우리와 다른 사람은 C9orf72 유래 RAN 펩티드 PR50-GFP로 관찰한 바와 같이. 이러한 경우에, 우리는 비교되는 조건 사이에서 단백질 발현이 변경되는지 결정하기 위하여 생체 내 GFP 수준에서 정량화합니다.
발달 독성: 장점 및 한계
근육에 있는 유독한 RAN 펩티드의 강제적인 과발현은 수시로 C. elegans에있는 발달 체포로 이끌어 냅니다. 이것은 명백하게 인간 적인 질병 병리학을 모방하지 않는 동안, RAN 독성 억제제가 gfp (RNAi)의부재에서 성장하고 재생산하는 동물로 쉽게 확인되기 때문에, 유전 억제기 스크린을 위한 강력한 출발점을 제공한다. 일부 억제제는 이식 유전자 발현의 감소로 인해 성장을 촉진할 것이다. 이러한 가능성을 구별하기 위해, 우리는 일반적으로 우리의 RAN 펩티드 트랜스제닉 균주에서 동일한 프로모터에 의해 구동되는 두 번째 RFP 리포터를 포함한다. 이식 유전자 발현을 감소 또는 무음으로 하는 서프레서도 감소된 RFP 발현 수준을 나타낼 것이다. 다른 한편으로는, 정상 또는 높은 RFP 수준을 나타내는 억제제는 이식 유전자 발현의 감소를 통해 작동하기 위하여 확률이 낮습니다. 효모 성장 또는 Drosophila 눈형태13,15,,27의사용과 마찬가지로, 이러한 접근법은 인간에서 질병의 양상을 정확하게 모델링하지 는 않지만, RAN 펩티드 개질제의 초기 식별을 위한 강력한 스크리닝 도구를 제공한다.,
개발 후 독성 (마비 분석) : 장점과 한계
마비 분석의 장점은 상대적으로 많은 수의 동물 (50-100)이 모든 웜 실험실에 존재하는 도구로 측정 될 수 있다는 것입니다. 마비는 또한 쉽게 검출되는 가혹한 표현형입니다. 이 분석의 주요 한계는 완전한 마비를 일으키지 않는 운동 결함에 민감하지 않다는 것입니다. 이러한 결함은 스래싱 분석또는 운동학 운동 분석법28과같은 측정에 보다 민감하고 정량적인 접근법을 요구할 수 있다. 마비 분석은 가능하면 유전자형에 눈을 멀게 하고 벌레가 다른 유형의 스트레스(예: 오염, 기아)를 겪지 않도록 주의를 기울여야 하며, 이는 분석 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 독성 RAN 펩티드를 발현하는 C. 예쁜꼬마선충은 때때로 강력한 마비 표현형을 나타내지 못한다. 이는 RAN 펩티드 발현을 억제하는 gfp(RNAi)의 지속적인 효과 때문일 가능성이 있다. 이러한 경우, 우리는 상당한 마비를 준수하지 않는 경우 (>10%) 빈 벡터(RNAi) 대조군 동물 2일째부터, 우리는 전형적으로 분석구를 종료하고 또 다른 복제를 시작한다. 이러한 분석법의 한 가지 변형은 대체 유도성 RAN 펩티드 발현 시스템의 사용을 수반할 수 있었다. C. elegans를 위한 유일하게 일반적으로 사용되는 유도성 발현 시스템은 열 충격 프로모터입니다. 그러나, 필요한 열 충격은 단백질의 독성에 영향을 미칠 수 있는 응력 반응을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 보조 유도성 다투기(AID)시스템(29)과같은 다른 조건부 발현 시스템의 향후 적용은 RAN 펩티드 독성을 연구하는 우리의 능력을 크게 향상시킬 수 있다.
신경 변성/커미셔스 분석: 장점 및 한계
C. elegans에 있는 모터 신경 통신은 복부와 등등 신경 코드 사이통과하는 1개의 모터 신경신경의 축세포를 나타냅니다. 탈취 및 파손은 분리된 커미션에서 쉽게 검출될 수 있으며, 신경 변성은 살아있는 동물에서 신속하게 정량화될 수있습니다(그림 2). 동물을 검사하는 동안, 이것은 어떤 독성 RAN 펩티드가 없는 상태에서 신경 출혈 및 파손으로 이끌어 내는 조기 동물 죽음을 일으키는 원인이 될 수 있기 때문에 장기간 levamisole에서 배양하지 않는 것이 중요합니다. 어떤 경우에는 커밋이 완전히 퇴화되어 더 이상 보이지 않습니다. 따라서, 우리의 분석이 관찰 된 통신의 총 수에서 깨지거나 출혈하는 커미션의 비율을 측정하기 때문에 신경 병리학 적 특징에 대해 점수를 매길 수 없습니다. 이러한 경우, commissure 분석은 RAN 펩티드의 효과를 과소평가할 수 있다.
결론적으로, 이 논문에 기술된 측정은 C. elegans에있는 RAN 펩티드에 기인한 독성을 측정하기 위해 유용합니다. gfp (RNAi)를 사용하여 단백질의 발현을 조절하면 개발 후 표현형이 관찰 될 수 있습니다. 우리의 접근은 쉽게 억제기 또는 독성의 강화를 위한 대규모 유전 스크린을 능력을 발휘하기 위하여 적응될 수 있습니다. 마비 분석 및 commissure 분석과 같은 이차 분석실험은 독성이 개발 후 억제되는 것을 확인할 수 있으며 억제 메커니즘이 뉴런에서 보존되는지 테스트할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
NIH R21NS107797
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
References
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